tribbles 同源物1 在前列腺癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征的關(guān)系

鄭香玉，吳光鋒，付勇先，范瑞

南陽市第一人民醫(yī)院病理科，河南 南陽 473000

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是最常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年超過25 萬例患者死于該病，病死率居男性惡性腫瘤第5 位[1-2]。PCa 確診后可采取前列腺切除術(shù)或放療等一線治療，然而，仍有部分患者會在治療數(shù)月至數(shù)年后出現(xiàn)復(fù)發(fā)且血液前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平升高。不同種族的PCa 患者基線PSA 水平不同，部分患者無法準(zhǔn)確診斷，因此，早期診斷和評估疾病進(jìn)展情況對治療方案的制訂和預(yù)后改善具有很大影響。tribbles 同源物1（tribbles homolog 1，TRIB1）屬于tribbles 家族成員之一，可以通過與許多調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的蛋白質(zhì)相互作用，參與腫瘤的發(fā)生[3]。目前已有研究證實TRIB1 能夠直接或間接地參與PCa 的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究探討TRIB1 在PCa 組織中的表達(dá)及與患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2021 年12 月南陽市第一人民醫(yī)院收治的PCa 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為PCa；②年齡50～75 歲；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織呈現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌分化；②合并嚴(yán)重的器質(zhì)性疾??；③合并精神疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入92 例患者，年齡57～72 歲；T 分期[5]：T1～2期42 例，T3期50 例；PSA 水平：≤20 ng/ml 36 例，﹥20 ng/ml 56 例；轉(zhuǎn)移負(fù)荷[6]：高轉(zhuǎn)移負(fù)荷（指存在內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，或骨轉(zhuǎn)移灶4 個以上，并且至少有1 個骨盆或脊柱以外的轉(zhuǎn)移）44 例，低轉(zhuǎn)移負(fù)荷48 例；Gleason 評分：≤7 分49 例，8～9 分43 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要材料

1.2.1 儀器 CFX Connect Real-time PCR 擴(kuò)增儀、iMark 型酶標(biāo)儀均購自美國Bio-Rad 公司，全自動免疫組化預(yù)處理系統(tǒng)PT link 和全自動免疫組化染色系統(tǒng)Autostain Link 48 均購自丹麥DAKO 公司，Tanon 5200 Multi 型全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購自天能科技有限公司，OSE-Y30 型電動組織研磨器購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.2 試劑 cDNA 合成試劑盒、Real-time PCR 試劑盒均購自北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司，PSA 試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；蘇木素、伊紅染色液均購自貝索生物技術(shù)有限公司，TRIzol 試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，TRIB1 抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.3 免疫組化染色法檢測TRIB1 蛋白表達(dá)情況及結(jié)果判定

收集PCa 患者的PCa 組織和癌旁組織，采用免疫組化染色法檢測TRIB1 蛋白表達(dá)情況。組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，脫水，并嵌入到蠟塊中，采用微型切片機(jī)將樣本切成4～6 μm 薄片，并將切片放置在玻片上。由于石蠟包埋可能會掩蓋蛋白質(zhì)的抗原決定位點，因此需要使蛋白質(zhì)抗原重新暴露。酶解后選取TRIB1 特異性抗體，進(jìn)行熒光標(biāo)記，清洗去除未結(jié)合的抗體，減少背景信號。應(yīng)用緩沖液對組織切片進(jìn)行多次洗滌。加入適當(dāng)?shù)牡孜锒被?lián)苯胺，使酶標(biāo)記的抗體形成棕色沉淀。熒光標(biāo)記的抗體可以直接在熒光顯微鏡下觀察。在另一塊組織切片上使用陰性對照和陽性對照。染色完成后，用適當(dāng)?shù)姆馄瑒⒔M織切片密封，然后顯微鏡下觀察。

采用半定量法評價免疫組化染色結(jié)果。染色強(qiáng)度評分：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0 分，﹤10%為1 分，10%～30%為2 分，31%～50%為3 分，﹥50%為4 分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞百分比評分相乘，≤3 分為（-），4～6 分為（+），7～9 分為（++），10～12 分為（+++），0～6 分判定為陰性，7～12 分判定為陽性。

1.4 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測TRIB1 mRNA相對表達(dá)量

采用TRIzol 法提取PCa 組織和癌旁組織總RNA，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：2×PCR buffer 10 μl，ddH2O 6 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl。PCR 反應(yīng)：95 ℃30 s 預(yù)變性，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃5 s 變性，60 ℃1 min 退火，95 ℃1 s 退火，50 ℃30 s 冷卻。以GAPDH為內(nèi)參，采用2–△△Ct法計算TRIB1mRNA相對表達(dá)量。TRIB1上游引物5'-CCTTCGTGATCCTCTACA-3'，下游引物5'-TGGCTTTCGCCCAAACAT-3'；GAPDH上游引物5'-ACCCCACTATCTC- 3'，下游引物 5'- TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。根據(jù)受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線計算cut-off 值，以PCa 組織中TRIB1mRNA 相對表達(dá)量的中位值1.989 為臨界值，≥1.989 為高表達(dá)，﹤1.989 為低表達(dá)。

1.5 觀察指標(biāo)

比較PCa 組織和癌旁組織中TRIB1mRNA 相對表達(dá)量及TRIB1 蛋白表達(dá)情況，比較不同臨床特征PCa 患者PCa 組織中TRIB1mRNA 表達(dá)情況，分析TRIB1mRNA 表達(dá)與PCa 患者臨床特征的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Kendall 相關(guān)分析。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIB1 蛋白表達(dá)情況的比較

PCa 組織中TRIB1 蛋白陽性表達(dá)率為88.04%（81/92），明顯高于癌旁組織的11.96%（11/92），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=106.522，P﹤0.01）。免疫組化染色結(jié)果顯示，PCa 組織中TRIB1 蛋白評分為（9.37±1.16）分，明顯高于癌旁組織的（5.36±1.25）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.555，P﹤0.01）。PCa組織中TRIB1 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，細(xì)胞核為棕黃色或褐色，而癌旁組織中TRIB1 蛋白呈陰性表達(dá)，細(xì)胞核未著色（圖1）。

圖1 PCa組織和癌旁組織中TRIB1蛋白表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 TRIB1 mRNA 相對表達(dá)量的比較

PCa 組織中TRIB1mRNA 相對表達(dá)量為（2.002±0.287），明顯高于癌旁組織的（1.793±0.134），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.329，P﹤0.01）。92例患者中，TRIB1mRNA 高表達(dá)53 例，TRIB1mRNA 低表達(dá)39 例，TRIB1mRNA 高表達(dá)患者的TRIB1mRNA 相對表達(dá)量為（2.244±0.062），明顯高于TRIB1mRNA 低表達(dá)患者的（1.675±0.017），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=55.719，P﹤0.01）。

2.3 不同臨床特征PCa 患者PCa 組織中TRIB1 mRNA 表達(dá)情況的比較

不同確診年齡PCa 患者PCa 組織中TRIB1mRNA 表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）；T3期、PSA水平﹥20 ng/ml、高轉(zhuǎn)移負(fù)荷、Gleason評分為8～9分PCa患者PCa組織中TRIB1mRNA高表達(dá)率分別高于T1～2期、PSA水平≤20 ng/ml、低轉(zhuǎn)移負(fù)荷、Gleason 評分≤7 分的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

2.4 TRIB1 mRNA 表達(dá)與PCa 患者臨床特征的相關(guān)性

Kendall 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TRIB1mRNA 表達(dá)與PCa 患者的轉(zhuǎn)移負(fù)荷無相關(guān)性（P﹥0.05），TRIB1mRNA 表達(dá)與PCa 患者的T 分期、PSA 水平以及Gleason 評分均呈正相關(guān)（r=0.318，P=0.002；r=0.214，P=0.042；r=0.275，P=0.009）。

3 討論

目前PCa 是最常見的一種泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。PCa 已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害男性生命健康的疾病。PCa 的異質(zhì)性較大，有些PCa 的惡性程度很低，進(jìn)展較慢，不需要正規(guī)治療，但有些PCa 的惡性程度較高，侵襲性較強(qiáng)，進(jìn)展較快，需進(jìn)行相應(yīng)治療，從而改善患者預(yù)后[8-9]。目前為止，臨床上還沒有明確的PCa 危險度評估標(biāo)準(zhǔn)，而一些有經(jīng)驗的臨床醫(yī)師會通過綜合評估患者的Gleason 評分、腫瘤分期、血清PSA 水平等預(yù)測病情發(fā)展情況，并對其風(fēng)險進(jìn)行預(yù)估。因此，尋找更多的標(biāo)志物評價PCa 的惡性程度，對于治療方案的制訂非常重要。TRIB 蛋白是由3 個成員組成的絲氨酸/蘇氨酸假激酶家族，包括TRIB1、TRIB2和TRIB3[10]。TRIB 家族蛋白由多種細(xì)胞應(yīng)激因子和有絲分裂因子活化，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。TRIB1基因定位于染色體8q24.13，與c-Myc非常接近[11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TRIB1 能夠控制與惡性腫瘤侵襲性相關(guān)的細(xì)胞功能[12]。Yoshino等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1基因過表達(dá)能夠促進(jìn)同源盒A9（homeobox A9，HOXA9）所致白血病的發(fā)生，提示TRIB1 可能是一個很好的預(yù)測指標(biāo)。與此同時，Kim 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1 在乳腺癌中表達(dá)水平較高，其表達(dá)與患者生存率有關(guān)，而且TRIB1 是一種先前不知道的抗腫瘤細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-15 的負(fù)調(diào)控因子，可使乳腺癌中IL-15 水平下降，從而引起T 淋巴細(xì)胞數(shù)目減少。相關(guān)研究表明，TRIB1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[15]。Shahrouzi 等[16]研究顯示，TRIB1是PCa 患者的8q24 擴(kuò)增子中最穩(wěn)健上調(diào)的編碼基因之一，其轉(zhuǎn)錄受c-Myc 調(diào)控，小鼠建模和功能分析結(jié)果表明，TRIB1異常表達(dá)是PCa發(fā)生的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCa 組織中TRIB1 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，表明TRIB1 在PCa 組織中過表達(dá)。Singh 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1基因過表達(dá)可能會加速惡性腫瘤的發(fā)生。并且，研究者在觀察PCa組織和正常前列腺組織中TRIB1 表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，PCa 組織中TRIB1mRNA 和蛋白表達(dá)水平均增加了3 倍以上[18]。此外，本研究結(jié)果顯示，T3期、PSA 水平﹥20 ng/ml、高轉(zhuǎn)移負(fù)荷、Gleason 評分為8～9 分PCa 患者PCa 組織中TRIB1mRNA 高表達(dá)率分別高于T1～2期、PSA 水平≤20 ng/ml、低轉(zhuǎn)移負(fù)荷、Gleason 評分≤7 分的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。T 分期可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。PSA 由前列腺上皮細(xì)胞合成和分泌，許多類型前列腺疾病患者的血漿PSA水平異常升高，其對PCa 的診斷具有重要的參考意義。Gleason 評分是一種常見的病理分級方法，可以精確地評價腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究結(jié)果提示TRIB1 過表達(dá)在PCa 發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。Zhang 等[19]研究報道，TRIB1 能夠通過抑制核因子κB 抑制因子ζ（inhibitor of nuclear factor-κB zeta，NFKBIZ）的表達(dá)促進(jìn)C-X-C 趨化因子配體（C-X-C motif chemokine ligand，CXCL）和IL-8分泌，并誘導(dǎo)腫瘤生長。Liu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1通過上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78 kD，GRP78）的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)論也證實了TRIB1 異常表達(dá)可能促進(jìn)PCa 進(jìn)展，從而使其成為PCa 診斷和預(yù)后評估的新型潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，TRIB1 可能參與PCa 的發(fā)病過程，同時PCa 的惡性程度與TRIB1mRNA 表達(dá)水平有關(guān)，研究TRIB1mRNA 表達(dá)水平對PCa 的診斷和臨床治療均具有重要意義。