小麥鏈格孢病原菌鑒定及產(chǎn)毒分析

張瑤瑤,盧蘇南,李彥伸,尤艷莉

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

鏈格孢霉菌是自然界常見(jiàn)的植物病原菌,能夠侵染谷物、蔬菜和水果,造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。鏈格孢霉菌是主要的產(chǎn)毒素真菌屬之一,已報(bào)道的鏈格孢霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物超過(guò)70種[3],被稱(chēng)為鏈格孢毒素。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)及毒性不同,常見(jiàn)的鏈格孢毒素主要分為四大類(lèi)[4]:最大的一類(lèi)是二苯吡喃酮化合物,代表性毒素有交鏈孢酚(alternariol, AOH)、交鏈孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)、交鏈孢烯(altenuene, ALT);第二類(lèi)是戊醌類(lèi)化合物,代表毒素有ATX-Ⅰ (altertoxin-Ⅰ)、ATX-Ⅱ (altertoxin-Ⅱ)、ATX-Ⅲ(altertoxin-Ⅲ)等;第三類(lèi)是四氨基酸衍生物如細(xì)交鏈格孢酮酸(tenuazonic acid, TeA)等;此外還有雜混結(jié)構(gòu)如騰毒素(tentoxin,TEN)、酚類(lèi)如細(xì)格菌素(altenusin, ALU)、環(huán)狀肽等[5-6]。鏈格孢毒素對(duì)人和牲畜具有急性毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性、胚胎毒性甚至是致畸、致癌和致突變性等危害[6-9]。另外,TEN具有植物毒性,導(dǎo)致植物萎黃病[10],被研究為除草劑。

2016—2022年對(duì)各類(lèi)食品中的交鏈孢毒素進(jìn)行監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)在小麥及其制品中AOH、AME、TEN和TeA污染最為嚴(yán)重,檢出率均超過(guò)90%[11-13]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中陸續(xù)報(bào)道了應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)谷物等農(nóng)產(chǎn)品中多種霉菌毒素的方法[14-15]。霉菌毒素因受到植物、動(dòng)物和真菌代謝的影響,其結(jié)構(gòu)在新陳代謝或食物加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生改變,與極性物質(zhì)如氨基酸、硫酸鹽或糖苷等結(jié)合發(fā)生修飾形成隱蔽型毒素[16]。這些修飾過(guò)的毒素?cái)z入后會(huì)在消化道釋放游離毒素,給健康帶來(lái)潛在的危險(xiǎn)[17];而這些結(jié)構(gòu)修飾的霉菌毒素在常規(guī)提取條件下能夠保持穩(wěn)定,無(wú)法通過(guò)常規(guī)分析技術(shù)檢測(cè)到。由于缺乏可靠的商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)研究數(shù)據(jù),難以對(duì)這些真菌毒素進(jìn)行有效全面的檢測(cè)。因此,監(jiān)測(cè)這些潛在有害代謝物的存在是確保食品安全的主要任務(wù)之一。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近年來(lái)真菌毒素分析領(lǐng)域發(fā)展最快的分析方法之一,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[18],但是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在定性定量準(zhǔn)確度方面仍存在不足,而且限制于靶向分析,無(wú)法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中多種未知風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)進(jìn)行篩查[19]。近年來(lái),高分辨質(zhì)譜的發(fā)展解決了這一問(wèn)題。高分辨質(zhì)譜相對(duì)于一般串聯(lián)譜,分辨率和分子質(zhì)量精度均更高[20]。Q-Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜基于目標(biāo)化合物母離子精準(zhǔn)質(zhì)荷比直接對(duì)目標(biāo)化合物定性定量,具有很強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力,適用于未知化合物快速篩查[21]。

本研究從東營(yíng)市小麥種植區(qū)病變小麥中分離純化并鑒定出12株鏈格孢霉菌,基于前期研究[22]開(kāi)發(fā)的超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件技術(shù),對(duì)鏈格孢霉毒素和隱蔽性毒素進(jìn)行可視化分析;并且模擬室溫下鏈格孢侵染小麥種子,對(duì)小麥萌發(fā)過(guò)程產(chǎn)生的鏈格孢毒素進(jìn)行定性和定量分析。本研究可為谷類(lèi)小麥鏈格孢毒素的發(fā)生規(guī)律提供理論依據(jù),為我國(guó)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥種子購(gòu)自山東省煙臺(tái)市,要求顆粒飽滿(mǎn),無(wú)機(jī)械損傷和病害;馬鈴薯購(gòu)自山東省煙臺(tái)市煙大市場(chǎng)。于小麥抽穗期收集山東省東營(yíng)市小麥種植區(qū)病變小麥樣品。

交鏈孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品:ALT、ALU、AME、AOH、ATX-Ⅰ、TeA和TEN購(gòu)于青島普瑞邦(Pribolab)生物工程有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 購(gòu)自北京陸橋科技有限公司;植物基因組DNA試劑盒(DP305)購(gòu)自TIANGEN;蔗糖(分析純)購(gòu)自西隴化工股份有限公司;瓊脂購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司;氯化鈉(分析純)、乙腈(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、甲醇(色譜純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)由實(shí)驗(yàn)室制備:量取500 mL馬鈴薯提取液,稱(chēng)取20 g蔗糖,17 g瓊脂,于500 mL蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌20 min,倒入9 cm 一次性培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)基冷卻凝固后裝袋密封,室溫保存?zhèn)溆?。馬鈴薯提取液:把400 g去皮馬鈴薯切成小塊,用紗布包好,在1 L水中煮沸10 min,過(guò)濾到錐形瓶?jī)?nèi),121 ℃高壓滅菌20 min,將馬鈴薯提取液保存在冰箱中備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SHH-250L生化培養(yǎng)箱(重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠);3k15高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司);QL-901型渦旋混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司);電子顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);JA-1003N分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);超高效液相色譜系統(tǒng)(UltimataTM 1290)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive Plus)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌分離與純化 采用組織培養(yǎng)法,對(duì)小麥中的病原菌進(jìn)行分離純化。小麥籽粒用無(wú)菌水沖洗,去除表面雜質(zhì)。用75%的乙醇清洗處理30 s,后經(jīng)5%次氯酸鈉清洗消毒2～3 min,無(wú)菌水清洗3次,無(wú)菌濾紙片擦干水分,將適量籽粒接種于含氯霉素的PDA培養(yǎng)基。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d,培養(yǎng)期間注意觀察菌落生長(zhǎng)情況。根據(jù)菌絲的生成位置、顏色,挑取不同性狀的單個(gè)菌落孢子接種于新的PDA培養(yǎng)基中,直至得到純種菌株。將純化后的菌株保存在25%的甘油中,放置在-80 ℃保種。

1.3.2 病原菌鑒定 對(duì)分離純化得到的病原菌,在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d左右,使用植物基因組DNA試劑盒提取菌株DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用真菌ITS通用引物基因進(jìn)行序列擴(kuò)增,上游引物ITS1和下游引物IITS4序列分別為:ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS4 (5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇),目標(biāo)片段600 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至煙臺(tái)碩博源生物科技有限公司測(cè)定堿基序列,將獲得的序列在NCBI網(wǎng)站提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),采用BLAST程序[23]對(duì)比獲得同源序列,最后借助MEGA X[24]軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置 用千分之一分析天平分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 mg ALT、ALU、AME、AOH、ATX-Ⅰ、TeA和TEN鏈格孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品至2 mL 棕色小瓶,分別加入1 mL 乙腈,配制1 mg/mL 鏈格孢毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋配制成100 μg/mL 鏈格孢毒素單標(biāo)溶液,存于-20 ℃。

1.3.4 鏈格孢霉產(chǎn)毒分析 將12株鏈格孢霉菌編號(hào)如下:BM2-1,BM3-2,GM1-1-1,GM1-1-2,GM2-1-1,MG2-1,MG2-2,MT3-3,XM1,XM2,XM3,XM5。將復(fù)蘇后的菌株分別接種至PDA 和PSA 培養(yǎng)基,于25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)和產(chǎn)毒研究,對(duì)培養(yǎng)10 d左右的菌株進(jìn)行毒素提取。用無(wú)菌1 mL槍頭取出6個(gè)瓊脂塊,放入10 mL EP管內(nèi)。加入4 mL乙酸乙酯,渦旋3 min,超聲30 min,再次渦旋3 min,固定在振蕩器中振蕩30 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的10 mL EP管中,在40 ℃進(jìn)行氮吹,吹干后加入750 μL甲醇,渦旋1 min復(fù)溶, 再加入250 μL的超純水,將復(fù)溶物轉(zhuǎn)移至到2 mL的進(jìn)樣瓶中。樣品經(jīng)0.22 μm注射器過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)入自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶,然后進(jìn)行UPLC-HRMS分析[25]。

1.3.5 小麥萌發(fā)過(guò)程中鏈格孢毒素產(chǎn)生實(shí)驗(yàn) (1)鏈格孢霉接種小麥種。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鏈格孢霉菌株GM1-1-2和XM5均產(chǎn)鏈格孢毒素且種類(lèi)不同,用無(wú)菌生理鹽水將兩株菌株制成孢子懸液。采用培養(yǎng)皿濾紙法培養(yǎng)小麥種子。選取大小一致,籽粒飽滿(mǎn)的小麥種子,用75%乙醇泡3～5 min,用超純水分別沖洗3次,最后用濾紙將水吸干。置于帶滅菌濾紙片的培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿50粒小麥均勻地?cái)[在培養(yǎng)皿中,加入適量去離子水,液面高度為小麥種子高度的1/3～1/2處,噴灑孢子懸液。

(2)鏈格孢霉毒素提取。取適量小麥樣品剪碎。稱(chēng)取剪碎好的樣品2.00 g于10 mL離心管中,加入4 mL乙酸乙酯,渦旋3 min,超聲30 min,再次渦旋3 min,固定在振蕩器中振蕩30 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的10 mL EP管中,再加入4 mL乙腈,渦旋3 min,超聲30 min,再次渦旋3 min,固定在振蕩器中振蕩30 min。將上清液混合在一起,在40 ℃氮吹,吹干后加入750 μL甲醇,渦旋1 min復(fù)溶,再加入250 μL的超純水。將復(fù)溶物過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,用UPLC-HRMS檢測(cè)[25]。

1.3.6 霉菌毒素的UPLC-HRMS檢測(cè)及條件設(shè)置 采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜正離子模式進(jìn)行定性分析。色譜條件:色譜柱Hypersil GOLDTMC18 (100 mm×2.1 mm i.d.,1.9 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫如下:0～2 min 5% B、2～3 min 5%～30% B、3～4 min 30%～40% B、4～5.5 min 40%～55% B、5.5～7.5 min 55%～95% B、7.5～9.0 min 95～5% B、9.0～12.0 min 5% B;進(jìn)樣體積為5 μL,流速為0.3 mL/min;柱溫為40 ℃。質(zhì)譜條件:選擇數(shù)據(jù)依賴(lài)性采集掃描(DDA)模式;全掃描分辨率70 000 FWHM,掃描m/z范圍在120～900,自動(dòng)增益(AGC Target)設(shè)置為3.0×106,最大離子注入時(shí)間(maximum IT)100 ms。本工作采用前5位MSMS掃描(ddMS2),分辨率17 500 FWHM。Loop count:10。AGC Target:8.0×103。Maximum IT:50 ms,Isolation window為1.5 Da,碰撞能量(N)CE:20、40、70。最低強(qiáng)度閾值:1.0×103。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)Thermo公司開(kāi)發(fā)的Xcalibur軟件與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比精準(zhǔn)質(zhì)荷比、元素組成和子離子等信息對(duì)霉菌天然產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。MZmine中的診斷片段過(guò)濾器是一種針對(duì)TMS和MS/MS的采集后數(shù)據(jù)過(guò)濾技術(shù),有效地檢測(cè)出復(fù)雜提取物中給定類(lèi)的所有化合物[26]。使用MZmine 2的診斷碎片過(guò)濾功能[27](Diagnostic Fragmentation Filtering,DFF)對(duì)二項(xiàng)結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行篩選。前期對(duì)鏈格孢霉菌株在培養(yǎng)基產(chǎn)毒數(shù)據(jù)分析顯示,幾種代謝物解離的中性丟失分子質(zhì)量為79.956 8 U,推測(cè)存在SO3結(jié)合的代謝產(chǎn)物。因此本研究中設(shè)置診斷中性損失值為79.956 8 U,質(zhì)荷比公差為0.02或者5.0×10-6,基峰設(shè)置為20%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定

采用組織分離法,從病變小麥中分離純化得到12株病原菌。如圖1(a)所示菌落生長(zhǎng)較快,菌絲發(fā)達(dá),菌落表面不平,呈絨氈狀。BM3-2,GM1-1-1,GM1-1-2,XM2和XM3菌落中心呈墨綠色,中間下陷,有明顯的環(huán)狀輪紋,基質(zhì)呈灰褐色,顏色較深;MG2-1和XM5菌落初期為灰白色,后轉(zhuǎn)為黑褐色,邊緣菌絲顏色比內(nèi)圈顏色深,基質(zhì)呈褐色;BM2-1,GM2-1-1,MG2-2和MT3-3,菌落為灰白色或灰褐色,中心凸起,邊緣整齊,有明顯的環(huán)狀輪紋;XM1菌落的菌絲初期為白色,后期菌落內(nèi)圈色澤逐漸變暗轉(zhuǎn)為黑褐色或黃褐色,邊緣仍呈白色。

提取12株霉菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,凝膠電泳結(jié)果為12株菌條帶均在600 bp左右(圖1(b)),且條帶清晰,可進(jìn)行下一步測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果整理后在NCBI進(jìn)行Blast對(duì)比,找到同源序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,11株(BM2-1,BM3-2,GM1-1-1,GM1-1-2,GM2-1,MG2-2,MT3-3,XM1,XM2,XM3和XM5)為互隔交鏈孢菌(Alternariaalternata),1株(MG2-1)為蕓苔鏈格孢菌(Alternariabrasicae),表明小麥病變優(yōu)勢(shì)病原菌為鏈格孢菌。

2.2 游離霉菌毒素確證

采用ESI+模式在固體培養(yǎng)基中檢測(cè)并鑒定了7種交鏈孢菌毒素。7種霉菌毒素的名稱(chēng)、化學(xué)式、加合物、保留時(shí)間、質(zhì)荷比等信息見(jiàn)表1。與市售標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比精準(zhǔn)質(zhì)荷比、保留時(shí)間和質(zhì)譜等信息對(duì)鏈格孢霉菌的7種毒素(ALT、ALU、AME、AOH、ATX-Ⅰ、TeA和TEN)進(jìn)行了鑒定和定量,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中鏈格孢毒素提取毒素色譜和質(zhì)譜圖如圖2所示。

表1 鏈格孢毒素自定義數(shù)據(jù)庫(kù)

2.3 隱蔽型毒素篩選與鑒定

前期對(duì)鏈格孢霉菌菌株在固體培養(yǎng)基產(chǎn)毒原始數(shù)據(jù)的初步檢測(cè)顯示,幾種代謝物解離的中性丟失分子質(zhì)量為79.956 8 U,推測(cè)存在SO3結(jié)合的代謝產(chǎn)物。為了充分研究代謝物中是否存在的硫酸鹽結(jié)合,使用MZmine 2軟件對(duì)完整原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行碎片過(guò)濾診斷,得到中性丟失結(jié)果,將失去的相應(yīng)SO3(79.956 8 U)分子質(zhì)量的前體離子進(jìn)行可視化展示(圖3)。在固體培養(yǎng)基中找到了35種硫酸鹽結(jié)合的霉菌毒素,其中PDA培養(yǎng)基中15種、PSA培養(yǎng)基中20種,小麥中未發(fā)現(xiàn)硫酸鹽結(jié)合產(chǎn)物。

圖3 硫酸鹽結(jié)合產(chǎn)物的中性丟失

用Xcalibur軟件進(jìn)一步確證了硫酸鹽結(jié)合化合物篩選結(jié)果,證實(shí)在固體培養(yǎng)基有兩種硫酸鹽結(jié)合的鏈格孢毒素,其出峰時(shí)間分別為6.45 min和9.10 min(圖4(a))。除了以硫酸鹽結(jié)合精確分子質(zhì)量和SO3的準(zhǔn)確中性丟失值為依據(jù)外,還通過(guò)同位素峰確定分子上存在硫原子。在質(zhì)譜中,13C×2同位素峰原子質(zhì)量比單一同位素峰高2.005 U,自然豐度為4.29%的34S的原子質(zhì)量位移比單一同位素質(zhì)量高1.995 U,證實(shí)硫酸化偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)S原子[28](圖4(b))。通過(guò)二級(jí)碎片質(zhì)譜圖對(duì)結(jié)合型毒素進(jìn)行確認(rèn)(圖4(c)、(d)),證實(shí)兩種硫酸鹽結(jié)合的鏈格孢毒素,分別為AOH硫酸鹽和AME硫酸鹽。兩種結(jié)合型毒素的出峰時(shí)間晚于其游離型毒素,與負(fù)模式下硫酸鹽結(jié)合的保留時(shí)間早于游離鏈格孢毒素不同。

圖4 硫酸鹽結(jié)合產(chǎn)物確證

2.4 鏈格孢毒素Heatmap分析

利用R語(yǔ)言軟件基于峰面積建立熱圖,對(duì)鏈格孢霉菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)生毒素的含量和種類(lèi)情況進(jìn)行可視化分析。如圖5所示,鏈格孢霉菌在PDA和PSA培養(yǎng)基中產(chǎn)毒存在差異,所有的菌株均產(chǎn)AOH、AME、ATX-I毒素;只有XM5、XM3、MT3-3不產(chǎn)ALU;除了XM3,其他11株均為產(chǎn)ALT菌株;除了BM2-1、GM2-1、XM2、XM5,其他菌株均產(chǎn)TEN毒素;只有BM2-1、GM1-1-1、GM1-1-2、GM2-1 4株菌株產(chǎn)TeA毒素。而且硫酸鹽結(jié)合的鏈格孢毒素只在PSA培養(yǎng)基中產(chǎn)生,推測(cè)可能與培養(yǎng)基碳源種類(lèi)不同有關(guān),葡萄糖促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng),但是蔗糖更有利于孢子的產(chǎn)生[29],所以PSA中的蔗糖比PDA中的葡萄糖更有利于毒素的產(chǎn)生。

圖5 鏈格孢霉菌在PDA和PSA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢毒素?zé)釄D分析

2.5 小麥萌發(fā)過(guò)程中鏈格孢毒素產(chǎn)生情況分析

在固體培養(yǎng)基中,菌株GM1-1-2產(chǎn)毒素AOH、AME、ALU、ALT、TEN、TeA、ATX-Ⅰ,XM5產(chǎn)毒素AOH、AME、ALT和ATX-Ⅰ;但是在小麥萌發(fā)試驗(yàn)中,GM1-1-2 和XM5試驗(yàn)組只檢測(cè)到毒素AOH、TeA和TEN產(chǎn)生。由表2可知,總體來(lái)看,霉菌毒素隨著時(shí)間增加含量升高。GM1-1-2試驗(yàn)組在第4天檢測(cè)到AOH的產(chǎn)出,隨著時(shí)間增加毒素含量上升,到第10天達(dá)到71 μg/kg;TEN和TeA在第6天開(kāi)始檢出,TEN在第8天含量最高為130 μg/kg,TeA在第10天含量最高達(dá)11151 μg/kg。XM5試驗(yàn)組在第2天檢出AOH和TEN,但是含量較低,AOH在第10天達(dá)到最高含量為89 μg/kg,TEN在第10天含量最高為62 μg/kg;而TeA只在第10天被檢出,含量高達(dá)1 128 μg/kg。

表2 鏈格孢霉菌侵染小麥中霉菌毒素定量結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)山東省東營(yíng)市小麥種植區(qū)病變小麥中致病菌株進(jìn)行分離純化,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)小麥病變的優(yōu)勢(shì)菌株為互隔交鏈孢霉,這與李毅然等[30]對(duì)進(jìn)口小麥攜帶的病原微生物檢測(cè)結(jié)果和匡開(kāi)源等[31]對(duì)陜西大骨節(jié)病區(qū)的小麥樣品檢測(cè)結(jié)果相同。12株鏈格孢霉菌在固體培養(yǎng)基中共檢測(cè)到7種游離鏈格孢毒素(AOH、ALT、ALU、AME、ATX-Ⅰ、TeA、TEN)和2種隱蔽型毒素(AOH-Sulfated和AME-Sulfated)。12株鏈格孢菌產(chǎn)毒能力和種類(lèi)存在差別,這種差異可能與鏈格孢霉產(chǎn)毒基因有關(guān)[32-33]。將2株產(chǎn)毒種類(lèi)不同的鏈格孢霉菌的孢子懸液接種于小麥種子后,在小麥萌發(fā)過(guò)程中只檢測(cè)到毒素AOH、TeA和TEN。鏈格孢霉菌在侵染植物時(shí),病原菌與宿主植物相互調(diào)節(jié)作用可能會(huì)影響毒素的產(chǎn)生,由植物產(chǎn)生的信號(hào)分子或次生代謝產(chǎn)物對(duì)毒素的產(chǎn)生起促進(jìn)或抑制作用[34],因此小麥中鏈格孢毒素的產(chǎn)生與人工培養(yǎng)基中存在差異。

研究結(jié)果表明,互隔鏈格孢菌(Alternariaalternata)是病害小麥的優(yōu)勢(shì)病原菌,可產(chǎn)生鏈格孢毒素。鏈格孢霉菌在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的毒素與在小麥萌發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的毒素不同。因此,研究谷類(lèi)中鏈格孢毒素的發(fā)生規(guī)律,可為減少鏈格孢霉病害導(dǎo)致的谷物品質(zhì)損失提供理論依據(jù)。