不同類型飲用水污染情況及微生物群落結(jié)構(gòu)特征分析

崔若琪，白淼，，張玲悅，江海溶，張燦，張傳福，張明露*

（1.北京工商大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，北京 100048；2.中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100071；3.北京鐵路疾病預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100020）

飲用水水質(zhì)與人類健康密切相關(guān)。目前城市居民的飲水大多來(lái)自市政供水，少數(shù)郊區(qū)居民仍采用自備井水。市政供水水質(zhì)除了受到出廠水的影響，管網(wǎng)輸水及水箱儲(chǔ)存過程也會(huì)產(chǎn)生污染；自備井水則會(huì)受到當(dāng)?shù)氐刭|(zhì)、人為污染等因素影響[1]。隨著城鎮(zhèn)化的發(fā)展以及居民對(duì)飲用水品質(zhì)需求的與日俱增，微生物污染成為十分重要的飲水安全問題。致病微生物在水中長(zhǎng)期存在并大量繁殖，其致病毒力因子可以在水中擴(kuò)散傳播，直接影響人體健康。

微生物學(xué)指標(biāo)是目前用于飲用水生物性污染評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，也是流行病學(xué)中水質(zhì)安全的保障[2]。根據(jù)GB 5749—2022《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，水質(zhì)微生物指標(biāo)包括總大腸菌群、大腸埃希氏菌以及菌落總數(shù)。此外，微生物群落的豐度和多樣性受水體環(huán)境的直接影響，一定程度上反映了水生態(tài)系統(tǒng)的健康情況[3-5]。對(duì)飲用水中微生物群落進(jìn)行解析，既能評(píng)估微生物群落的多樣性，又能識(shí)別公共衛(wèi)生關(guān)注的微生物類群，更好地評(píng)估飲用水的微生物安全性，從而評(píng)估大規(guī)模介水傳染病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[6]?，F(xiàn)有研究主要集中在飲用水水質(zhì)指標(biāo)監(jiān)測(cè)方面，對(duì)于飲用水微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少。本文為了解水質(zhì)指標(biāo)、微生物污染情況和群落結(jié)構(gòu)在不同類型飲用水中的變化特征及相關(guān)性，對(duì)城市城區(qū)管網(wǎng)末梢水、樓宇水箱水和城市郊區(qū)自備井水進(jìn)行采樣，測(cè)定理化指標(biāo)以及微生物群落結(jié)構(gòu)，以期為更好地保障居民飲用水健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)與水樣收集

針對(duì)城市城區(qū)管網(wǎng)末梢水、樓宇水箱水和城市郊區(qū)自備井水3 種飲用水進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)采樣。其中，自備井水（n=5），具體編號(hào)為WW_1、WW_2、WW_3、WW_4、WW_5；樓宇水箱水（n=3），具體編號(hào)為TW_1、TW_2、TW_3；管網(wǎng)末梢水（n=4），具體編號(hào)為MW_1、MW_2、MW_3、MW_4。共12 個(gè)水樣。

1.2 檢測(cè)項(xiàng)目

按照GB/T 5750《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》對(duì)水樣進(jìn)行采集、保存、運(yùn)輸及檢驗(yàn)。水樣檢測(cè)指標(biāo)：感官性狀和一般化學(xué)指標(biāo)[pH 值、渾濁度、總?cè)芙夤腆w（total dissolved solids，TDS）、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Cl-、SO42-]、毒理指標(biāo)（Pb2+、Cd2+、F-、NO3--N）、微生物指標(biāo)（菌落總數(shù)、總大腸菌群、大腸埃希氏菌）。

1.3 DNA 提取與Illumina MiSeq 高通量測(cè)序

采用DP328 DNA 提取試劑盒提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行樣品DNA 提取。將提取到的基因組DNA，對(duì)16S rDNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，以3 組樣品：自備井水、樓宇水箱水、管網(wǎng)末梢水共12 個(gè)水樣所提取的DNA原液作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模板，利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物序列為B314F：（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），B785R：（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR 進(jìn)行2 輪擴(kuò)增，第1 輪反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；25 個(gè)循環(huán)；72 ℃后保溫5 min，于4 ℃保存。第2 輪反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，8 個(gè)循環(huán)；72 ℃后保溫5 min，于4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后配制2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，膠回收按照QIAquick Gel Extraction Kit 操作流程進(jìn)行，進(jìn)行Illumina MiSeq 高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Mothur 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行序列過濾，去除平均質(zhì)量得分≤20 的序列，去除含N 的序列，去除同聚體過長(zhǎng)（>10 bp）的序列；去除引物錯(cuò)配過多（≥4 bp）的序列，并去除引物序列；去除過短（≤200 bp）和過長(zhǎng)（≥500 bp）的序列；使用UCHIME 法以Gold 數(shù)據(jù)集作為參比，去除嵌合體（chimera），以得到用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。

使用USEARCH 根據(jù)序列相似度將序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），相似度高于97%的序列聚類為一個(gè)OTU，OTU 聚類時(shí)將稀有序列（singleton）棄去。通過Mothur 軟件計(jì)算各水樣的豐富度和多樣性指數(shù)。使用PyNAST 將3 組水樣的OTU序列比對(duì)到SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)，用UniFrac 生成群落間距離矩陣，通過主成分分析繪制二維主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）圖。通過Excel 軟件對(duì)細(xì)菌相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，解析微生物群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體的理化性質(zhì)

不同類型飲用水的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

表1 不同類型飲用水的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)Table 1 Conventional water quality indicators of different types of drinking water

由表1 可知，3 種類型飲用水的水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果略有不同。自備井水中檢測(cè)出菌落總數(shù)為18～240 CFU/mL，超過飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限值（100 CFU/mL）；同時(shí)還檢測(cè)出總大腸菌群和大腸埃希氏菌，說明自備井水中存在一定的微生物污染。微生物指標(biāo)中菌落總數(shù)是評(píng)價(jià)水受到污染的參考指標(biāo)，水體受污染的程度越高，水中的菌落總數(shù)就越高[7]，總大腸菌群超標(biāo)表明可能存在腸道傳染病菌[8]，而大腸埃希氏菌則是水體受糞便污染的重要指示菌[9]。造成自備井水微生物指標(biāo)不合格的原因可能包括污水排放隨地表水或雨水滲入地下、自備井與廁所等糞水距離較近、地面存在動(dòng)物糞便被糞水污染等[10]。因此，需要加強(qiáng)自備井水的凈化消毒以及日常監(jiān)管維護(hù)。

所采集的管網(wǎng)末梢水樣中，某采樣點(diǎn)的Cu2+濃度最高達(dá)2.218 mg/L，超過飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限值（1.000 mg/L）。長(zhǎng)期飲用含銅超標(biāo)的水會(huì)導(dǎo)致生物體的肝臟和腎臟受到嚴(yán)重的損害，造成嚴(yán)重的疾病[11]。研究表明出廠水會(huì)受到配水系統(tǒng)本身的影響，比如管道材料[12]、管道腐蝕[13]和松散沉積物的再懸浮[14]等。本研究管網(wǎng)末梢水Cu2+超標(biāo)的原因可能是該采樣點(diǎn)的輸配水設(shè)施材質(zhì)造成金屬離子析出[15]或是與管道老化銹蝕有關(guān)[16]。因此，需要慎重選擇運(yùn)輸管道的材質(zhì)，并加強(qiáng)輸水管網(wǎng)體系的后期運(yùn)行維護(hù)，保障居民的安全用水。其余檢測(cè)指標(biāo)均未見超標(biāo)現(xiàn)象，均符合GB 5749—2022《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。綜上所述，本研究中樓宇水箱水的水質(zhì)最優(yōu)，其次為管網(wǎng)末梢水和自備井水，這與相關(guān)的研究結(jié)果相符[15]。

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 微生物群落Alpha 多樣性分析

各水樣的豐富度和多樣性指數(shù)如表2所示。

表2 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of Alpha diversity indexes

由表2 可知，覆蓋率為99.37%～99.85%，表明測(cè)序結(jié)果可靠，可以較為真實(shí)、準(zhǔn)確地描述樣本微生物群落信息。統(tǒng)計(jì)各水樣在不同OTU 中的豐度信息，其中，自備井水的OTU 較多，為593～1 779 個(gè)，樓宇水箱水的OTU 較少，為593～608 個(gè)，這表明自備井水有較多的特有微生物種類。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表示微生物群落的多樣性，香農(nóng)指數(shù)越大多樣性越高，辛普森指數(shù)越小多樣性越高[17]。ACE 和Chao1 通常用于估計(jì)樣本中微生物群落豐富度，兩者值越大代表物種越多[18]。3 種類型飲用水中香農(nóng)指數(shù)為自備井水＞管網(wǎng)末梢水＞樓宇水箱水，辛普森指數(shù)為樓宇水箱水＞管網(wǎng)末梢水＞自備井水，ACE 為自備井水＞管網(wǎng)末梢水＞樓宇水箱水，Chao1 指數(shù)為自備井水＞管網(wǎng)末梢水＞樓宇水箱水，上述結(jié)果表明，自備井水的微生物群落多樣性與豐富度最高，而樓宇水箱水的微生物群落多樣性與豐富度最低。

2.2.2 微生物群落Beta 多樣性與差異細(xì)菌分析

基于Unifrac 距離的PCoA 分析能描述不同樣品間是否有顯著的微生物群落差異，如果兩個(gè)樣品的距離較近，則表示這兩個(gè)樣品的微生物群落組成較相似[19]。本研究中自備井水、管網(wǎng)末梢水和樓宇水箱水的細(xì)菌群落PCoA 分析（weighted UniFrac）如圖1所示。

圖1 不同類型飲用水的UniFrac 加權(quán)主坐標(biāo)PCoA 分析Fig.1 Weighted UniFrac PCoA analysis of different types of drinking water

由圖1 可知，第一主成分、第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為76.6%、10.1%。從組間差異來(lái)看，自備井水與樓宇水箱水組間差異較大；從組內(nèi)相似度來(lái)看，樓宇水箱水的3 個(gè)水樣相似度最高，自備井水的5 個(gè)水樣相似度最低，管網(wǎng)末梢水的相似度居中。自備井是農(nóng)村及邊遠(yuǎn)地區(qū)的一種供水方式，其分布較為分散，地理位置跨度較大，且水質(zhì)易受周圍環(huán)境和居民生活影響，因此組內(nèi)相似度較低。而樓宇水箱水的來(lái)源為市政供水，且水箱具有建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)及維護(hù)措施，因此組內(nèi)相似度較高。

2.2.3 微生物群落組成分析

在門水平上，水樣的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖2所示。

由圖2 可知，按相對(duì)豐度大于0.1%的原則，門水平上共篩選出8 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門。所有水樣均以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）為主，這4種門水平的相對(duì)豐度比例約占96.72%～99.18%，說明在門水平上，Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes 和Actinobacteria 為自備井水、樓宇水箱水和管網(wǎng)末梢水的優(yōu)勢(shì)菌群。已有研究表明，這些菌門廣泛存在于各類水源中，與本研究結(jié)果一致。張紫薇等[20]研究發(fā)現(xiàn)Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes 是崗南水庫(kù)的主要優(yōu)勢(shì)菌門。林凱宗等[21]研究表明Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria 和疣微菌門（Verrucomicrobia）是北京、黑龍江等五省自備井水的優(yōu)勢(shì)菌門。此外，Proteobacteria、Actinobacteria 和Firmicutes 也是水體沉積物的主要菌門，在有機(jī)物降解、碳循環(huán)以及水生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)過程中起著重要的作用[22]。本研究中自備井水、樓宇水箱水和管網(wǎng)末梢水的優(yōu)勢(shì)微生物菌門是Proteobacteria，但在自備井水中Firmicutes 的相對(duì)豐度達(dá)到8.95%～39.12%，成為第二大優(yōu)勢(shì)微生物種群。這主要是由于Firmicutes 與人類活動(dòng)密切相關(guān)[23]，而自備井水又受人類活動(dòng)擾動(dòng)較大，因此Firmicutes的占比較高。

在屬水平上，不同類型飲用水的群落結(jié)構(gòu)分布如圖3所示。

圖3 不同類型飲用水的屬水平群落結(jié)構(gòu)分布Fig.3 Community structure distribution of bacteria at genus level in different types of drinking water

由圖3 可知，3 種類型飲用水的細(xì)菌覆蓋242 個(gè)屬，其中相對(duì)豐度大于1%的包括13 個(gè)屬，3 種類型飲用水的細(xì)菌群落組成存在一定的差異性，但優(yōu)勢(shì)菌屬均為嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）、遠(yuǎn)洋桿菌屬（Pelagibacterium）、大腸埃希氏-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）和涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）。其中樓宇水箱水和管網(wǎng)末梢水具有相似的群落結(jié)構(gòu)組成，這與它們來(lái)自于相同的市政供水管網(wǎng)有關(guān)，樓宇水箱水由于供水前會(huì)先在蓄水池中進(jìn)行貯藏再進(jìn)行輸送，易造成二次污染，從而導(dǎo)致在水質(zhì)、細(xì)菌物種豐富度上與管網(wǎng)末梢水不同，但這并不會(huì)改變水中細(xì)菌群落的組成。就占主導(dǎo)的細(xì)菌種類而言，Halomonas、Pelagibacterium和Nesterenkonia在3 種水樣的平均相對(duì)豐度順序均為樓宇水箱水>管網(wǎng)末梢水>自備井水。Escherichia-Shigella在3 種水樣的平均相對(duì)豐度順序?yàn)樽詡渚?管網(wǎng)末梢水>樓宇水箱水。其中Halomonas可以同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化作用，具有一定的脫氮能力[24-25]，Pelagibacterium與氟化物有關(guān)，可以作為氟化物和氟中毒的標(biāo)志微生物[26]。Nesterenkonia在高鹽堿環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，且為優(yōu)勢(shì)放線細(xì)菌類群[27]。Halomonas、Pelagibacterium和Nesterenkonia的平均相對(duì)豐度均在樓宇水箱水中最高，管網(wǎng)末梢水次之，其原因可能與水箱的環(huán)境選擇作用有關(guān)，造成優(yōu)勢(shì)微生物的富集[28]，同時(shí)有研究表明Halomonas可能是來(lái)自飲用水儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的污染，因此其在樓宇水箱水和管網(wǎng)末梢水中豐度較高[29]。Escherichia-Shigella是細(xì)菌性痢疾的病原體[30]，易造成飲用水微生物安全風(fēng)險(xiǎn)，其序列與大腸桿菌高度相似，是檢測(cè)動(dòng)物糞便污染的指標(biāo)之一[31]。該菌屬在自備井水的檢出率相對(duì)較高，其原因可能是自備井水相較于樓宇水箱水和管網(wǎng)末梢水更易受人和動(dòng)物糞便的污染。Escherichia-Shigella的檢出可能會(huì)對(duì)人類健康造成威脅，因此，需要加強(qiáng)自備井水的凈化和消毒。

2.2.4 功能基因代謝通路分析

通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對(duì)3 種類型飲用水基因序列進(jìn)行微生物代謝功能分析，其各功能基因相對(duì)豐度如圖4所示。

圖4 KEGG 代謝通路功能分類圖Fig.4 KEGG function classifications of metabolism pathways

由圖4 可知，在一級(jí)分類上，3 種類型飲用水的所有功能基因序列可以分為7 類，其中，新陳代謝功能模塊相關(guān)的功能基因相對(duì)豐度較高且數(shù)量較多。其次是遺傳信息加工、未分類、環(huán)境信息加工和細(xì)胞過程。人類疾病和生物體系統(tǒng)模塊相關(guān)的功能基因相對(duì)豐度較低。

二級(jí)分類的功能主要集中在膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)、能量代謝這5 種途徑，這與之前的研究結(jié)果相似[32]。同時(shí)，在本研究中，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的3 種類型飲用水不同代謝途徑的豐度值均差距不大，表明飲用水細(xì)菌群落的代謝水平具有趨同性。這是由于代謝途徑通常涉及酶催化、代謝產(chǎn)物合成等生物化學(xué)反應(yīng)[33]，這些反應(yīng)的發(fā)生不依賴于飲用水的種類，而受到更復(fù)雜因素的影響。因此，不同類型的飲用水對(duì)代謝途徑的影響較小，3 種類型飲用水表現(xiàn)為趨同性。此外，從3 種類型飲用水中共發(fā)現(xiàn)6 種與人類疾病相關(guān)的途徑，即傳染性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病和代謝性疾病，這些疾病均會(huì)導(dǎo)致人體健康出現(xiàn)問題。因此，需要關(guān)注飲用水可能帶來(lái)的傳染風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)飲用水安全的監(jiān)管。

3 結(jié)論

自備井水中檢測(cè)出菌落總數(shù)且超過飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限值，同時(shí)還檢測(cè)出總大腸菌群和大腸埃希氏菌，表明應(yīng)對(duì)自備井進(jìn)行定期的凈化消毒和設(shè)施養(yǎng)護(hù)；管網(wǎng)末梢水中Cu2+超標(biāo)，可能存在輸配水設(shè)施材質(zhì)老化的問題，因此需要及時(shí)進(jìn)行維護(hù)與更換。自備井水的微生物群落多樣性最高、組間相似度最低，樓宇水箱水微生物多樣性最低、組間相似度最高，且兩者間細(xì)菌群落存在差異。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota和Actinobacteria 為管網(wǎng)末梢水、樓宇水箱水和自備井水的優(yōu)勢(shì)菌門。Halomonas、Pelagibacterium和Nesterenkonia的平均相對(duì)豐度均在樓宇水箱水中最高，可能是來(lái)自飲用水儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的污染，致病菌Escherichia-Shigella在自備井水中的檢出率相對(duì)較高，該菌主要來(lái)源于人和動(dòng)物糞便的污染，說明自備井易受人類活動(dòng)的污染，需要加強(qiáng)自備井水的凈化和消毒。3 種類型飲用水的水質(zhì)和微生物群落存在一定差異，但自備井水更易受到外界環(huán)境以及人類活動(dòng)等因素的影響。通過微生物代謝功能分析可知，3 種類型飲用水中均發(fā)現(xiàn)少量與人類疾病相關(guān)的代謝途徑，這些疾病均會(huì)導(dǎo)致人體健康出現(xiàn)問題，因此，需加強(qiáng)飲用水安全的監(jiān)管。