miR-24-3p、Smad5與骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合的相關(guān)性

賈金龍 王朝陽 孫軍健 賈永鵬 賴愛寧 周麗英

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是臨床常見的因骨量減低、骨密度下降等異常代謝導(dǎo)致骨脆性增加的全身性骨骼系統(tǒng)疾病[1]。骨質(zhì)疏松患者的骨折發(fā)生率較高,其中,最常見的骨折部位為脊柱。骨質(zhì)疏松性脊柱骨折(osteoporosis fractures,OPF)的發(fā)生率隨年齡的增長(zhǎng)而增加,致死率也相應(yīng)增高,且患者常伴隨急、慢性疼痛等情況,嚴(yán)重影響其日常生活能力[2]。目前,臨床上對(duì)骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者的治療方式分為手術(shù)治療和保守治療,而大多數(shù)患者采用經(jīng)皮球囊擴(kuò)張椎體成形術(shù)或經(jīng)皮椎體成形術(shù)(percutaneous vertebro plasty,PVP)等手術(shù)治療。PVP雖然比保守治療效果更好等優(yōu)勢(shì),但仍有骨水泥滲漏等并發(fā)癥產(chǎn)生,且隨著術(shù)后愈合時(shí)間的延長(zhǎng),患者的預(yù)后情況越差,再次發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)越高[3]。

在骨折愈合過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖與分化起決定性作用,骨密度能夠反映成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性。研究表明,miR-24-3p作為miR-24家族成員之一,可以發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng),與骨質(zhì)疏松性骨折愈合和骨密度密切相關(guān)[4,5]。另有研究表明,Smads 蛋白家族在骨重建中至關(guān)重要,Smad5磷酸化水平隨年齡的增長(zhǎng)而降低,抑制成骨細(xì)胞的生成[6]。miR-24-3p、Smad5可能與PVP術(shù)后骨折愈合有一定的關(guān)系,因此,本研究旨在探討miR-24-3p、Smad5與骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.研究對(duì)象:2019年10月～2021年10月收治的骨質(zhì)疏松性脊柱骨折且接受PVP治療的患者總共186例,按照入選標(biāo)準(zhǔn)排除88例,按照隨機(jī)數(shù)字表法選取98例患者作為研究對(duì)象,并依照術(shù)后3個(gè)月骨折愈合情況將患者分為延遲組(n=26)和愈合組(n=72)。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者年齡≥60歲;②符合《骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折診療與管理專家共識(shí)》的標(biāo)準(zhǔn),均診斷為骨質(zhì)疏松性脊柱骨折[7];③首次接受骨折手術(shù)治療且無PVP手術(shù)禁忌證;④臨床病歷資料和術(shù)后隨訪資料完整;⑤所有患者及家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①病理性脊柱骨折;②有手術(shù)禁忌證者;③神經(jīng)根或脊髓受損者;④嚴(yán)重肝腎功能障礙或心腦血管疾病者;⑤認(rèn)知功能障礙或患有精神疾病者。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):ZYEG2019-056)。兩組患者一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,詳見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.儀器與試劑:miR-24-3p、Smad5試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司;RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo FisherScientific公司;Prodigy Primo X線骨密度檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)GE公司。

3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-24-3p、Smad5mRNA表達(dá)水平:于術(shù)后3個(gè)月采集所有患者空腹時(shí)靜脈血5ml,以3000r/min離心10min后收集上清液,并于-70℃冰箱中保存。血清中的總RNA采用RNA提取試劑盒提取,并依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后用合成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為dNTP混合液3μl,10×PCR緩沖液2.5μl,上下游引物各0.5μl,TaqDNA聚合酶1μl,Mg2+1.5μl,cDNA1μl,加焦炭酸二乙酯水至總體積為25μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 1min,95℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s,40個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。以U6為內(nèi)參用熒光定量PCR儀檢測(cè),最后用2-△△CT計(jì)算miR-24-3p、Smad5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

4.骨密度檢測(cè):所有患者于術(shù)后3個(gè)月,采用Prodigy Primo X線骨密度檢測(cè)儀檢測(cè)所有患者腰椎L2～4和股骨頸的骨密度(bone mineral density,BMD)。參照中國(guó)人骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)兩組患者BMD值進(jìn)行評(píng)估。

5.骨折愈合指標(biāo)檢測(cè):所有患者于術(shù)后3個(gè)月采用X線檢查側(cè)位腰椎,在X線片上測(cè)量患者椎體前緣的高度,同時(shí)測(cè)量患者凸畸形角(cobb angle,Cobb角)變化;采用Oswestry功能障礙指數(shù)(oswestry disability index,ODI)評(píng)估患者腰部功能障礙情況和活動(dòng)受限程度,得分越高,表明患者癥狀越嚴(yán)重;采用視覺模擬量表(visualanalogue scale,VAS)評(píng)分評(píng)估患者疼痛程度,總評(píng)分為0～10分,評(píng)分越高,疼痛程度越嚴(yán)重,0分為無痛,1～3分為輕度疼痛,4～6分為中度疼痛,7～10為重度疼痛。

6.骨折愈合評(píng)估[9]:術(shù)后3個(gè)月是評(píng)估所有患者的脊椎活動(dòng)度,即 X 線測(cè)量的坐位與仰臥位之間椎體前緣高度變化。當(dāng)患者脊椎活動(dòng)度≤1.0mm,且X線顯示仰臥位無椎內(nèi)裂隙視為骨折愈合,詳見圖1。

結(jié) 果

1.兩組患者血清中miR-24-3p、Smad5 mRNA表達(dá)比較:兩組患者術(shù)后3天 的miR-24-3p、Smad5 mRNA表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組患者術(shù)后3個(gè)月的miR-24-3p表達(dá)水平明顯低于術(shù)后3天,且愈合組明顯低于延遲組(P<0.05);兩組患者術(shù)后3個(gè)月的Smad5 mRNA表達(dá)水平明顯高于術(shù)后3天,且愈合組明顯高于延遲組(P<0.05),詳見表2。

表2 兩組患者miR-24-3p、Smad5 mRNA表達(dá)水平的比較

2.兩組患者腰椎和股骨頸BMD的比較:與同組內(nèi)術(shù)前比較,術(shù)后3個(gè)月兩組患者腰椎BMD、股骨頸BMD均明顯升高(P<0.05);與愈合組術(shù)前比較,延遲組術(shù)前腰椎BMD、股骨頸BMD均明顯降低(P<0.05);與愈合組術(shù)后3個(gè)月比較,延遲組術(shù)后3個(gè)月腰椎BMD、股骨頸BMD均明顯降低(P<0.05),詳見表3。

表3 兩組患者骨密度情況的比較

3.兩組患者術(shù)后骨折愈合情況的比較:與愈合組比較,延遲組患者術(shù)后3個(gè)月椎體前緣高度恢復(fù)率降低,而Cobb角、ODI、VAS評(píng)分均明顯升高(P<0.05),詳見表4。

表4 兩組患者術(shù)后骨折愈合情況的比較

4.miR-24-3p、Smad5與骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合的相關(guān)性:Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后3個(gè)月miR-24-3p與椎體前緣高度無明顯相關(guān)性(P>0.05);患者術(shù)后miR-24-3p與腰椎BMD、股骨頸BMD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與Cobb角、ODI、VAS評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05);患者術(shù)后Smad5 mRNA與腰椎BMD、股骨頸BMD、椎體前緣高度恢復(fù)率呈正相關(guān)(P<0.05),與Cobb角、ODI、VAS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),詳見表5。

5.miR-24-3p、Smad5預(yù)測(cè)術(shù)后骨折愈合的ROC曲線分析:ROC曲線分析顯示,miR-24-3p曲線下面積為0.885,以最大約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的截?cái)嘀禐?.325,Smad5曲線下面積0.881,以最大約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的截?cái)酁?.445,詳見表6、圖2。

圖2 miR-24-3p、Smad5 ROC曲線圖

表6 miR-24-3p、Smad5預(yù)測(cè)術(shù)后骨折愈合的ROC曲線分析

討 論

骨質(zhì)疏松性脊柱骨折在老年群體較為常見,主要臨床表現(xiàn)為腰背酸痛、脊柱生理彎曲改變、急性骨壞死等癥狀[10]。目前,PVP作為一種成熟的微創(chuàng)脊柱手術(shù),因其改善脊柱局部癥狀、恢復(fù)椎體力學(xué)強(qiáng)度、緩解疼痛等方面的療效均優(yōu)于傳統(tǒng)治療方法,也是近年來骨質(zhì)疏松性脊柱骨折的常用治療方式[11]。大多數(shù)患者行PVP術(shù)后骨折會(huì)愈合,但仍有少部分患者會(huì)出現(xiàn)骨折延遲愈合的情況,而骨折延遲愈合會(huì)使患者的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[12]。骨折愈合是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用的創(chuàng)傷修復(fù)過程,在此非常復(fù)雜的過程中,需使骨合成和骨吸收達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,朝著骨折愈合的方向發(fā)展。因此,對(duì)骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合情況進(jìn)行深入研究,分析相關(guān)指標(biāo)以預(yù)測(cè)術(shù)后骨折延遲愈合的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)提高患者預(yù)后具有重要意義。

研究顯示,多種微小RNA(miRNA)等與骨折愈合過程密切相關(guān),在成骨細(xì)胞的分化、增殖等方面起到重要作用[13]。miR-24是一種重要的miRNA,參與機(jī)體多種生理病理過程,具有極為重要的功能作用,而miR-24-3p是由miR-24形成的兩種不同序列的剪接體之一。研究顯示,骨質(zhì)疏松患者血清miR-24相較于非骨質(zhì)疏松患者顯著上調(diào),可能是治療骨質(zhì)疏松患者骨丟失和優(yōu)化骨折愈合的靶點(diǎn)[14]。miR-24-3p是與骨質(zhì)疏松性骨折密切相關(guān)的miRNA,研究表明,骨質(zhì)疏松癥患者血清中miR-24-3p明顯升高,且與骨密度密切相關(guān)[15,16]。另外,miR-24-3p可以抑制細(xì)胞的增殖和成骨分化,研究顯示,長(zhǎng)鏈非編碼RNA 鉀離子電壓門控通道亞家族Q成員1重疊轉(zhuǎn)錄本1可能通過調(diào)控miR-24-3p影響人牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化[17]。

Smad蛋白家族是參與調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)通路的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,在參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成和分化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[18]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分類,Smad5是Smad蛋白家族中受體調(diào)節(jié)蛋白之一,能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化,與骨折愈合密切相關(guān)[19,20]。研究顯示,TUG1可以負(fù)調(diào)控Smad5信號(hào)因子,從而抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞照射后成骨[21]。研究表明,miR-155通過對(duì)Smad5表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié),降低成骨細(xì)胞的分化能力[22,23]。本研究深入探討了miR-24-3p、Smad5與骨質(zhì)疏松性脊柱骨折的關(guān)系,結(jié)果顯示,相較于愈合組,延遲組miR-24-3p表達(dá)水平明顯升高,而Smad5 mRNA表達(dá)水平明顯降低,這表明miR-24-3p、Smad5與骨折愈合程度有一定的關(guān)系,原因?yàn)閙iR-24-3p可能通過抑制成骨細(xì)胞分化使骨合成受到影響,而Smad5可能通過與成骨細(xì)胞密切相關(guān)的基因啟動(dòng)因子結(jié)合,從而誘導(dǎo)成骨分化。

為了探討miR-24-3p、Smad5與骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合的相關(guān)性,本研究對(duì)患者術(shù)后骨折愈合程度的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了分析。骨質(zhì)疏松性脊柱骨折的愈合主要是受骨折部位、骨強(qiáng)度、血液供應(yīng)、后凸畸形程度等其他因素的影響。研究表明,椎體延遲愈合的主要原因之一為持續(xù)性骨質(zhì)疏松,而骨質(zhì)疏松程度的主要衡量指標(biāo)為骨密度[24]。另有研究表明,脊柱骨折不愈合可導(dǎo)致椎體前柱進(jìn)行性縮短,使患者胸腰椎后凸畸形加重,從而導(dǎo)致持續(xù)性腰背疼痛、平衡能力降低及運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀產(chǎn)生[25]。本研究顯示與愈合組比較,延遲組患者術(shù)后3個(gè)月腰椎BMD、股骨頸BMD、椎體前緣高度恢復(fù)率明顯降低,而Cobb角、ODI、VAS評(píng)分均明顯升高,表明延遲組患者骨折愈合情況較差,且骨密度、椎體前緣高度恢復(fù)率、Cobb角、ODI、VAS評(píng)分與患者術(shù)后骨折愈合程度有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松性壓縮性骨折患者術(shù)后椎體愈合組骨密度值高于延遲組,而VAS評(píng)分和Cobb角均低于延遲組,與本研究結(jié)果一致[26]。Pearson相關(guān)性分析顯示,骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后3個(gè)月miR-24-3p與骨密度呈負(fù)相關(guān),與Cobb角、ODI、VAS評(píng)分呈正相關(guān);患者術(shù)后Smad5 mRNA與骨密度呈正相關(guān),與Cobb角、ODI、VAS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。這表明miR-24-3p、Smad5 mRNA表達(dá)水平與患者術(shù)后骨折愈合程度均具有較強(qiáng)的相關(guān)性。適宜的生物學(xué)標(biāo)志物在具有檢測(cè)便捷、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí),還應(yīng)該對(duì)所評(píng)估的癥狀具有較高敏感度和特異性[27]。ROC曲線分析顯示,miR-24-3p的AUC值為0.885,Smad5 mRNA的AUC值為0.881,兩者的敏感度和特異性均較高。這提示miR-24-3p、Smad5具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值,可能是早期診斷骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合程度、評(píng)估預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述,miR-24-3p、Smad5與骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者PVP術(shù)后骨折愈合程度有明顯的相關(guān)性,對(duì)臨床診斷患者術(shù)后骨折愈合程度、評(píng)估和預(yù)測(cè)術(shù)后恢復(fù)情況有一定的意義。