三七總皂苷治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價研究

嚴(yán)燦梅 呂林艷 梁云飛 蘭 星 黃宇聲 鄭志遠(yuǎn)　

三七總皂苷治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價研究

嚴(yán)燦梅1,2呂林艷1,2梁云飛1,2蘭 星1,2黃宇聲1,2鄭志遠(yuǎn)1,2

（1.廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，廣西 梧州 543000；2.廣西三七綜合利用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 梧州 543000）

目的：利用斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓模型評價三七總皂苷對血管內(nèi)皮損傷性血栓功效。方法：普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓模型，三七總皂苷在28℃處理條件下18 h后測定MTD、心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度及血流速度。結(jié)果：三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4對模型斑馬魚的MTD均為250 ng/尾，三七總皂苷樣品2對模型斑馬魚的MTD為62.5 ng/尾。三七總皂苷樣品均可增加模型斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度、血流速度。結(jié)論：三七總皂苷具有改善斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓功效。

三七總皂苷；血管內(nèi)皮損傷；血栓；功效

引言

三七總皂苷（Panax notoginsenosides，PNS），是三七的主要活性成分，單體主要包括人參皂苷Ra、Rb1、Rc、Rg1、Rd、Re等，其他成分為多糖、蛋白質(zhì)、微量元素等，在活血化瘀、改善微循環(huán)、通脈活絡(luò)等方面有較好活性，被廣泛用于治療心腦血管等疾病。目前，利用斑馬魚模型研究三七總皂苷的活血化瘀作用文獻(xiàn)報道較少。本文通過研究不同比例三七總皂苷對血管內(nèi)皮損傷性血栓模型斑馬魚的作用，探討不同比例三七總皂苷活血化瘀作用，為提高三七總皂苷有效成份含量提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)樣品

三七總皂苷樣品1（皂苷含量為Rg1＞R1＞Rb1＞Re＞Rd）、三七總皂苷樣品2（皂苷含量為Rg1＞Rb1＞R1＞Re＞Rd）、三七總皂苷樣品3（皂苷含量為Rb1＞Rg1＞R1＞Rd＞Re）和三七總皂苷樣品4（皂苷含量為Rb1＞Rg1＞Rd＞R1＞Re），來源于廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司。各樣品用氯化鈉注射液配制成100 mg/mL母液，在-20℃環(huán)境下分裝儲存。

1.2 試驗(yàn)動物

受精后5天（5 dPf）黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，用于樣品治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效最大檢測劑量（MTD）測定及其功效評價。

斑馬魚飼養(yǎng)條件為水溫28℃，水質(zhì)：200 mg速溶海鹽/1L純化水，pH調(diào)至6.5～8.5，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm，硬度為50～100 mg/L CaCO3。斑馬魚均由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK（浙）2022-0004，飼養(yǎng)管理符合國際實(shí)驗(yàn)動物評估和認(rèn)可管理委員會（AAALAC）認(rèn)證（認(rèn)證編號001458）的要求。

1.3 儀器與試劑

儀器：顯微鏡（日本OLYMPUS，SZX7）；顯微注射儀（日本Narishige，IM300）；CCD相機(jī)（上海土森視覺科技有限公司，VerA1）；拉針儀（日本Narishige，PC-10）；心跳血流分析系統(tǒng)（法國ViewPoint Life Sciences，ZebraBlood3.4）；精密電子天平（美國OHAUS，CP214）。

試劑：氯化鈉注射液（批號S21091609，湖南科倫制藥有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號BCCD8942，Sigma公司）；甲基纖維素（批號C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；普納替尼（批號13771，美國MedChemExPress公司）；鄰聯(lián)茴香胺（批號MKBX3619V，Sigma公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 MTD測定

隨機(jī)選取5 dPf斑馬魚于6孔板中，每孔30尾。分別靜脈注射給予三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品2、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4（劑量見表1），同時設(shè)置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。除正常對照組外，其余各組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓模型，在28℃條件下處理18 h后，測定樣品對模型斑馬魚的MTD。

2.2 治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價

于6孔板中，每孔隨機(jī)處理斑馬魚30尾，以靜脈注射的給藥方式分別給予三七總皂苷樣品1組、三七總皂苷樣品2組、三七總皂苷樣品3組和三七總皂苷樣品4（劑量見表2），設(shè)正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。模型對照組及三七總皂苷各樣品組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓模型，28℃條件下處理18 h后，鄰聯(lián)茴香胺染色，每組隨機(jī)挑選10尾斑馬魚于解剖顯微鏡下觀察，收集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，以此指標(biāo)評價三七總皂苷樣品治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效。數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學(xué)改善功效評價

隨機(jī)選取斑馬魚于6孔板中，每孔30尾，設(shè)正常對照組、模型對照組、三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品2、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4組，每孔容量為3 mL，各給藥組以靜脈注射方式分別給予相應(yīng)的三七總皂苷樣品。除正常對照組外，其余各組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓模型，在28℃條件下處理18h后，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚血流視頻，分析統(tǒng)計斑馬魚血流速度，評價不同成分配比的三七總皂苷樣品對血流動力學(xué)改善功效。結(jié)果用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTD

在本實(shí)驗(yàn)條件下，三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4對模型斑馬魚的MTD均為250 ng/尾，三七總皂苷樣品2對模型斑馬魚的MTD為62.5 ng/尾。詳見表1。

表1 樣品治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效劑量摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝30）

3.2 治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價

在本次實(shí)驗(yàn)條件下，與正常對照組比較，納普替尼處理18 h后模型對照組心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯降低（＜0.001），表明血管內(nèi)皮損傷性血栓模型建立成功。與模型對照組比較，三七總皂苷樣品1在62.5、125及250 ng/尾濃度下均可顯著增加斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05，＜0.001，＜0.001）；三七總皂苷樣品2的62.5 ng/尾濃度組可增加心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.001）；三七總皂苷樣品3的62.5、125和250 ng/尾濃度組均可增加心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05，＜0.05，＜0.001）；三七總皂苷樣品4的62.5、125、250 ng/尾濃度組均可增加心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05，＜0.01，＜0.01）。詳見表2、圖1和圖2。

表2 樣品治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝10）

注與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

圖1 斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度典型圖

注：藍(lán)色虛線框處為分析部位斑馬魚心臟。

圖2 斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.3 血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學(xué)改善功效評價

在本次實(shí)驗(yàn)條件下，與正常對照組比較，模型對照組在造模18 h后血流速度明顯下降（＜0.001），表明模型建立成功。與模型對照組比，三七總皂苷樣品1于125 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05），三七總皂苷樣品2于62.5 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05），三七總皂苷樣品3于125 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05），三七總皂苷樣品4于 250 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05）。詳見表3和圖3。

表3 樣品血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學(xué)改善功效評價實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝10）

注與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05。

圖3 樣品處理后斑馬魚血流速度

注：與正常對照組比，###＜0.001；與模型對照組比，*＜0.05。

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種單層扁平細(xì)胞，介于血流與血管壁組織之間，是血管平滑肌和血液的屏障，可合成和釋放血管活性物質(zhì)，調(diào)控血管張力，維持血管結(jié)構(gòu)，在血流動力學(xué)與血管的收縮舒張功能方面具有不可替代的調(diào)控作用，對維持正常的血液循環(huán)有重要的生理作用[1]。大量研究數(shù)據(jù)顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷及其導(dǎo)致的病理變化是形成血瘀證的重要因由，與多種心血管疾病危險因素有著密切的聯(lián)系[2]。

斑馬魚能夠全面、方便、快捷地檢測評估先導(dǎo)藥物的初步藥效和安全性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物的高通量篩選，是目前生命科學(xué)研究中最佳模式生物之一[3]。普納替尼是一種激酶抑制劑，可阻斷血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與其受體的作用，從而干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、存活等正常生理功能而誘發(fā)血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，導(dǎo)致血管產(chǎn)生堵塞，引起血栓[4]。在斑馬魚軀干出現(xiàn)血栓之后，回心血量隨之減少，減小血管直徑，降低血流速度，通過血紅細(xì)胞特異性染色（呈紅色），利用斑馬魚血液系統(tǒng)呈透明的獨(dú)特優(yōu)勢[5,6]，可在顯微鏡下直接觀察心臟紅細(xì)胞，血管內(nèi)皮損傷性血栓模型斑馬魚心臟紅細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常斑馬魚心臟紅細(xì)胞數(shù)量，通過心跳血流分析系統(tǒng)可直接觀察采集斑馬魚血流相關(guān)數(shù)據(jù)。

5 結(jié)束語

本研究采用普納替尼致斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓模型，探討不同配比三七總皂苷改善血管內(nèi)皮損傷性血栓功效。研究結(jié)果表明，三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品2、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4均可增加血管內(nèi)皮損傷性血栓模型斑馬魚心臟紅細(xì)胞數(shù)量和提高血流速度，改善斑馬魚血管內(nèi)皮損傷性血栓，從而發(fā)揮活血化瘀的功效。其中在62.5 ng/尾濃度下，三七總皂苷樣品2增加斑馬魚心臟紅細(xì)胞數(shù)量和提高血流速度最佳。

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Study on the Evaluation of the Efficacy of Panax Notoginsenosides in the Treatment of Vascular Endothelial Injury Thrombosis

Objective: To evaluate the effect of Panax notoginsenosides on vascular endothelial injury thrombosis by using the Zebrafish vascular endothelial injury thrombosis model. Methods: Ponatinib was used to establish Zebrafish vascular endothelial injury thrombus model. After being treated with Panax notoginsenosides at the condition of 28℃ for 18 hours, MTD, red blood cell staining intensity and blood flow velocity were measured. Results: The MTD of Panax notoginsenosides sample 1, Panax notoginsenosides sample 3 and Panax notoginsenosides sample 4 to model Zebrafish was 250 ng/tail, and the MTD of Panax notoginsenosides sample 2 to model Zebrafish was 62.5 ng/tail. Panax notoginsenosides can increase the red blood cell staining intensity and blood flow velocity of model Zebrafish heart. Conclusion: The Panax notoginsenosides can improve the thrombotic effect of Zebrafish vascular endothelial injury.

Panax notoginsenosides; vascular endothelial injury; thrombus; efficacy

R743; R285

A

1008-1151(2023)09-0070-04

2023-04-12

中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項目（桂科ZY22096004）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD20297068）；梧州市科技計劃項目（202202009）。

嚴(yán)燦梅（1990－），女，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司實(shí)驗(yàn)師，從事藥理研究相關(guān)工作。

鄭志遠(yuǎn)（1967－），男，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司高級工程師，從事藥物研究相關(guān)工作。