三肽基肽酶1 和環(huán)狀RNA Tau-微管蛋白激酶2 在食管癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

薛金良，靳超，張曉

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院胸外科，洛陽市心胸外科疾病臨床研究中心，河南 洛陽 471009

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率日益增高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年食管癌病死例數(shù)約30 萬例，中國(guó)約15 萬例，約占全球的50%[1]。盡管近年來影像技術(shù)、外科手術(shù)、放化療等技術(shù)快速發(fā)展，但多數(shù)患者就診時(shí)仍已處于食管癌晚期，因此，早期診斷、及時(shí)治療是提高食管癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明，食管癌的發(fā)生與相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)[2]。端粒保護(hù)蛋白三肽基肽酶1（tripeptidyl peptidase 1，TPP1）高表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。近年來，相關(guān)報(bào)道顯示，基因轉(zhuǎn)錄會(huì)形成非編碼環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）Tau-微管蛋白激酶2（Tau-tubulin kinase 2，TTBK2），其是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生細(xì)胞毒性，可作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志[4]。因此，本研究探討TPP1、circ-TTBK2 在食管癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年6 月至2017 年6 月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院收治的食管癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡49～75 歲；②術(shù)前未接受化療、放療等輔助治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎嚴(yán)重疾病；②合并嚴(yán)重神經(jīng)功能、認(rèn)知功能障礙；③依從性差；④合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入100 例食管癌患者，其中男59 例，女41 例；年齡49～75 歲，平均（59.31±6.65）歲；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌67 例，其他33 例；分化程度：高分化21 例，中分化37 例，低分化42 例。取100 例食管癌患者的食管癌組織及癌旁正常組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測(cè)TPP1 蛋白的表達(dá)情況

選取100 例食管癌患者的食管癌組織及癌旁正常組織，生理鹽水清洗后保存在10%甲醛溶液中，-80 ℃恒溫箱保存待檢。石蠟切片標(biāo)本厚2 μm，烘烤60 ℃，二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次。滴加內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，沖洗。滴加一抗（稀釋濃度1∶100），室溫孵育1 h，沖洗。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G 聚合物，室溫孵育30 min，采用PBS 代替一抗；滴加山羊抗兔二抗室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，樹膠封片[5]。結(jié)果判定：采用雙盲法評(píng)估TPP1 蛋白的表達(dá)情況[6]。隨機(jī)選取5 個(gè)視野，依據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無著色計(jì)0 分，淺黃色染色計(jì)1 分，棕黃色染色計(jì)2 分，棕褐色染色計(jì)3分；依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞所占比例﹤25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞所占比例為25%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占比例﹥50%計(jì)3分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，﹤4分判定為陰性，≥4分判定為陽性。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)circ-TTBK2 的相對(duì)表達(dá)量

選取100 例腫瘤組織及癌旁正常組織，生理鹽水沖洗后保存于-70 ℃冰箱中待檢。采用Trizol 總RNA 提取試劑盒提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄，得到互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件：90 ℃60 s，92 ℃30 s，56 ℃30 s，74 ℃30 s，38 個(gè)循環(huán)。circ-TTBK2 上游引物：5'-AATAGTACTTGGGTCCTCCTCT-3'，下游引物：5'-CTGCCAACTGTCGCATGTTC-3'；以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'。每個(gè)標(biāo)品均設(shè)3 個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，參照每孔Ct 值進(jìn)行分析[7]。計(jì)算circ-TTBK2 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪

對(duì)所有患者進(jìn)行為期3 年的隨訪，隨訪時(shí)間截至2020 年6 月，記錄患者的預(yù)后情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；食管癌患者預(yù)后的影響因素采用Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPP1、circ-TTBK2 表達(dá)情況的比較

食管癌組織中TPP1 的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，circ-TTBK2 的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1、圖1）

圖1 食管癌組織中TPP1蛋白的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

表1 食管癌組織和癌旁正常組織中TPP1、circ-TTBK2表達(dá)情況的比較

2.2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中TPP1、circ-TTBK2 表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、病理類型食管癌患者食管癌組織中TPP1 蛋白表達(dá)情況和circ-TTBK2 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。分化程度為低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為T3～4食管癌患者食管癌組織中TPP1 蛋白陽性表達(dá)率分別高于分化程度為高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為T1～2的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.168、4.345、7.994、6.156，P﹤0.05）。分化程度為低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為T3～4食管癌患者食管癌組織中circ-TTBK2 的相對(duì)表達(dá)量分別高于分化程度為高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為T1～2的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.060、11.721、15.728、11.240，P﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中TPP1、circ-TTBK2表達(dá)情況（n=100）

2.3 食管癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

隨訪3 年，100 例食管癌患者生存68 例，死亡32 例，病死率為32.00%。年齡、性別、病理類型均可能與食管癌患者的預(yù)后無關(guān)（P﹥0.05）；分化程度、TNM 分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、circ-TTBK2 表達(dá)情況、TPP1 表達(dá)情況均可能與食管癌患者的預(yù)后有關(guān)（P﹤0.05）。（表3）

表3 食管癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

2.4 食管癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、circ-TTBK2表達(dá)情況、TPP1 表達(dá)情況作為自變量，食管癌患者的預(yù)后作為因變量納入多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析，結(jié)果顯示，浸潤(rùn)深度為T3～4、分化程度為低中分化、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、circ-TTBK2高表達(dá)、TPP1蛋白陽性表達(dá)均為食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P﹤0.05）。（表4）

表4 食管癌患者預(yù)后影響因素的Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析

3 討論

有研究顯示，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與端粒、端粒酶密切相關(guān)[8]。TPP1 表面的TEL patch 與端粒酶結(jié)合，可調(diào)節(jié)端粒酶的募集及活性，進(jìn)而控制端粒的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性，且端粒的改變與乳腺癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。既往在宮頸癌細(xì)胞中加入端粒酶抑制劑——BIBR1532，可抑制TPP1 上的TEL patch 與端粒酶結(jié)合，從而抑制宮頸癌Hela 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡[9]。Zhang 和Dong[10]對(duì)慢性B 淋巴細(xì)胞白血病的端粒變化情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，僅TPP1 及復(fù)制蛋白AⅠ（replication protein AⅠ，RPAⅠ）的表達(dá)明顯上調(diào)，其他蛋白水平均有降低。Wallace 等[11]采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌中基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸組織相比，結(jié)腸癌組織中TPP1 的表達(dá)明顯上調(diào)，提示TPP1 蛋白陽性表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者的用藥選擇有指導(dǎo)意義。

circ-TTBK2 是一種激酶，是神經(jīng)細(xì)胞骨架的主要成分，其通過催化微管中含量最高的Tau 蛋白使微管處于不穩(wěn)定狀態(tài)，激活微管磷酸化，通過調(diào)節(jié)miRNA-217 等通路調(diào)控膠質(zhì)瘤的惡性程度[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，circ-TTBK2 在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[13]。

本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中TPP1的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，circ-TTBK2 的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，且隨著食管癌臨床分期增高、組織分化程度的降低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，TPP1 和circ-TTBK2 的表達(dá)也逐漸上調(diào)，這與徐勇軍等[14]研究食管癌組織中circ-TTBK2 表達(dá)情況一致，說明其與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，為明確影響食管癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，本研究對(duì)食管癌患者進(jìn)行為期3年的隨訪發(fā)現(xiàn)，100例患者病死率高達(dá)32%。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TPP1表達(dá)升高與食管癌患者3 年總生存率降低密切相關(guān)[15]。而Zhang等[16]的研究也表示，circ-TTBK2 可作為判斷食管癌患者惡性程度與預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析結(jié)果顯示，浸潤(rùn)深度為T3～4、分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、circ-TTBK2 高表達(dá)、TPP1 蛋白陽性表達(dá)均為食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P﹤0.05）。表明TPP1 和circ-TTBK2 均與食管癌患者的預(yù)后關(guān)系密切，進(jìn)一步提示TPP1 和circ-TTBK2 可通過參與腫瘤細(xì)胞的分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移影響食管癌患者的臨床結(jié)局，但關(guān)于其以何種方式來調(diào)節(jié)食管癌的進(jìn)展仍未明確，后續(xù)仍將繼續(xù)深入研究。

綜上所述，TPP1 在食管癌中陽性表達(dá)，circ-TTBK2 在食管癌中高表達(dá)，且與食管癌患者的臨床特征密切相關(guān)，circ-TTBK2 高表達(dá)、TPP1 蛋白陽性表達(dá)均為食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。