UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS法分析 補(bǔ)腎降濁顆粒的化學(xué)成分

顧雪晶,孫 正,郝 騰,李艷麗, 2,朱圓瑛,吳 燕,康立圓,許 卉

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005;2.濱州市中醫(yī)醫(yī)院,山東 濱州 256601)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,大約30%～40%的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)腎臟疾病,臨床上以持續(xù)性白蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降為主要特征,同時(shí)增加了患者患高血壓和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。中醫(yī)認(rèn)為DN多因氣陰兩虛、腎氣不固導(dǎo)致淤阻經(jīng)脈,治療需以補(bǔ)腎固精、益氣活血為治療原則[2-3],而補(bǔ)腎降濁顆粒具有補(bǔ)腎降濁、活血通絡(luò)的功效。補(bǔ)腎降濁顆粒是在經(jīng)典名方六味地黃丸基礎(chǔ)上結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)加味而成的院內(nèi)中藥制劑[4],經(jīng)過(guò)臨床反復(fù)實(shí)踐,治療DN療效確切,有利于延緩DN發(fā)病進(jìn)程。

中藥復(fù)方制劑成分十分復(fù)雜,發(fā)揮藥效不是單一成分的簡(jiǎn)單加和,而是多成分協(xié)同起效[5-6],因此,同時(shí)檢測(cè)盡可能多的化學(xué)成分至關(guān)重要。目前,補(bǔ)腎降濁顆粒的化學(xué)成分研究未見(jiàn)報(bào)道,而超高效液相色譜四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-Orbitrap-HRMS)具有高選擇性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究[7-8]。本研究首次利用質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)補(bǔ)腎降濁顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行快速分離鑒定,為進(jìn)一步研究藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制提供參考。

1 材 料

Thermo Scientific 高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司),Exactive 四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司),XS-105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO),TGL-20W型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司),SK250HP型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司),補(bǔ)腎降濁顆粒(批號(hào)20220212,濱州市中醫(yī)院),甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)默克公司),娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方 法

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動(dòng)相:0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～4 min 2% B,10～18 min 10%～25% B,35～47 min 45%～60% B,47～55 min 60%～90% B,55～60 min 90% B,60.1～64 min 2% B),流速:0.3 mL/min,柱溫:40 ℃,進(jìn)樣量:2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),在正、負(fù)離子模式下分別進(jìn)行檢測(cè),掃描范圍:m/z80～1200,鞘氣流速:50 L/min,輔助氣流速:10 L/min,噴霧電壓:3500 V,輔助器溫度:350 ℃,離子化電壓:5500 V,碰撞能量:20、40、60 eV。

2.2 溶液制備

取補(bǔ)腎降濁顆粒適量,研細(xì),取約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇溶液40 mL,密塞,稱定重量,超聲處理30 min,再次稱重,用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,過(guò)0.22 μm濾膜,即得。

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Thermo Xcalibur 4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子和加合離子等信息推測(cè)并得到精確相對(duì)分子質(zhì)量,再由Xcalibar 4.0軟件擬合計(jì)算分子式,與Compound discovery 3.2軟件和本地自建數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配,依據(jù)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的信息,確認(rèn)化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 果

采用UPLC-Q-Orbitrap-HRMS方法對(duì)補(bǔ)腎降濁顆粒的化學(xué)物質(zhì)組成進(jìn)行快速分析,按“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件,分別進(jìn)行正、負(fù)離子模式掃描,采集得到正、負(fù)離子模式下的色譜圖,結(jié)果如圖1所示。針對(duì)質(zhì)譜中得到的準(zhǔn)分子離子和特征碎片離子信息,結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析,推測(cè)了173個(gè)化合物,其中主要包括黃酮類、有機(jī)酸類、酚類、萜類等,結(jié)果匯總見(jiàn)表1。分別選取各結(jié)構(gòu)類型的代表性成分,根據(jù)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),對(duì)化合物進(jìn)行鑒定,分析化合物裂解方式。

表1 補(bǔ)腎降濁顆粒中的化學(xué)成分

3.1 黃酮類化合物裂解途徑分析

圖2 芒柄花苷二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑

3.2 有機(jī)酸類化合物裂解途徑分析

共鑒別出有機(jī)酸類化合物36個(gè),以化合物金雞納酸為例,在正離子模式下經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜掃描得準(zhǔn)分子離子峰m/z192.057 9 [M+H]+,預(yù)測(cè)其分子式為C7H12O9,二級(jí)質(zhì)譜圖顯示m/z173.008 4、145.049 7、129.0544、111.007 4、85.028 0。通過(guò)計(jì)算可以歸屬得到的碎片離子,準(zhǔn)分子離子失去一個(gè)COOH,得到碎片離子m/z145.049 7 [M+H-COOH]+;隨后失去一個(gè)OH得到碎片離子m/z129.054 4 [M+H-COOH-OH]+;再失去一個(gè)OH,得到基峰碎片離子m/z111.007 4 [M+H-COOH-OH-OH]+;準(zhǔn)分子離子失去一個(gè)H2O,得到碎片離子峰m/z173.008 4 [M+H-H2O]+;隨后再失去一個(gè)COOH,一個(gè)OH,一個(gè)C—O,得到碎片離子峰m/z85.028 0 [M+H-COOH-CHO2]+。根據(jù)以上碎片離子信息,推測(cè)該化合物為金雞納酸,其二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 金雞納酸二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑

3.3 萜類化合物裂解途徑分析

共鑒別出萜類化合物45個(gè),以化合物丹參酮ⅡA為例,在正離子模式下經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜掃描得準(zhǔn)分子離子峰m/z295.132 2 [M+H]+,預(yù)測(cè)其分子式為為C19H18O3,二級(jí)質(zhì)譜圖顯示m/z280.168 9、262.098 1、249.126 4、184.075 3、81.070 3。通過(guò)計(jì)算可以歸屬得到的碎片離子,準(zhǔn)分子離子失去一個(gè)CH3,得到碎片離子m/z280.168 9 [M+H-CH3]+;隨后失去C5H2O4,得到基峰碎片離子m/z184.075 3 [M+H-C5H2O4]+;再失去一個(gè)C8H7,得到碎片離子m/z81.070 3 [M+H-C5H2O4-C8H7]+;準(zhǔn)分子離子失去一個(gè)H2O和一個(gè)CH3,得到碎片離子m/z262.098 1 [M+H-H2O-CH3]+;再失去一個(gè)H2O和一個(gè)C—O,得到碎片m/z249.126 4 [M+H-H2O-CO]+。根據(jù)以上碎片離子信息,推測(cè)該化合物為丹參酮IIA,其二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 丹參酮ⅡA二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑

3.4 酚類化合物裂解途徑分析

共鑒別出酚類化合物18個(gè),以化合物白皮杉醇為例,在負(fù)離子模式下經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜掃描得準(zhǔn)分子離子峰m/z243.065 9 [M-H]-,預(yù)測(cè)其分子式為C14H12O4,二級(jí)質(zhì)譜圖顯示m/z226.055 7、135.048 3、121.028 1、109.028 1。通過(guò)計(jì)算可以歸屬得到的碎片離子,失去一分子的H2O,得到碎片離子m/z226.055 7 [M-H-H2O]-;失去C6H2O, 得到碎片離子m/z135.043 8 [M-H-H2O-C6H2O]-;再失去一個(gè)CH2,得到碎片離子m/z121.028 1 [M-H-H2O-C7H4O]-;再失去一個(gè)CH3,得到碎片離子m/z107.028 1 [M-H-H2O-C7H4O]-。根據(jù)以上碎片離子信息,推測(cè)該化合物為白皮杉醇,其二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 白皮杉醇二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑

3.5 糖和苷類化合物裂解途徑分析

共鑒別出糖和苷類化合物21個(gè),以化合物乙基-β-D-吡喃葡萄糖為例,在負(fù)離子模式下經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜掃描得準(zhǔn)分子離子峰m/z221.066 2 [M-H]-,預(yù)測(cè)其分子式為C8H14O7,二級(jí)質(zhì)譜圖顯示m/z161.044 5、113.024 4、75.028 7。通過(guò)計(jì)算可以歸屬得到的碎片離子,準(zhǔn)分子離子失去一個(gè)COOH和一個(gè)OH,得到碎片離子m/z161.044 5 [M-H-COOH-OH]-;失去C2H9O,得到碎片離子m/z113.024 4 [M-H-COOH-OH-C2H9O]-;失去C3H2,得到碎片離子m/z75.008 7[M-H-COOH-OH-C2H9O-C3H2]-。根據(jù)以上碎片離子信息,推測(cè)該化合物為乙基-β-D-吡喃葡萄糖,其二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 乙基-β-D-吡喃葡萄糖二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑

4 討 論

目前已有多項(xiàng)關(guān)于補(bǔ)腎降濁藥方中單味藥材的研究,尚未有關(guān)于該復(fù)方顆粒中化學(xué)成分的報(bào)道。本研究采用的UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術(shù),用于分析中藥復(fù)方的復(fù)雜成分具有很大的優(yōu)勢(shì),該技術(shù)結(jié)合了Q Exactive的高靈敏性和Orbitrap的高準(zhǔn)確性[9-11],可以增加補(bǔ)腎降濁顆粒中化學(xué)成分的檢出。對(duì)比正、負(fù)離子兩種掃描模式,正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng),但是不同化合物在不同掃描模式下響應(yīng)不同[12-13],為獲得全面的化合物信息,采用兩種離子掃描模式以獲得更全面的化合物信息?？傠x子流圖可知出峰時(shí)間大多集中在35～55 min范圍內(nèi)。在建立色譜條件的過(guò)程中,選擇梯度洗脫的目的是讓樣品中強(qiáng)保留組分也能被洗脫出來(lái),該方法是組分復(fù)雜的樣品常采用的洗脫方式[14]。為確定最佳的色譜條件,將10～18 min,45～60 min范圍內(nèi)的梯度變化加快,增加樣品出峰數(shù)量,若使用比較緩慢的梯度會(huì)導(dǎo)致出峰較少、分離度差,而20～40 min范圍內(nèi)需要減慢梯度,以保證色譜峰的分離度,最終確定了最優(yōu)的梯度洗脫條件。同時(shí),在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸溶液可有效改善峰型和離子化效果。

5 結(jié) 論

本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術(shù),確定了最優(yōu)的色譜和質(zhì)譜條件,建立的檢測(cè)方法用于補(bǔ)腎降濁顆粒的化學(xué)成分分析,高效、準(zhǔn)確。總共鑒定出173個(gè)化學(xué)成分,正離子模式下鑒別出91個(gè)化合物,負(fù)離子模式下鑒別出82個(gè)化合物。首次明確了萜類、黃酮類、有機(jī)酸類化合物是補(bǔ)腎降濁顆粒的主要組成成分,從整體上明確了補(bǔ)腎降濁顆粒的化學(xué)成分,為進(jìn)一步研究藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。