艾納香中艾納香素的提取工藝優(yōu)化及抗菌消炎活性評價Δ

齊維金，劉瑞秀，潘淑娟，何賢芳，王鴻穎，王 魯（1.貴州大學藥學院，貴陽 550025；2.貴州大學西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴陽 550025）

艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.為菊科艾納香屬植物，具有抗腫瘤、抗氧化、消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[1]，在苗族、黎族、壯族等少數民族地區(qū)有著悠久的用藥歷史，是一種重要的民族藥。種植戶常用水蒸氣蒸餾法提取艾納香中的“艾片”和“艾油”，剩下的水溶性物質及藥渣常被作為廢棄物丟棄，但其廢棄物中包含具有抗腫瘤、抗血栓等藥理活性的黃酮類成分[2—3]。艾納香素是艾納香中一種重要的黃酮類化合物，能夠對實驗性肝損傷起保護作用，對口腔癌細胞及肥大細胞活化脫顆粒反應均存在有效的抑制作用[4—5]。但艾納香素作為艾納香的主要活性成分之一，是否具有艾納香那樣良好的抗菌消炎活性目前尚不得知。據文獻報道，艾納香中艾納香素的含量最高可達2.60 mg/g[6]，但艾納香素的提取工藝研究較少，導致其價格昂貴，從而阻礙了艾納香素的開發(fā)。因此，本研究采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化從艾納香中提取艾納香素的工藝，并通過體內外實驗評價艾納香素的抗菌消炎活性，以期為艾納香的合理利用（包括其提取廢棄物的回收利用）、新型抗菌消炎藥物的研發(fā)，以及進一步實現艾納香素的工業(yè)化生產提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）、SW-CJ-ID型單人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、ZQLY-180N型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、AR1530/C 型電子分析天平（美國Ohaus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

艾納香莖葉購自貴州羅甸縣種植戶，經貴州大學植物物種鑒定中心王華磊教授鑒定為艾納香B. balsamifera（L.） DC.原植物[鑒定號2018（033）]；艾納香素標準品（用于HPLC 和核磁共振-質譜鑒定，批號20052223，純度＞98%）購自上海同田生物技術有限公司；艾納香素（用于抗菌消炎活性檢測，純度＞98%）由貴州省生化工程中心自提；地塞米松（批號201112，純度99.3%）購自浙江仙琚制藥有限公司；頭孢呋辛鈉（批號20220804，純度99.25%）購自北京索萊寶科技有限公司；化膿鏈球菌（ATCC 19615）、金黃色葡萄球菌（ATCC 13565）、無乳鏈球菌（ATCC 13813）、變異鏈球菌（ATCC 25175）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、藤黃微球菌（ATCC 7468）均購自中國食品藥品檢定研究院；10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯（批號200226）購自上海博微生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 實驗動物

SPF 級昆明小鼠200 只，雌雄各半，體重（20±2） g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010。本實驗經貴州大學實驗動物倫理分委員會審核批準（倫理批件號為EAE-GZU-2021-T018）。

2 方法與結果

2.1 艾納香素的含量測定

2.1.1 溶液的制備

精密稱取艾納香素標準品適量，以甲醇配制成質量濃度為78 μg/mL 的艾納香素標準品溶液。精密稱取艾納香干燥莖葉粉末，經超聲提取2 h（提取溫度40 ℃、功率180 W、頻率40 kHz）后過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（60∶40，V/V）；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL/min；檢測波長為290 nm；進樣量為10 μL。在該色譜條件下，標準品和供試品溶液中艾納香素的保留時間約為11.30 min，其HPLC圖見圖1（空白對照的圖譜略）。

圖1 艾納香素標準品溶液和供試品溶液的HPLC圖

2.1.3 線性關系考察

精密吸取艾納香素標準品溶液4、8、12、16、20 μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝449.89X—138.96（R2＝0.998 0）。結果表明，艾納香素的進樣量在0.31～1.56 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取同一批供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為0.75%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復性試驗

取艾納香干燥莖葉粉末，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，以外標法計算樣品含量。結果顯示，樣品平均含量的RSD為1.66%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液，分別于室溫（25 ℃）放置0、4、8、12、24、48 h 后，按“2.1.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD 為0.94%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密量取已知樣品含量的同一批供試品溶液9 份，分為3 組，分別加入0.1、0.2、0.4 mL 艾納香素標準品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，以外標法計算樣品含量，并計算加樣回收率。結果顯示，艾納香素的平均加樣回收率分別為99.52%、101.02%、101.21%，RSD 分別為0.83%、1.22%、1.15%（n＝3），表明方法準確度良好。

2.2 提取工藝的單因素實驗

2.2.1 提取溶劑的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，按液料比10∶1（mL/g）分別加入甲醇、95%乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯，選擇提取溫度為提取溶劑沸點值，回流提取2 h，考察不同提取溶劑對艾納香素得率的影響。結果顯示，艾納香素的得率分別為1.70、1.68、0.51、0.49 mg/g。綜合考慮艾納香素得率和環(huán)保因素，最終選擇95%乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取時間的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，按液料比10∶1（mL/g）加入95%乙醇，于80 ℃分別回流提取1、2、3、4、5、6 h，考察不同提取時間對艾納香素得率的影響。結果顯示，艾納香素的得率分別為1.36、1.55、1.50、1.47、1.42、1.37 mg/g，以提取2 h的得率最高，故選擇提取時間為2 h。結果見圖2A。

圖2 提取時間、乙醇體積分數、液料比對艾納香素得率的影響

2.2.3 乙醇體積分數的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，按液料比10∶1（mL/g）分別加入體積分數為30%、50%、70%、90%、95%的乙醇，于80 ℃回流提取2 h，考察不同體積分數乙醇對艾納香素得率的影響。結果顯示，艾納香素的得率分別為0.61、1.14、1.25、1.69、1.51 mg/g，以90%乙醇提取的得率最高，故選擇乙醇體積分數為90%。結果見圖2B。

2.2.4 液料比的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，分別按液料比10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1（mL/g）加入95%乙醇，于80 ℃回流提取2 h，考察不同液料比對艾納香素得率的影響。結果顯示，艾納香素的得率分別為1.51、1.68、1.72、1.90、1.73、1.42 mg/g，以液料比16∶1（mL/g）的得率最高，故選取液料比為16∶1（mL/g）。結果見圖2C。

2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化艾納香素提取工藝

2.3.1 響應面實驗的設計及結果

通過單因素實驗結果，選擇乙醇體積分數（A）、提取時間（B）和液料比（C）作為艾納香素提取工藝優(yōu)化的因素，設計合適的因素與水平（表1），并以艾納香素的得率為響應值（R），利用Box-Behnken Design原理通過Design-Expert 8.0.6 軟件設計響應面實驗，共進行了17 組實驗，結果見表2。用二階多項式回歸模型預測響應值，得到二次多項表達式R＝1.94+0.145A+0.002 5B—0.002 5C+0.02AB—0.01BC—0.152A2—0.052B2—0.102C2。對 回歸方程進行方差分析，得回歸模型的F值為39.615 0，差異顯著（P＜0.01）；失擬項（P＞0.05）不顯著；模型的相關系數R2＝0.98，大于0.9，說明該實驗模型與實際實驗的相關性較好，可真實反映所考察因素對響應值的影響。結果見表3。

表1 艾納香素提取工藝響應面實驗的因素與水平

表2 艾納香素提取工藝響應面實驗的設計與結果

表3 艾納香素提取工藝響應面實驗的方差分析結果

通過Design-Expert 8.0.6 軟件繪制各因素的響應面圖及等高線圖（圖3），并結合方差分析結果進行分析，可得各因素對艾納香素得率影響的強弱順序為：A＞C＞B，即乙醇體積分數＞液料比＞提取時間；同時預測艾納香素的最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分數89.80%，液料比15.17∶1，以80 ℃回流提取2.02 h。為了便于實際操作，本研究對預測的最優(yōu)提取工藝進行了微調，即得乙醇體積分數90%，液料比15∶1，以80 ℃回流提取2 h；在此條件下，預測艾納香素的得率為1.98 mg/g。

圖3 各因素交互作用對艾納香素得率影響的等高線及響應面圖

2.3.2 驗證實驗

取艾納香干燥莖葉粉末40 g，按上述最優(yōu)提取工藝平行操作3次進行驗證實驗，所得艾納香素的得率分別為1.95、1.96、2.00 mg/g，平均得率為1.97 mg/g（RSD＝1.34%），與預測值基本相符，說明提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 艾納香素的體外抗菌活性考察

采用微量稀釋法進行抗菌活性考察[7]。取艾納香素（自提）與頭孢呋辛鈉（陽性對照）以10%二甲基亞砜溶解配制為適宜濃度梯度的溶液，分別取稀釋好的化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、變異鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌的菌液180 μL與藥液20 μL加入96 孔板中，菌液終濃度為105CFU/mL，藥物終濃度為1.56～1 600 μg/mL；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，裸眼觀察，以孔內液體澄清無沉淀的最小質量濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。選擇艾納香素MIC 值較小的化膿鏈球菌與金黃色葡萄球菌測定最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），即取上述兩種菌2MIC、4MIC、8MIC質量濃度的孔內液體接種于瓊脂平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以平板內菌落個數小于4 的最小質量濃度為MBC。結果見表4。

表4 艾納香素體外抗菌活性考察結果（μg/mL）

由表4可知，上述幾種菌株對艾納香素的敏感度為：化膿鏈球菌＞金黃色葡萄球菌＞無乳鏈球菌＝變異鏈球菌＞枯草芽孢桿菌＞藤黃微球菌；其中，艾納香素對化膿鏈球菌的MIC值達50 μg/mL，僅比頭孢呋辛鈉對化膿鏈球菌的MIC值高37.50 μg/mL。

2.5 艾納香素的消炎活性評價

2.5.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

將50 只昆明小鼠隨機分為5 組，即陽性對照組（地塞米松，10 mg/kg），空白對照組，艾納香素（自提）低、中、高劑量組（7.5、15、30 mg/kg），每組10只。各給藥組按上述劑量腹腔注射給藥，空白對照組給予等量生理鹽水。在給藥5 h 后，每只小鼠右耳涂抹30 μL 二甲苯致炎，左耳不涂任何藥物。30 min 后處死小鼠，以6 mm 打孔器打下耳片并稱重，以左右耳片的差值為耳廓腫脹度[8]，并計算腫脹抑制率：腫脹抑制率（%）＝（空白對照組平均耳廓腫脹度—藥物組平均耳廓腫脹度）/空白對照組平均耳廓腫脹度×100%。平行2次實驗。

結果顯示，與空白對照組比較，陽性對照組和艾納香素各劑量組小鼠的耳廓腫脹度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），但隨著艾納香素劑量的升高，其腫脹抑制率反而下降。與陽性對照組比較，艾納香素中、高劑量組小鼠的耳廓腫脹度均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表5。

表5 艾納香素對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹影響的結果（±s，n＝10）

表5 艾納香素對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹影響的結果（±s，n＝10）

—：無相應數據；a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與陽性對照組比較，P＜0.05；c：與空白對照組比較，P＜0.05；d：與陽性對照組比較，P＜0.01。

組別空白對照組陽性對照組艾納香素低劑量組艾納香素中劑量組艾納香素高劑量組腫脹度/mg 7.28±2.99 1.27±0.89a 1.82±0.61a 3.44±1.25ab 5.10±1.38cd腫脹抑制率/%—82.92 75.03 52.69 29.94

2.5.2 對醋酸所致小鼠毛細血管通透性的影響

取50只昆明小鼠，分組及給藥同“2.5.1”項下。在給藥5 h后，于小鼠尾靜脈注入0.5%伊文思藍生理鹽水溶液10 mL/kg，腹腔注射0.6%醋酸生理鹽水溶液0.20 mL，20 min 后處死小鼠，開腹用生理鹽水洗滌腹腔，收集洗滌液后加入生理鹽水至10 mL，以2 000 r/min 離心15 min，取上清液用酶標儀在590 nm波長處檢測吸光度（A）值[8]，并計算各組小鼠腹腔毛細血管通透性的抑制率：抑制率（%）＝（空白對照組的平均A值—藥物組的平均A值）/空白對照組的平均A值×100%。平行2 次實驗。

結果顯示，與空白對照組比較，陽性對照組和艾納香素各劑量組小鼠的A值均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），但隨著艾納香素劑量的升高，其抑制率反而下降。與陽性對照組比較，艾納香素高劑量組小鼠的A值顯著升高（P＜0.01），其抑制率降低。結果見表6。

表6 艾納香素對醋酸所致小鼠毛細血管通透性影響的結果（±s，n＝10）

表6 艾納香素對醋酸所致小鼠毛細血管通透性影響的結果（±s，n＝10）

—：無相應數據；a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05；c：與陽性對照組比較，P＜0.01。

組別空白對照組陽性對照組艾納香素低劑量組艾納香素中劑量組艾納香素高劑量組A值（×10）3.44±1.16 1.07±0.68a 1.32±0.84a 1.75±0.64a 2.47±0.99bc抑制率/%—68.94 61.64 49.09 28.32

3 討論

目前艾納香中已發(fā)現的活性成分超過140 種[9]，除揮發(fā)性成分外，黃酮類化合物艾納香素也有很好的生物活性，具有一定的開發(fā)潛力。對艾納香素的提取與純化，目前報道的研究主要圍繞純化方式，而少見提取工藝研究。由于天然產物都是先提取再純化，因此艾納香素提取工藝的優(yōu)化研究對其工業(yè)化生產具有重要意義?；诖?，本研究以艾納香素得率為考察指標，在單因素實驗的基礎上采用Box-Behnken 響應面法進行優(yōu)化，得到提取艾納香素的最優(yōu)工藝為：乙醇體積分數90%，液料比15∶1，以80 ℃回流提取2 h。驗證實驗表明優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可靠、重復性好。本研究受限于植物儲存量，并未進行更大規(guī)模的研究，這也是本研究的不足之處；若該工藝進行中試實驗，可能需要進一步調試參數。但該工藝將為艾納香素的進一步分離純化提供良好的物質基礎，也可為其工業(yè)化生產提供參考數據。

本研究為探討艾納香素是否存在抗菌消炎活性，采用體外抗菌實驗及動物炎癥模型進行了評價。大多數天然產物對細菌的MIC值都很大，有的甚至達到了mg/mL級別[10]。本研究發(fā)現，艾納香素對化膿鏈球菌具有一定的抗菌活性，其MIC為50.00 μg/mL，僅比陽性對照頭孢呋辛鈉的MIC值高37.5 μg/mL，因此值得被進一步開發(fā)成抗菌藥物。另外，在艾納香素消炎活性的考察中，艾納香素只進行了1次腹腔注射給藥，結果就具有良好的消炎活性；但值得注意的是，艾納香素存在消炎活性與劑量呈負相關的現象。對此，本研究對更低劑量的艾納香素（3.75 mg/kg）進行了小試，發(fā)現該劑量的艾納香素不具有消炎活性，故推測可能存在高劑量艾納香素影響體內吸收的情況，這也是未來進一步研究的方向。一定量的艾納香素與陽性對照地塞米松的作用并無顯著差異，這將為艾納香素的藥理學研究提供實驗數據，也說明艾納香素在臨床上替代激素類消炎藥存在可能性。

綜上所述，本研究優(yōu)化所得的艾納香素提取工藝穩(wěn)定可行；所提取的艾納香素對化膿鏈球菌具有一定的抗菌活性，且具有良好的消炎活性。