高遷移率族蛋白1通過(guò)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的趨化及成骨分化

陳施羊 周愛(ài)國(guó) 閆文龍 張健

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是由于病人骨骼中脂肪細(xì)胞增多、成骨細(xì)胞減少而導(dǎo)致骨量下降、骨脆性增加的一種疾病，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致骨折的發(fā)生，給病人的生活及健康帶來(lái)危害［1］。目前主要分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要包含老年性骨質(zhì)疏松癥（senile osteoporosis，SOP）、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）和特發(fā)性青少年骨質(zhì)疏松癥（idiopathic juvenile osteoporosis，IJO）等，而繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要包含糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）、糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（diabetic osteoporosis，DOP）等。其中SOP 是由于年齡增長(zhǎng)而導(dǎo)致的骨量減少，伴隨著骨微結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致病人易發(fā)生骨折等疾病，對(duì)病人的健康造成威脅［2］。近年來(lái)研究證實(shí)，SOP的發(fā)生、發(fā)展與線(xiàn)粒體自噬密切相關(guān)。線(xiàn)粒體自噬是指將受損線(xiàn)粒體通過(guò)自噬途徑進(jìn)行清除，從而維持胞內(nèi)穩(wěn)定。自噬的形成依賴(lài)多種自噬相關(guān)蛋白的相互作用。PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）和帕金蛋白（Parkin）作為帕金森相關(guān)蛋白，能夠通過(guò)介導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬來(lái)維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定［3］。當(dāng)線(xiàn)粒體損傷時(shí)，PINK1將聚集在線(xiàn)粒體外膜中，通過(guò)PINK1磷酸化和Parkin泛素化而使Parkin從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線(xiàn)粒體外膜，在E3連接酶作用下形成底物多聚泛素鏈（poly-Ub），選擇性自噬接頭蛋白62（P62）通過(guò)與其C 端結(jié)合到線(xiàn)粒體上，并與泛素相關(guān)蛋白結(jié)合；Atg8同源蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）與其N(xiāo) 端結(jié)合而促進(jìn)泛素化蛋白降解，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞中自噬的穩(wěn)定［4］。故探尋調(diào)節(jié)SOP自噬相關(guān)的藥物和靶點(diǎn)對(duì)SOP的治療十分關(guān)鍵。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）不僅具有骨髓基質(zhì)細(xì)胞的各種特性，并且還具有向軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化的功能［5］。高遷移率族蛋白1（High Mobility Group protein B1，HMGBl）是存在于細(xì)胞核中的DNA合成蛋白，能夠在細(xì)胞損傷或活化后從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，參與細(xì)胞自噬、減輕細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)［6-7］。然而，目前關(guān)于HMGBl 調(diào)控hBMSCs的趨化及成骨分化相關(guān)機(jī)制的研究較少，故本研究旨在探討HMGB1 是否通過(guò)PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬影響hBMSCs的趨化及成骨分化。

材料與方法

一、主要試劑及器材

hBMSCs購(gòu)自北京澤平科技有限責(zé)任公司；Animal Total RNA lsolation Kit 購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；riboSCRIPTTMmRNA/lncRNA RT-qPCR Starter Kit 購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Prime-Script RT reagent Kit、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等ELISA 試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6 同系物（Beclin1）、LC3B、Parkin 及P62 等抗體購(gòu)自美國(guó)Abclonal 公司；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）和CCK8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；茜素紅染液購(gòu)自上海阿拉丁公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（QuantStudio TM3）、熱循環(huán)儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 儀器有限公司；低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)美谷分子儀器有限公司；透射電子顯微鏡購(gòu)自日本電子（JEOL）。

二、實(shí)驗(yàn)分組及處理

（一）細(xì)胞培養(yǎng)和分組

用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSCs細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞分為組1：control 組、siRNA-NC 組、siRNAHMGB1 組、pcDNA-NC 組、pcDNA-HMGB1 組；組2：control組、pcDNA-NC組、pcDNA-HMGB1組、pcDNAHMGB1+siRNA-NC 組和pcDNA-HMGB1+siRNAPINK1組。

（二）細(xì)胞轉(zhuǎn)染

control組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不作任何處理；siRNANC 組、siRNA-HMGB1 組、pcDNA-NC 組和pcDNAHMGB1 組將未分化的hBMSCs 細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞接種24 孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h 后，換成無(wú)血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基，按照RiboFect?CP Transfection Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)將siRNA-HMGB1和陰性載體依次轉(zhuǎn)染進(jìn)hBMSCs細(xì)胞；使用HMGB1的全基因序列及空載載體插入pcDNA 3.1 質(zhì)粒中，用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent 按照說(shuō)明書(shū)操作，將其轉(zhuǎn)染至hBMSCs 細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，后換成含有成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（誘導(dǎo)劑濃度：50 mg/mL Vitamin、5 mm β-glycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。pcDNA-HMGB1+siRNA-NC 組、pcDNA-HMGB1+siRNAPINK1 組先將過(guò)表達(dá)的HMGB1 按照上述方法將pcDNA-NC 和pcDNA-HMGB1 轉(zhuǎn) 染 進(jìn)hBMSCs 細(xì) 胞中，后用RiboFect?CP Transfection Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)將siRNA-PINK1及siRNA-NC轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，24 h后換成含有成骨誘導(dǎo)的完全培養(yǎng)基。誘導(dǎo)3天后收取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

三、Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移

將分組1 的細(xì)胞消化后置于Transwell 小室中，下室中加入5%的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后移除Transwell 小室，后將細(xì)胞用4%的甲醛固定20 min后，用1%的結(jié)晶紫染色后進(jìn)行拍照，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)量。

四、透射電鏡檢測(cè)自噬體及線(xiàn)粒體數(shù)目

將分組1細(xì)胞用3%的戊二醛固定和1%四氧化鋨再固定后，經(jīng)過(guò)脫水、滲透、包埋，采用醋酸鈾染色10～15 min，再用檸檬酸鉛染色1～2 min，后用透射電鏡對(duì)銅網(wǎng)進(jìn)行圖像采集。

五、Western Blot檢測(cè)線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

提取分組1 細(xì)胞的總蛋白后，用BAC 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，后通過(guò)SDS-凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，后加入稀釋后的一抗（Beclin-1、LC3B、Parkin及P62 抗兔），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），室溫孵育2～3 h，ECL顯色試劑盒顯色后用凝膠成像儀拍照，分析其灰度值。以βactin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

六、茜素紅染色測(cè)定鈣結(jié)節(jié)數(shù)目

將分組2 的細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后用預(yù)冷的PBS清洗，用多聚甲醛于37 ℃固定15 min后用PBS洗滌，再加入2%的茜素紅染液染色10 min，用PBS 洗滌后用顯微鏡觀察細(xì)胞中鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。

七、ELISA檢測(cè)細(xì)胞中ALP、OPN的表達(dá)

用ELISA 法檢測(cè)分組2 細(xì)胞中成骨分化（ALP、OPN）相關(guān)因子的表達(dá)，操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組的結(jié)果。

八、RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中基因的表達(dá)

采用RT-qPCR 檢測(cè)分組1 細(xì)胞中HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量和分組2細(xì)胞中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Recombinant Runt Related Transcription Factor 2，RUNX2）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix）、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT enhancer binding proteinα，C/EBPα）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）mRNA 相對(duì)表達(dá)量。按照RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組細(xì)胞提取總RNA，后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA 濃度。并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，后配置20 μL 的體系，反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共45個(gè)循環(huán)，引物由（上海）生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。以β-actin 為內(nèi)參，使用Thermo Scientific PikoReal 軟件分析PCR 過(guò)程各檢測(cè)樣本的CT 值，以2-△△ct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

九、統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 8.4.3 軟件（GraphPad Software 公司，美國(guó)）進(jìn)行作圖與統(tǒng)計(jì)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較用One-way ANOVA。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示有顯著性差異。

結(jié) 果

一、HMGB1通過(guò)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬對(duì)hBMSCs的趨化作用

（一）各組細(xì)胞中HMGB1 mRNA含量測(cè)定

通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)各組中HMGB1水平結(jié)果可知，與siRNA-NC 組比較，siRNA-HMGB1 組HMGB1含量降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC 組比較，pcDNAHMGB1組HMGB1水平顯著升高（P＜0.01，圖1）。

圖1 各組細(xì)胞中HMGB1 mRNA水平比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

（二）HMGB1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

通過(guò)Transwell 檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力結(jié)果可知，與siRNA-NC組比較，siRNA-HMGB1組細(xì)胞遷移數(shù)量降低（P＜0.01）；與pcDNA-NC 組比較，pcDNAHMGB1組細(xì)胞遷移數(shù)量增多（P＜0.01，圖2）。

圖2 各組細(xì)胞遷移能力比較（比例尺=100 μm，**P＜0.01）

（三）HMGB1 對(duì)PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白的影響

hBMSCs 中線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與siRNA-NC 組比較，siRNA-HMGB1 組細(xì)胞中Beclin-1、LC3B-II/I的表達(dá)降低，Parkin及P62的表達(dá)增高（P＜0.05）；與pcDNA-NC 組比較，pcDNAHMGB1 組細(xì)胞中Beclin-1、LC3B-II/I 的表達(dá)顯著升高，Parkin及P62的表達(dá)降低（P＜0.01，圖3）。

圖3 各組細(xì)胞中PINK1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)（*P＜0.05，**P＜0.01）

（四）HMGB1對(duì)各組細(xì)胞線(xiàn)粒體自噬的影響

通過(guò)透射電鏡觀察各組細(xì)胞中的線(xiàn)粒體自噬情況可知，與siRNA-NC組比較，siRNA-HMGB1組細(xì)胞中線(xiàn)粒體自噬小體數(shù)目明顯降低；與pcDNA-NC 組比較，pcDNA-HMGB1 組細(xì)胞中線(xiàn)粒體自噬小體數(shù)目明顯增加（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞線(xiàn)粒體自噬情況（×20 000），紅色箭頭表示線(xiàn)粒體自噬

二、HMGB1通過(guò)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬對(duì)hBMSCs成骨分化的影響

（一）各組細(xì)胞中鈣結(jié)節(jié)數(shù)量變化

control 組細(xì)胞未出現(xiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)，與pcDNANC 組比較，pcDNA-HMGB1 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多；與pcDNA-HMGB1+siRNA-NC 組比較，pcDNA HMGB1+siRNA-PINK1組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少（圖5）。

圖5 各組細(xì)胞中鈣結(jié)節(jié)數(shù)目變化（茜素紅染色，×40）

（二）Osterix及RUNX2的mRNA含量測(cè)定

與pcDNA-NC組比較，pcDNA-HMGB1組Osterix及RUNX2 的mRNA 含量增高（P＜0.01）；與pcDNA HMGB1+siRNA-NC 組比較，pcDNA HMGB1+siRNAPINK1 組Osterix 及RUNX2 的mRNA 含量降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組細(xì)胞中Osterix、RUNX2的mRNA含量（*P＜0.05，**P＜0.01）

（三）對(duì)各組細(xì)胞中成骨分化標(biāo)志物的影響

和pcDNA-NC組比較，pcDNA-HMGB1組細(xì)胞中ALP、OPN 的 表 達(dá) 升 高（P＜0.01）；和pcDNA -HMGB1+siRNA-NC組比較，pcDNA-HMGB1+siRNAPINK1 組細(xì)胞中ALP、OPN 的表達(dá)降低（P＜0.01，圖7）。

圖7 各組細(xì)胞中ALP、OPN的表達(dá)水平比較（**P＜0.01）

（四）對(duì)各組細(xì)胞中成脂分化標(biāo)志物的影響

通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中C/EBPα、PPARγ等成脂分化標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示和pcDNA-NC組比較，pcDNA-HMGB1組細(xì)胞中PPARγ、C/EBPα 的 表 達(dá) 降 低（P＜0.05，圖8）；和pcDNAHMGB1+siRNA-NC組比較，pcDNA-HMGB1+siRNAPINK1 組細(xì)胞中PPARγ、C/EBPα的表達(dá)增加（P＜0.05）。

圖8 各組細(xì)胞中C/EBPα、PPARγ的表達(dá)水平比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

討 論

OP 主要是由于骨組織退化及骨脆性增強(qiáng)而導(dǎo)致的中老年常見(jiàn)疾病，避免骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生需要維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，即維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞平衡［8-9］。hBMSCs 作為機(jī)體維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞之一，具有成脂分化及成骨分化的作用，hBMSCs 的分化紊亂被認(rèn)為是造成骨質(zhì)疏松癥的重要原因［10-11］。骨穩(wěn)態(tài)還與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，細(xì)胞自噬是細(xì)胞面對(duì)外界應(yīng)激時(shí)維持細(xì)胞及組織穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過(guò)程［12］。因此，本研究通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)hBMSCs 成骨分化相關(guān)作用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步明確骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制，探尋新的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

高遷移率族蛋白（HMG）是由HMGB1-4 組成的DNA核蛋白［13］。其中HMGBl作為含量最高、存在最廣泛的蛋白，能夠在機(jī)體受到損傷時(shí)釋放到細(xì)胞外，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及促血管生成等方面起著重要作用［4］。研究表明HMGBl 與自噬存在密切關(guān)系，HMGBl 能夠與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2 相互作用，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬起促進(jìn)作用［14］。下調(diào)細(xì)胞中HMGBl的表達(dá)能夠抑制神經(jīng)元細(xì)胞的自噬，以達(dá)到改善腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷目的［15］。自噬是真核細(xì)胞囊泡內(nèi)容物被降解的一個(gè)過(guò)程，是指在外界刺激下清除損傷的線(xiàn)粒體，以達(dá)到維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的目的［16］。目前已經(jīng)鑒定出Parkin、Beclin-1、P62 等蛋白在自噬體導(dǎo)向線(xiàn)粒體中占據(jù)重要地位，而自噬體蛋白LC3與線(xiàn)粒體受體相互作用在靶向自噬體過(guò)程中也起著重要作用［17-18］。本研究結(jié)果表明，與pcDNA-NC 組相比，pcDNA-HMGB1 組線(xiàn)粒體自噬水平增加；與siRNA-NC組相比，siRNA-HMGB1組線(xiàn)粒體自噬水平降低，表明HMGB1 能通過(guò)線(xiàn)粒體自噬促進(jìn)hBMSCs的趨化作用。

PINK1 屬于Ser/thr-蛋白激酶家族，PINK1 的催化活性是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其最為典型的便是PINK1 介導(dǎo)的Parkin 的激活及其磷酸化研究［19］。PINK1 作為啟動(dòng)線(xiàn)粒體自噬的調(diào)節(jié)因子，能夠泛素化或磷酸化修飾Parkin，接頭蛋白P62 在線(xiàn)粒體周?chē)奂笈cLC3 特異性結(jié)合來(lái)促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬［20］。Runx2 作為早期成骨細(xì)胞標(biāo)志物，能夠協(xié)同Osterix調(diào)節(jié)下游因子（如ALP 等）的表達(dá)［21］。ALP 和OPN作為反映成骨細(xì)胞分化能力的重要指標(biāo)，是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志［22-23］。而在OP 形成過(guò)程中骨量的下降常伴隨著脂肪生成同時(shí)存在，C/EBPα 作為CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族中的一員，具有調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化的作用。PPARγ作為脂肪形成調(diào)節(jié)劑，可與C/EBPα相互作用從而促進(jìn)干細(xì)胞脂肪分化。有研究表明，PINK1/Parkin在hBMSCs的成骨和成脂分化方面也起著重要作用［24-25］。Zhang 等［24］研究表明，上調(diào)Parkin 的表達(dá)能夠增強(qiáng)自噬及β-Catenin 信號(hào)的激活，從而促進(jìn)hBMSCs 成骨分化和骨再生。Fei等［26］研究表明在hBMSCs中敲低PINK1的表達(dá)，能夠抑制PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬從而抑制hBMSCs 的成骨分化。并且Shiau 等［25］研究表明通過(guò)抑制PARL-PINK1-Parkin 途徑，能夠抑制PPARγ的表達(dá)，終止脂肪細(xì)胞的形成。本研究結(jié)果顯示，與pcDNA-NC 組相比，pcDNA-HMGB1 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量、Osterix 及RUNX2 含量、ALP 及OPN 的表達(dá)升高；與pcDNA HMGB1+siRNA-NC 組比較，pcDNA-HMGB1+siRNA-PINK1組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量、Osterix及RUNX2 含量、ALP 及OPN 的表達(dá)降低。表明HMGB1 能夠通過(guò)PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬而促進(jìn)hBMSCs的成骨分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞生物學(xué)方面證實(shí)過(guò)表達(dá)HMGBl 可通過(guò)促進(jìn)PINK1/Parkin 通路激活，從而介導(dǎo)細(xì)胞線(xiàn)粒體自噬，起到促進(jìn)hBMSCs 的趨化及成骨細(xì)胞分化的作用，表明HMGBl可作為骨質(zhì)疏松的潛在治療靶點(diǎn)。