高效液相色譜—蒸發(fā)光檢測器測定石斛夜光丸的5種成分

李麗莉 白桂昌 羅 軼 覃麗酈 呂軼峰　

高效液相色譜—蒸發(fā)光檢測器測定石斛夜光丸的5種成分

李麗莉 白桂昌 羅 軼 覃麗酈 呂軼峰

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

目的：建立同時測定石斛夜光丸人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，麩炒枳殼中新橙皮苷、柚皮苷的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD），流動相為乙腈－水梯度洗脫，空氣流速2.0 L/min，漂移管溫度為110℃。采用建立的方法對樣品進(jìn)行測定，并使用R語言對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：所測5種成分在各自線性范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 6，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD均小于2.95%，平均回收率為96.7%～99.5%，RSD均小于1.90%。使用R語言對結(jié)果進(jìn)行分析，不同廠家的石斛夜光丸5種成分含量差異顯著。結(jié)論：該方法簡便快捷、穩(wěn)定，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，實現(xiàn)了對石斛夜光丸中麩炒枳殼、人參的質(zhì)量評價，一方面為進(jìn)一步提升石斛夜光丸的整體質(zhì)量控制水平奠定基礎(chǔ)，另一方面也為不同廠家石斛夜光丸的質(zhì)量對比研究提供參考。

石斛夜光丸；麩炒枳殼；人參；R語言；HPLC-ELSD

引言

石斛夜光丸由石斛、人參、山藥、茯苓、甘草、肉蓯蓉、枸杞子、菟絲子、地黃、熟地黃、五味子、天冬、麥冬、苦杏仁、防風(fēng)、川芎、麩炒枳殼、黃連、牛膝、菊花、鹽蒺藜、青葙子、決明子、水牛角濃縮粉、山羊角等25味藥材組成，被收錄于《中國藥典》2020年版一部[1]，具有滋陰補(bǔ)腎、清肝明目的功效。

本品現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅控制了黃連1味藥的含量，未對其中貴細(xì)藥材人參進(jìn)行含量控制，控制指標(biāo)不全面。

此外，本品處方中有枳殼藥材。枳殼與青皮性狀相近[2,3]，但成分上有所不同。青皮中含蕓香柚皮苷、橙皮苷，不含柚皮苷、新橙皮苷，枳殼中含柚皮苷、新橙皮苷[4-7]。石斛夜光丸現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層鑒別的方法，以柚皮苷、新橙皮苷為對照品，對枳殼進(jìn)行定性控制。采用該方法實驗，蕓香柚皮苷、橙皮苷（青皮中含有），柚皮苷、新橙皮苷斑點顏色一致（枳殼中含有），Rf值也較為接近，該方法不能有效鑒別石斛夜光丸中投的是枳殼還是青皮，因此建議采用靈敏度、專屬性更高的方法對枳殼進(jìn)行含量控制。

為能更好地反映石斛夜光丸樣品的質(zhì)量，本文采用HPLC- ELSD法建立了石斛夜光丸人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1以及麩炒枳殼中含量較高的新橙皮苷、柚皮苷的含量測定方法[8-10]，為合理評價石斛夜光丸的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試藥與樣品

1.1.1 試藥

柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110722-201815，含量91.7%）；新橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：11857-201804，含量99.4%）；人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110703-201933，含量93.4%）；人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110754-202028，含量93.9%）；人參皂苷Rb1對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110704-202028，含量93.1%）。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.1.2 樣品

57批石斛夜光丸均為水蜜丸，來自9個不同的生產(chǎn)企業(yè)。

1.2 儀器

Waterse2695高效液相色譜儀，AllChrom ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測器，ML204型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為CAPCELLPAK MGⅡ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈－水系統(tǒng)；色譜梯度洗脫：0～25 min、14%乙腈，25～45 min、14%～20%乙腈，45～63 min、20%～24%乙腈，63～70 min、24%～28%乙腈，70～82 min、28%～33%乙腈，82～95 min、33%乙腈，95～102 min、33%～38%乙腈，102～105 min、38%乙腈；流動相流速1.0 mL/min，空氣流速2.0 L/min；漂移管溫度110℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.458 0、0.573 0、0.100 2、0.092 2、0.203 5 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

取樣品，研碎，取6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，稱定重量，加熱回流1小時，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品混合溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，測定，以峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)()，對照品進(jìn)樣量對數(shù)值為橫坐標(biāo)()，計算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2 精密度試驗

取“2.2”項下的樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積并計算RSD，RSD分別為2.68%、2.95%、2.94%、2.45%、1.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取同一批石斛夜光丸，按“2.3”項下方法各平行制備6份樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析。新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量分別為0.8598 mg·g-1（RSD=1.79%）、07313 mg·g-1（RSD=2.46%）、0.1854 mg·g-1（RSD=1.44%）、0.3968 mg·g-1（RSD=1.47%）、0.3043 mg·g-1（RSD=0.62%），RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下的同一供試品溶液，分別于0、4、8、14、20、24 h，按“2.1”項下色譜條件分析，計算新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積并計算RSD，RSD分別為2.68%、2.95%、2.94%、2.45%、1.26%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收實驗

稱取石斛夜光丸6份，精密稱定，計算樣品中新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量，以樣品含量與對照品加入量1∶1的比例，分別加入對照品，按“2.3”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1回收率分別為99.3%（RSD=1.40%，=6）、96.2%（RSD=0.64%，=6）、99.5%（RSD=1.90%，=6）、96.7%（RSD=1.49%，=6）、96.7%（RSD=1.52%，=6），回收率在95%～100%之間，表明回收率實驗符合要求，方法的準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣品測定及結(jié)果

取不同廠家、不同批號石斛夜光丸57批，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析，對樣品中所含新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進(jìn)行測定，結(jié)果見表1、表2。其中G、H、I三家企業(yè)未檢出新橙皮苷、柚皮苷峰，檢出其它兩個色譜峰，經(jīng)確認(rèn)為橙皮苷與云香柚皮苷峰。所有企業(yè)均檢出人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰，但C企業(yè)樣品及E、F企業(yè)的部分樣品人參皂苷Rb1峰含量相對偏高。

表2 57批石斛夜光丸5種成分含量測定結(jié)果表

表2（續(xù)）

生產(chǎn)企業(yè)批號柚皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1人參皂苷Rg1/mg·g-1人參皂苷Re/mg·g-1人參皂苷Rb1/mg·g-1 G190501000.060.160.21 200101000.060.160.25 191001000.040.120.20 H190505000.020.030.06 191006000.100.120.18 191202000.100.220.37 191004000.080.100.16 200104000.080.200.31 191107000.120.330.52 191102000.120.240.38 I191004000.040.100.17

2.7 化學(xué)計量分析

本文方法測定采用新橙皮苷、柚皮苷作為枳殼的指標(biāo)成分，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1作為人參的指標(biāo)成分，通過測定指標(biāo)成分的含量評價石斛夜光丸的質(zhì)量。

應(yīng)用R語言軟件對所測定的結(jié)果進(jìn)行分析。在選擇評價因素時，考慮到C企業(yè)樣品及E、F企業(yè)的部分樣品人參皂苷Rb1峰含量相對偏高，可能存在以西洋參代替人參投料而出現(xiàn)人參皂苷Rb1峰含量相對偏高的情況[11-16]，故本文采用新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1的含量及人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量的比值來作為評價人參質(zhì)量的因素[17]。

2.7.1 主成分分析

應(yīng)用R語言軟件以柚皮苷、新橙皮苷、人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量的比值為因素對所測結(jié)果進(jìn)行主成分分析，用“summary”命令得到各主成分得分，見表3。第一主成分的貢獻(xiàn)率為73.20%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為23.94%，累計達(dá)到97.14%，說明兩者能較全面地反映樣品間的差異。

表3 各主成分得分表

使用“tpc”及“cbind”計算各廠家綜合得分以及排名，見表4，可以清晰準(zhǔn)確比較各廠家產(chǎn)品的質(zhì)量情況。從表4可以看出，A廠得分最高，排第一。

表4 各廠家綜合得分以及排名

2.7.2 聚類分析

使用“biplot”與“plot”命令得到第一、第二主成分相關(guān)趨勢圖與聚類圖，見圖1、圖2，各生產(chǎn)企業(yè)大致分為4類：（1）H、G、I未檢出柚皮苷與新橙皮苷歸為一類；（2）C、F因人參皂苷Rg1與人參皂苷Re比值較低歸為一類；（3）A因人參皂苷Rg1含量以及其余與人參皂苷Re含量的比值較高歸為一類；（4）其余D、B、E歸為一類。

圖2 聚類圖

3 討論

3.1 檢測器的選擇

實驗過程中，考察了以乙腈-0.1%磷酸為流動相，使用紫外檢測器以203、283 nm為檢測波長對樣品中新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進(jìn)行測定，但因干擾峰較多，使供試品溶液制備過程更加繁瑣，且不同廠家產(chǎn)品有所差異，在測定過程中，無法保證待測組分與干擾峰均能得到有效分離。而采用HPLC-ELSD方法測定新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量，與紫外檢測器相比，干擾較少，使提取更簡單，結(jié)果更準(zhǔn)確。

筆者曾采用Alltech 3300 ELSD低溫型蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測，結(jié)果靈敏度欠佳。AllChrom ELSD6000高溫型蒸發(fā)光散射檢測器，指標(biāo)性成分穩(wěn)定性好，靈敏度高。

3.2 關(guān)于測定結(jié)果分析

采用建立的方法對9個生產(chǎn)企業(yè)57批石斛夜光丸進(jìn)行檢測，并采用R語言和聚類分析方法對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分批次樣品未檢出新橙皮苷、柚皮苷峰，提示部分生產(chǎn)企業(yè)未按處方投料。57批石斛夜光丸柚皮苷、新橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re與人參皂苷Rb1含量存在差異，表明各生產(chǎn)企業(yè)之間5種成分均有顯著性差異，各企業(yè)對原藥材質(zhì)量控制松緊不一，石斛夜光丸質(zhì)量好壞參差不齊。

4 結(jié)論

本文采用HPLC-ELSD方法測定新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量，五種成分精密度RSD為1.26%～2.95%，重復(fù)性RSD為0.62%～2.46%，24小時穩(wěn)定性RSD為1.26%～2.92%。所建立的方法操作簡單易行，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，專屬性和重現(xiàn)性好。為石斛夜光丸中人參與麩炒枳殼的質(zhì)量控制提供了有效的技術(shù)手段。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2015年版): 一部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2015．

[2] 張付軒，盧紅委. 青皮枳實枳殼香櫞鑒別[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2018，16(11): 87-89.

[3] 張成元. 枳實與青皮的鑒別[J]. 中藥通報，1985(12): 17.

[4] 姚娜，黃燕明，李雪銀，等. HPLC同步測定麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜與柚皮苷橙皮苷新橙皮苷含量[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2019，21(11): 1569-1572.

[5] 譚梓君，田芳，何小芳，等. 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2019，33(6): 28-31.

[6] 周德勝. 麩炒枳殼的炮制工藝及其緩和藥性的初步研究[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)藥，2018，38(6): 137-139，151.

[7] 陳芳，梁月儀，童培珍，等. 不同規(guī)格青皮飲片指紋圖譜研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2021，23(1): 117-122.

[8] 馮素香，李先賀，李蒙蒙，等. HPLC-ELSD法測定人參不同部位13種人參皂苷的含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2017，34(7): 565-569，612.

[9] 陳小娟，李志紅，劉靜，等. 超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定參松養(yǎng)心膠囊中人參皂苷Rg_1和Re含量[J]. 中國藥業(yè)，2015，24(14): 84-86.

[10] 周旭，翟延君. HPLC-ELSD同時測定柴胡消癭顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸及橙皮苷的含量[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2015，17(3): 227-231.

[11] 黃河. 西洋參中摻雜人參的鑒別研究[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19(9): 18，21.

[12] 王晶，張勇，畢萌菲，等. RP-HPLC法分析測定人參、西洋參、三七中的皂苷類化合物[J]. 食品研究與開發(fā)，2020，41(7): 172-176.

[13] 王玉方，金春愛，趙卉，等. UPLC-ESI-MS/MS法測定人參、紅參和西洋參中多種皂苷含量[J]. 特產(chǎn)研究，2019，41(3): 58-66.

[14] 李蕾，謝麗娟，王國明，等. 人參、西洋參不同部位提取物中14種皂苷含量比較[J]. 人參研究，2018，30(3): 11-13.

[15] 姜濤，陳林明，楊小龍. 超高效液相色譜法測定西洋參中西洋參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的方法研究[J]. 海峽藥學(xué)，2018，30(5): 65-68.

[16] 陳軍輝，謝明勇，章志明，等. 12種西洋參中總皂苷及人參皂苷Rb1的測定比較[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2005(9): 845-847.

[17] 嚴(yán)華，張慧秀，白宗利，等. 人參屬西洋參 人參和三七特征圖譜[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2019，21(11): 1512-1518.

Determination of 5 Components in Shihu Yeguang Pills by High Performance Liquid Chromatography with Evaporation Photodetector

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1and the content of new hesperidin and naringin in fructori aurantii. Methods: High performance liquid chromatography evaporative light scattering (HPLC-ELSD) was used. The mobile phase was acetonitrile water gradient elution, with an air flow rate of 2.0 L/min and a drift tube temperature of 110 ℃. The established method was used to measure the samples, and the results were analyzed using R language. Results: The 5 components tested showed good linear relationships within their respective linear ranges, with correlation coefficients r greater than 0.9996. The RSD for precision, repeatability, and stability were all less than 2.95%, with an average recovery rate of 96.7% to 99.5% and RSD less than 1.90%. Using R language to analyze the results, it was found that there were significant differences in the content of the 5 components of Shihu Yeguang pills from different manufacturers. Conclusion: This method is simple, fast, stable, and the determination results are accurate and reliable. It not only achieves the quality evaluation of fructori aurantii and ginseng in Shihu Yeguang pills, but also lays the foundation for further improving the overall quality control level of Shihu Yeguang pills. On the other hand, it also provides reference for the quality comparison research of Shihu Yeguang pills from different manufacturers.

Shihu Yeguang pills; fructori aurantii; ginseng; R language; HPLC-ELSD

O657

A

1008-1151(2023)09-0017-05

2023-02-27

李麗莉（1980－），女，廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所副主任藥師，從事中藥民族藥質(zhì)量控制研究工作。

呂軼峰（1982－），男，廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所副主任藥師，從事中藥民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。