二十二碳六烯酸拮抗動脈粥樣硬化預(yù)防腦卒中的機(jī)制

宋 婷 莊文欣 孫秀寧 王炎強

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性、進(jìn)行性的炎性狀態(tài),以血管炎和內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積為特征,是缺血性腦卒中的主要致病因素。動脈粥樣硬化的特點是大量的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)被巨噬細(xì)胞(macrophage,Mφ)吸收轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,形成脂肪條紋,血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)遷入內(nèi)膜吞噬脂質(zhì)并形成纖維斑塊。當(dāng)斑塊破裂時,形成血凝塊,阻塞血管,減少血流。內(nèi)皮功能障礙、炎癥、血管平滑肌細(xì)胞增殖等細(xì)胞反應(yīng)可引起血管壁的慢性病理重塑,促進(jìn)動脈粥樣硬化和血栓事件,導(dǎo)致腦血管疾病[1]。

ω-3 PUFAs與ω-6 PUFAs競爭替代膜磷脂中花生四烯酸,從而減少二十烷酸的產(chǎn)生,產(chǎn)生抗炎作用。研究證明補充ω-3 PUFAs可以降低頸內(nèi)動脈粥樣硬化和顱內(nèi)動脈粥樣硬化的風(fēng)險,降低AS相關(guān)性血栓卒中發(fā)生[2～4]。DHA是ω-3 PUFAs的亞型之一,通過相關(guān)分子和信號通路作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)、Mφ和VSMC,緩解炎性反應(yīng)、激活細(xì)胞自噬、抗VSMC轉(zhuǎn)分化等,來改善內(nèi)皮功能障礙,對降低頸動脈及顱內(nèi)動脈粥樣硬化風(fēng)險、預(yù)防缺血性腦卒中發(fā)揮作用[5, 6]。

一、DHA改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙

1.DHA介導(dǎo)白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)對ECs剪切應(yīng)力的作用:IL-1的主要作用是調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移和積聚,也會促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙,這是AS發(fā)病的一個主要過程,所以IL-1在AS發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。血流流經(jīng)血管時形成流體剪切應(yīng)力,ECs可對該剪切應(yīng)力的微小變化做出反應(yīng),造成形態(tài)受損和功能障礙。血管AS形成的難易程度取決于血管的解剖位置和血流動力學(xué)模式。在直血管中,層狀剪切應(yīng)力(laminar shear stress,LSS)對ECs有保護(hù)作用,此處不易形成動脈斑塊;在分叉或彎曲血管,振蕩剪切應(yīng)力(oscillatory shear stress,OSS)升高類二十烷酸代謝產(chǎn)物如PGD2、PDE2等導(dǎo)致血管炎癥,引起血管內(nèi)皮障礙。Mabruka等[7]研究發(fā)現(xiàn)DHA改善內(nèi)皮功能的機(jī)制之一是介導(dǎo)IL-1作用降低OSS,可能通過以下機(jī)制作用:減少IL-1誘導(dǎo)的IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、分泌因子等生物趨化劑;通過黏度的變化改變血管系統(tǒng)中的血流模式,降低OSS、下調(diào)血壓,減輕血流對血管壁的沖擊所致內(nèi)皮損傷;促炎性細(xì)胞因子IL-1β主要由AS斑塊中巨噬細(xì)胞激活釋放,它增加了輔助型T細(xì)胞的激活,Th17誘導(dǎo)免疫反應(yīng),促進(jìn)斑塊形成,而DHA抑制IL-1激活,使局部的IL-1β表達(dá)降低,從而防止AS斑塊形成。

2.DHA抗氧化應(yīng)激作用:機(jī)體氧化產(chǎn)生的自由基其產(chǎn)生和吸收之間不平衡導(dǎo)致自由基過量,損害內(nèi)皮細(xì)胞,這是AS的誘發(fā)因素。氧化損傷發(fā)生在AS的不同階段,早期損傷由于過度暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)而損害內(nèi)皮細(xì)胞。參與AS血栓形成的ROS的主要來源是NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和脂氧合酶等促氧化系統(tǒng)[8]。

(2)eNOS引起的氧化應(yīng)激:NO多在NOS催化下產(chǎn)生,由ECs分泌,可調(diào)節(jié)血管張力、結(jié)構(gòu)在局部改變血管彈性。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致血管擴(kuò)張因子的合成減少,反之,收縮因子的產(chǎn)生增加,導(dǎo)致血管張力增加,甚至引起明顯的血管收縮[10]。Tannaz等[11]先以飽和脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid,PAL)誘導(dǎo)AS模型,再用40mmol/L DHA孵育來研究DHA對AS的作用機(jī)制,結(jié)果表明PAL對ECs有毒性作用,而DHA可改善PAL引起的ECs活力下降,提高存活量。Saeede等[12]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)暴露于40mmol/L DHA后,可提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活力,下調(diào)血清正五聚體蛋白3(pentraxin3,PTX3)、eNOS表達(dá),NO水平增加,纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、血小板源性生長因子β(platelet derived growth factor β,PDGFβ)和纖維蛋白原α1(fibrinogen α1,FGA1)的表達(dá)降低。其中,PTX3在Mφ、ECs、VSMCs中均有表達(dá),隨炎性狀態(tài)而增加,反過來與Ox-LDL作用加劇AS[13, 14]。PAI-1可能增強凝血功能,增加血栓形成的風(fēng)險。PDGFβ參與VSMC遷移、血小板聚集。FGA1可改變血管內(nèi)皮通透性,易導(dǎo)致動脈斑塊的發(fā)生,纖維蛋白原與白蛋白比值(fibrinogen to albumin ratio, FAR)可以較好地預(yù)測頸動脈斑塊的不穩(wěn)定性[15]。炎性反應(yīng)、凝血異常、血壓過高和血小板功能是影響AS進(jìn)展的因素,DHA通過調(diào)控這些因素的基因以延緩AS改變。另外,Abriz等[16]研究認(rèn)為糖尿病易發(fā)生AS可能由于胰島素干擾NO的釋放,研究了小鼠PAL誘導(dǎo)的AS模型中單用或聯(lián)用胰島素、DHA,結(jié)果顯示胰島素、DHA處理組可減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生、促進(jìn)NO的生成和生物利用度,改變ECs經(jīng)PAL處理后的動態(tài)生長和功能障礙活性。

(3)MPO引起的氧化應(yīng)激:MPO在炎性條件下從中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中釋放,并在細(xì)胞外液中促進(jìn)氧化應(yīng)激。MPO可氧化LDL形成Mox-LDLs,引起ECs促炎效應(yīng),激活巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞,促進(jìn)動脈斑塊形成過程。DHA及其衍生物保護(hù)素DX(protectin DX,PDX)通過抑制NOX的激活和減少MPO的釋放,阻止了一系列級聯(lián)反應(yīng);Mox-LDLs對DHA合成溶解素D1(resolvin D1,RVD1)中起重要作用,RVD1可以在納克/毫升(ng/ml)水平上促進(jìn)炎癥緩解[17]。

3.DHA介導(dǎo)Ang-2/Tie-2凋亡通路:血管緊張素-1/酪氨酸激酶受體-2(angizopoietin-1/tyrosine kinase receptor-2,Ang-1/Tie-2)通路參與ECs活化、遷移、增殖和分化過程。Ang-1主要來源于血管平滑肌細(xì)胞、血管周細(xì)胞,誘導(dǎo)Tie-2受體的自磷酸化,激活與細(xì)胞存活相關(guān)的磷酸肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase b, PI3K/Akt)信號通路,增加相關(guān)蛋白的表達(dá)、穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接[18]。Ang-2存在于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade體中,在缺氧或炎癥刺激時,Ang-2釋放與Ang-1競爭Tie-2受體的結(jié)合,導(dǎo)致Tie-2自磷酸化減少、激活受損。Ang-2水平受DHA抑制,作用機(jī)制可能與環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、PGE2和PGI2水平有關(guān)。DHA與其受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)結(jié)合后,PPARγ會從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,通過調(diào)控COX-2負(fù)性調(diào)節(jié)Ang-2和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的轉(zhuǎn)錄。Yu等[19]研究表明DHA減少Ang-2(Ang-1/Ang-2比值升高)和VEGF的合成,進(jìn)而調(diào)控Ang-1/ Tie-2通路,減少動脈ECs凋亡數(shù)量,穩(wěn)定人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接。

4.DHA調(diào)控細(xì)胞焦亡通路:細(xì)胞焦亡是一種炎癥調(diào)控性細(xì)胞死亡,腦卒中、感染等刺激炎性胱天蛋白酶(caspase)活化,導(dǎo)致Gasdermin(GSDM)蛋白家族激活形成質(zhì)膜孔道,經(jīng)過一系列反應(yīng)最終破裂釋放炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、高遷移率族蛋白B1等。

高同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)是動脈粥樣硬化的獨立危險因素,能抑制ECs生長,導(dǎo)致內(nèi)皮損傷后的修復(fù)受損、血管重塑,并能協(xié)同內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)焦亡[20]。NOD樣受體3(nod-like receptor3,NLRP3)通過連接蛋白與caspase-1結(jié)合,激活依賴于caspase-1活化的炎性小體,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HCY協(xié)同LPS導(dǎo)致血管炎癥和AS的主要機(jī)制可能是增加NLRP3的含量。另外,HCY誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化梯度的變化可導(dǎo)致線粒體功能障礙以及內(nèi)皮功能障礙,因為細(xì)胞色素C釋放和caspase-1激活,ECs中Bax/Bcl-2比率增加,導(dǎo)致caspase-9/3級聯(lián)激活和EC凋亡[21]。相反,對中老年高脂血癥的臨床研究表明,血漿HCY水平和血漿DHA磷脂水平之間存在負(fù)相關(guān)。為驗證兩者之間的關(guān)系及作用機(jī)制,Huang等[22]測定了用DHA處理后的HepG2細(xì)胞的HCY合成代謝酶的表達(dá)水平,結(jié)果表明DHA能上調(diào)代謝酶胱硫氨酸-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)和亞甲基四氫葉酸還原酶(5-methyltetrahydrofolate reductase,MTHFR)、下調(diào)合成酶甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(methionine adenosyltransferase,MAT)的mRNA表達(dá),從而降低HCY濃度,阻止HCY誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[14]。

5.DHA 調(diào)節(jié)AS信號通路的其他機(jī)制:信號通路可觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)致ECs損傷、功能障礙,進(jìn)一步引起AS,而DHA可通過調(diào)節(jié)形成AS過程中的信號通路來減少內(nèi)皮細(xì)胞死亡、促進(jìn)內(nèi)皮受損修復(fù)。DHA降低促炎性基因(如IL-1R1、IL-2、IL-4、TNF-α等)和黏附分子[如CD44、選擇素E、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adheson molecule-1,VCAM-1)、細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(inter cellular adhesion molecule-1,ICAM-1)等]表達(dá)水平,控制炎性反應(yīng),減少白細(xì)胞與ECs相互黏附作用,ECs增殖增加[23]。DHA減少促凋亡基因(BAX、BID)的表達(dá),激活抗凋亡基因(Bcl-2、CCL2、CFLAR),從而減少ECs的凋亡缺陷。細(xì)胞外基質(zhì)的降解、斑塊的不穩(wěn)定性與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)有關(guān),DHA可能通過降低ECs中MMP1、MMP3水平來防止細(xì)胞外基質(zhì)降解并維持ECs之間的連接。另外,DHA提高vwf和kdr/VEGFR-2的轉(zhuǎn)錄,可能參與血管生成。

二、DHA調(diào)控巨噬細(xì)胞作用

1．DHA介導(dǎo)TLR/NF-κB抗炎信號通路:動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的大量巨噬細(xì)胞來源于血管內(nèi)Mφ,它們可以通過細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體(如炎性小體) 和細(xì)胞膜上的模式識別受體如Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)被激活。DHA介導(dǎo)多種信號途徑,調(diào)節(jié)關(guān)鍵的動脈粥樣硬化基因,抑制促炎因子的激活,減少炎性反應(yīng)。

TLR4/核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路具有重要促炎作用,因此可能對AS的形成和進(jìn)展也有重要影響,其中TLR4在ECs、Mφ和VSMCs中均有表達(dá)。當(dāng)脂多糖結(jié)合TLR4時,脂多糖結(jié)合蛋白(TLR4/CD14/LBP)復(fù)合體參與髓樣分化因子88(myeloid differentiation fator,MYD88)啟動下游信號級聯(lián)(信號傳遞通路為MYD88→IRAK1/IRAK4復(fù)合物→TRAF6→TAK1/TAB2復(fù)合物)來磷酸化炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制單位IB,從而觸發(fā)NF-κB并激活編碼促炎因子的基因,控制多種細(xì)胞因子的表達(dá)。DHA可通過與G蛋白偶聯(lián)受體-120結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1(TGF-β activated kinase-1,TAK1)對IκB激酶(inhibitor of IκB kinase,IKK)的磷酸化,從而抑制NF-κB的下游,減少促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、MCP-1、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生[24]。

TLR2/4-絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)是誘導(dǎo)動脈炎癥的另一信號級聯(lián)通路。TLR2/4激活MYD88/TIRAP復(fù)合物,導(dǎo)致激活的級聯(lián)效應(yīng)(通過MYD88→IRAK1/IRAK4→TRAF6→TAK1/TAB2復(fù)合物),而TAK1磷酸化激活ERK、MEK、JNK和p38。這些活化的MAPK可結(jié)合和刺激其他激酶靶點,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)作用于激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)調(diào)控促炎因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外,NF-κB也參與TLR2/4-MAPK的下游信號通路。

2.DHA激活巨噬細(xì)胞自噬作用:缺血性腦卒中時,神經(jīng)細(xì)胞的缺血和缺氧會引發(fā)自噬,自噬也會清除受損的細(xì)胞器,并利用分解的原料和能量幫助大腦短期克服缺血造成的能量不足。在人類及老鼠的AS斑塊中均發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)和銜接蛋白螯合體1(sequestosome-1,SQSTM1/p62),LC3-Ⅱ參與了自噬小體的形成,而SQSTM1/p62輸送底物至自噬體降解[25]。Wang等[26]在FO飲食(10%熱量的棕櫚油+10%熱量的魚油)喂養(yǎng)的骨髓特異自噬相關(guān)基因Atg5缺失的ILD-/-小鼠中,發(fā)現(xiàn)骨髓自噬基因缺乏顯著抑制FO誘導(dǎo)的AS保護(hù),如中性脂質(zhì)積累、壞死核心形成、CD68+及CD3+細(xì)胞染色,促炎基因C-X-C基序趨化因子配體10(c-x-c motif chemokine ligand 10,CXCL10)分泌增加。DHA可能通過SQSTM1/p62途徑激活Mφ自噬,激活了紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2(nuclear factor, erythroid 2 like 2, NFE2L2/NRF2),NFE2L2的表達(dá)與抗炎型Mφ形成相關(guān),同時抑制了CXCL10的活化。因此,Mφ的自噬可能通過以下機(jī)制保護(hù)AS:自噬增強Mφ的胞質(zhì)作用,促進(jìn)細(xì)胞生存;Mφ將脂滴運送到溶酶體,在那里被水解為游離膽固醇,促進(jìn)泡沫細(xì)胞ABCA-1依賴性膽固醇外流,降低泡沫細(xì)胞的形成速度;自噬減少線粒體ROS的產(chǎn)生和釋放,防止線粒體功能紊亂;Mφ分為促炎表型(M1)和抗炎表型(M2),自噬可激活M2型和抑制M1型激活抗炎;自噬參與抑制NLRP3炎性小體,減少細(xì)胞凋亡。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性對自噬體的形成和成熟至關(guān)重要,DHA可抑制因腦缺血高表達(dá)的mTOR,提高自噬水平,從而保護(hù)腦組織。孫而藝等[27]建立了SD大鼠永久性局灶腦梗死模型,證明DHA負(fù)性調(diào)控mTOR信號通路,激活細(xì)胞自噬,從而減輕缺血半暗帶區(qū)的腦組織損傷。

三、DHA對抗血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換

收縮型VSMC可在AS過程中轉(zhuǎn)化為合成型。VSMC遷移至動脈病變部位后,能合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,交聯(lián)形成纖維蛋白,這是AS發(fā)生的基礎(chǔ)之一。DHA可對抗VSMC表型轉(zhuǎn)換,該調(diào)控作用可能通過參與不穩(wěn)定斑塊的形成的蛋白激酶α2介導(dǎo)。此外,TNF-α可能參與VSMC表型轉(zhuǎn)化和血管重塑,VSMC轉(zhuǎn)化為合成型,增殖性合成和纖維化交聯(lián)增加,形成新內(nèi)膜。而TNF-α誘導(dǎo)的COX-2也在VSMC表型轉(zhuǎn)化中起重要作用,COX-2調(diào)節(jié)血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)和PGD2的產(chǎn)生,并調(diào)節(jié)收縮性VSMC向合成表型的去分化,這是由PGD2調(diào)節(jié)ERK信號通路實現(xiàn)的。前面DHA抗炎作用中已經(jīng)提及,DHA可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路基因抑制TNF-α的表達(dá),故能對抗VSMC的表型轉(zhuǎn)換,從而抗AS、預(yù)防腦卒中。

綜上所述,DHA不僅對缺血性腦卒中有神經(jīng)保護(hù)作用,而且通過其代謝物和衍生物的直接和間接作用,減少受損動脈中的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和自噬,從而有效防治缺血性腦卒中。因動脈粥樣硬化是多因素、多環(huán)節(jié)的病變過程,其形成機(jī)制是相互聯(lián)系的,如氧化應(yīng)激能激活內(nèi)皮細(xì)胞缺陷自噬,自噬能抑制焦亡通路中炎性小體的激活,炎性小體與炎性反應(yīng)和細(xì)胞焦亡都密切相關(guān),其作用通路之間的聯(lián)系、抗AS作用的治療靶點及DHA的給藥時間、最佳劑量濃度等仍需進(jìn)一步探索。