轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在兒童及青少年骨肉瘤患者中的表達(dá)及臨床意義△

戴若恒，刁玉巧#，朱秀麗，陳健，鄭鈺，江蓮，曲凡

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科，石家莊 050000

骨肉瘤是兒童和青少年時(shí)期最常見(jiàn)的原發(fā)性侵襲性骨惡性腫瘤，好發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端[1-2]。隨著醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步，手術(shù)切除聯(lián)合放化療使骨肉瘤患者的生存率提高至60%～70%，但仍有30%～40%的患者伴有肺轉(zhuǎn)移或早期復(fù)發(fā)，其生存率降低至20%左右[3]。因此，在分子水平上進(jìn)一步探索骨肉瘤的診斷和治療方法，尋找新的預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物，開(kāi)展新的治療策略迫在眉睫。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）是一種細(xì)胞膜相關(guān)糖蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)鐵攝取，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。既往研究表明，TFR1 在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、急性白血病、淋巴瘤以及惡性膠質(zhì)瘤等[4-5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成刺激因子之一，可能參與癌變。以往研究表明，VEGF 過(guò)表達(dá)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要，VEGF 高表達(dá)與骨肉瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)[6-7]。目前，有關(guān)TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤組織中表達(dá)相關(guān)性的研究較少。本研究探討TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，分析其與骨肉瘤患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系及二者的相關(guān)性，探討其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用，旨在為兒童及青少年骨肉瘤患者的輔助診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年1 月至2020 年12 月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院收治的兒童及青少年骨肉瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為骨肉瘤；②首次確診，年齡﹤18 歲；③接受手術(shù)治療；④臨床資料、治療方案、隨訪(fǎng)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤；②術(shù)前接受過(guò)化療、放療、中醫(yī)中藥治療、靶向治療、免疫治療等抗腫瘤治療；③圍手術(shù)期死亡；④合并嚴(yán)重心肺功能不全或病情危重。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入35 例患者，男20 例，女15 例；年齡5～18 歲，平均10.58 歲。收集患者的骨肉瘤組織35 例和癌旁正常組織35例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者家屬均知情同意。

1.2 免疫組化染色法檢測(cè)TFR1和VEGF蛋白表達(dá)

根據(jù)鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（peroxidase streptavidin，SP）免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色，所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水；在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；滴加鼠抗TFR1 單克隆抗體（1∶100）、鼠抗VEGF 單克隆抗體（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液沖洗后，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（濃度1 mg/ml），室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗后，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。采用試劑盒提供的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡（×400）視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比﹤1%為0 分，≥1%且﹤25%為1 分，≥25%且﹤50%為2 分，≥50%且﹤80%為3 分，≥80%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：未染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0～3 分為低表達(dá)（-或+），4～6 分為中表達(dá)（++），﹥6 分為高表達(dá)（+++）。

1.4 隨訪(fǎng)方法

采用電話(huà)、門(mén)診等方式對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2021年12月，隨訪(fǎng)時(shí)間為5～60個(gè)月。

1.5 觀察指標(biāo)

比較骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1 和VEGF 表達(dá)情況，比較不同臨床特征兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 表達(dá)情況，比較不同TFR1、VEGF 表達(dá)情況兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況，分析兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線(xiàn)，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1 和VEGF表達(dá)情況的比較

兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1和VEGF 中高表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.696、30.629，P﹤0.01）。（表1、圖1）

圖1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1和VEGF表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

表1 兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1 和VEGF 的表達(dá)情況[n（%）]

2.2 不同臨床特征兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 表達(dá)情況的比較

不同性別、腫瘤直徑兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。中低分化、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Enneking 分期為Ⅱ～Ⅲ期兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 中高表達(dá)率分別高于高分化、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Enneking 分期為Ⅰ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.286、4.119、6.815，P=0.007、0.018、0.006）。中低分化、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Enneking 分期為Ⅱ～Ⅲ期兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中VEGF 中高表達(dá)率分別高于高分化、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Enneking 分期為Ⅰ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.203、3.038、3.656，P=0.003、0.037、0.033）。（表2）

表2 不同臨床特征兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 的表達(dá)情況

2.3 生存情況的比較

TFR1 低表達(dá)兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況優(yōu)于TFR1 中高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.500，P﹤0.05）。VEGF 低表達(dá)兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況優(yōu)于VEGF 中高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.779，P﹤0.05）。（圖2、圖3）

圖2 TFR1低表達(dá)（n=9）和TFR1中高表達(dá)（n=26）兒童及青少年骨肉瘤患者的生存曲線(xiàn)

圖3 VEGF低表達(dá)（n=8）和VEGF中高表達(dá)（n=27）兒童及青少年骨肉瘤患者的生存曲線(xiàn)

2.4 TFR1 與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.669，P﹤0.05）。

3 討論

骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤之一，好發(fā)于兒童及青少年，占所有骨惡性腫瘤的30%和兒科腫瘤的3%～4%[8]。據(jù)報(bào)道，骨肉瘤是青春期第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，可能與青春期骨生長(zhǎng)過(guò)快有關(guān)[9-10]。骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展可能與骨生長(zhǎng)過(guò)快、染色體異常、抑癌基因異常、轉(zhuǎn)錄因子異常高表達(dá)或活性增加、生長(zhǎng)因子和微小RNA（microRNA，miRNA）等異常表達(dá)有關(guān)[11]。該病起病隱匿，惡性程度高，進(jìn)展快，15%～20%的患者在初診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的身心健康、生活質(zhì)量和預(yù)后[12]。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，骨肉瘤患者的5 年生存率提高至60%～70%，由于其局部侵襲性強(qiáng)，易早期轉(zhuǎn)移，且腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生化療耐藥性，骨肉瘤患者的生存率仍不能令人滿(mǎn)意。因此，臨床亟需探索新的生物標(biāo)志物作為兒童及青少年骨肉瘤患者早期診斷、病情和預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)，從而制訂有效的靶向治療方案。

鐵是細(xì)胞維持正常生理功能所必需的微量元素，廣泛參與機(jī)體重要的生命代謝過(guò)程。研究指出，鐵代謝失衡和鐵蓄積可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中鐵代謝相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)失衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。TFR1 是在所有有核細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)的Ⅱ型跨膜糖蛋白，參與并介導(dǎo)鐵的攝取，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖發(fā)揮重要作用。惡性腫瘤細(xì)胞的快速增殖使其需鐵量大大增加，細(xì)胞需要從細(xì)胞質(zhì)中吸收更多的鐵滿(mǎn)足自身增殖需求。TFR1 在鐵吸收過(guò)程中扮演重要角色，在分裂旺盛的腫瘤細(xì)胞中，TFR1 表達(dá)顯著增加，腫瘤細(xì)胞表面TFR1 與轉(zhuǎn)鐵蛋白的親和力是正常細(xì)胞的10～100 倍[14-15]。臨床試驗(yàn)證明，膀胱移行細(xì)胞癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤中TFR1 表達(dá)情況與腫瘤分化程度、臨床分期及預(yù)后有關(guān)[16]。TFR1 的免疫組化染色已廣泛用于評(píng)估細(xì)胞的增殖率，并被認(rèn)為在幾種類(lèi)型的惡性腫瘤中具有評(píng)估預(yù)后的價(jià)值。Miller 等[17]研究674 例乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)TFR1基因表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，TFR1 高表達(dá)提示預(yù)后不良。VEGF 是目前已證實(shí)的最有效、特異性最高的促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，是檢測(cè)血管生成的關(guān)鍵標(biāo)志物。腫瘤新生血管生成是多種類(lèi)型惡性腫瘤的重要預(yù)后因素，研究表明，VEGF與骨肉瘤患者的腫瘤分期、分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況有關(guān)[18-19]。

本研究采用免疫組化染色法檢測(cè)兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 和VEGF 的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 中高表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。提示TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步探討TFR1、VEGF 表達(dá)與兒童及青少年骨肉瘤患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，中低分化、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Enneking 分期為Ⅱ～Ⅲ期兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1、VEGF 中高表達(dá)率均高于高分化、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Enneking 分期為Ⅰ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。提示TFR1 和VEGF 在促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有一定的作用，可反映腫瘤的惡性程度。通過(guò)隨訪(fǎng)患者的生存情況發(fā)現(xiàn)，TFR1、VEGF 低表達(dá)兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況分別優(yōu)于TFR1、VEGF 中高表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。提示TFR1、VEGF 表達(dá)情況與兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況有關(guān)，可能作為評(píng)估骨肉瘤患者預(yù)后的標(biāo)志物，并可能為其治療提供新的靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步分析兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 和VEGF 表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，二者在骨肉瘤患者中的表達(dá)呈正相關(guān)（P﹤0.05），推測(cè)二者在骨肉瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能具有協(xié)同作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。Zhu 等[20]根據(jù)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)TFR 的特點(diǎn)，以與TFR 具有高親和力的T7 肽為導(dǎo)向，研制出靶向性納米載體，同時(shí)負(fù)載中藥化療增敏劑姜黃素和化療藥物多西他賽，證實(shí)了納米藥物不僅可通過(guò)協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用，而且可通過(guò)對(duì)腫瘤免疫抑制性微環(huán)境進(jìn)行正調(diào)控增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)納米載體最大可能地減輕了常規(guī)化療藥物引起的骨髓抑制、器官功能受損等不良反應(yīng)。

綜上所述，TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可作為骨肉瘤診斷、惡性程度判斷及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，同時(shí)也可為兒童及青少年骨肉瘤患者的治療提供新思路、新靶點(diǎn)。