川崎病患兒STAT3-SOCS3信號(hào)通路的表達(dá)及其對(duì)冠狀動(dòng)脈病變的影響

范婉鈺 張 旭 王 瑾 郭俊秀 鄒瑞瑛 滕懿群

川崎病(Kawasaki disease,KD)是兒童時(shí)期最常見的血管炎綜合征,主要影響中小動(dòng)脈,可引起冠狀動(dòng)脈血栓形成、狹窄甚至閉塞,導(dǎo)致心肌梗死[1]。KD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為與感染、環(huán)境、遺傳和免疫等多種因素相關(guān)。已有研究表明,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)-細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)信號(hào)通路參與了KD的發(fā)生和發(fā)展,但在冠狀動(dòng)脈病變(coronary artery lesion,CAL)形成中所起的作用和機(jī)制尚不清楚[2,3]。本研究觀察KD患兒外周血單核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC)中STAT3、SOCS3、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)和和血漿中MMP9、VEGF的水平,并探討STAT3-SOCS3信號(hào)通路對(duì)冠狀動(dòng)脈病變(coronary artery lesion,CAL)的影響。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:選取2021年1月～2022年6月在嘉興市第二醫(yī)院兒科住院的KD患兒50例為研究對(duì)象(KD組)。納入標(biāo)準(zhǔn):所有KD患兒均符合日本循環(huán)協(xié)會(huì)的KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。所有KD患兒住院期間均接受大劑量靜脈注射丙種球蛋白(intravenous immunogloblin,IVIG)和口服阿司匹林治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①入院前已應(yīng)用過IVIG治療者;②住院期間未應(yīng)用IVIG治療者;③臨床資料不全者。另選取同期在筆者醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康兒童30例為健康志愿者(對(duì)照組)。所有KD患兒IVIG治療前均常規(guī)行心臟彩超檢查評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變情況,并于IVIG治療后4周內(nèi)至少復(fù)查2次心臟超聲監(jiān)測(cè)冠狀動(dòng)脈的變化。參照冠狀動(dòng)脈病變的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)心臟彩超檢查結(jié)果將KD患兒分為CAL組與無CAL組[4]。本研究獲得了嘉興市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):JXEY-2020JX022),研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均知情并簽署同意書。

2.主要試劑和儀器:Trizol RNA提取試劑盒購自美國Ambion公司,STAT3、SOCS3、MMP9和VEGF引物由安徽通用生物有限公司合成,熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購自杭州皓豐生物技術(shù)有限公司,兔抗人STAT3抗體、SOCS3抗體、MMP9抗體、VEGF抗體、β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,ECL發(fā)光試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自合肥海伯萊生物技術(shù)有限公司,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司。CFX Connect Real-Time System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和ChemiDoc XRS凝膠成像儀購自美國Bio-RAD公司,SUNRISE酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。

3.標(biāo)本采集:分別采集KD組急性期(IVIG治療前)、緩解期(IVIG治療后1個(gè)月)和對(duì)照組的空腹外周靜脈血5ml于抗凝管中,加入淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC用于mRNA和蛋白表達(dá)測(cè)定,并收集血漿于-80℃冰箱保存。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表達(dá): 采用Trizol法提取PBMC的總RNA,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照說明書進(jìn)行PCR檢測(cè),PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s;60℃退火30s;72℃延伸30s,共40個(gè)循環(huán)。STAT3上游引物:5′-CGACCTGCAGCAATACCATTGA-3′,下游引物:5′-ACTCCATGTCAAAGGTGAGGGA-3′;SOCS3上游引物:5′-CAGCTCCAAGAGCGAGTACC-3′, 下游引物:5′-TGACGCTGAGCGTGAAGAAG-3′;MMP9上游引物:5′-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3′,下游引物:5′-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3′;VEGF上游引物:5′-CTT CCC GAG GCA CAG AGA-3′,下游引物:5′-GGG AGG GCAGAG CTG AGT-3′;內(nèi)參β-actin上游引物:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游引物:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,用2-△△ct法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

5.Western blot法檢測(cè)STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá):首先裂解單核細(xì)胞,提取單核細(xì)胞總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量,進(jìn)行 SDS-PAGE,再轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上,用 含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉 1h,分別加入兔抗人SOCS3抗體、STAT3抗體、MMP9抗體、VEGF抗體和β-actin抗體,抗體濃度均為1∶500,4℃ 孵育過夜,洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗(1∶5000),室溫孵育 2h,洗滌后加入ECL發(fā)光試劑盒混合液體,移入凝膠成像分析儀中,化學(xué)光敏模式曝光顯影。以目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參β-actin的條帶灰度值比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

6.酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿MMP9、VEGF水平:具體操作步驟按照試劑盒說明書,配置標(biāo)準(zhǔn)品工作液,向反應(yīng)孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50μl,立即加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl,37℃孵育1h,洗滌5 次,加入底物A、B各50μl,37℃孵育15min,加入50μl終止液,用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度(A)值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMP9、VEGF含量。

結(jié) 果

1.一般資料比較:KD組中男患兒29例,女患兒21例,平均月齡為20個(gè)月;KD組發(fā)熱平均持續(xù)時(shí)間為7天;KD組中37例(74.0%)為完全川崎病,7例(14.0%)對(duì)首劑IVIG治療無反應(yīng),總共12例(24.0%)KD患兒并發(fā)CAL。對(duì)照組中男孩19例,女孩11例,平均月齡為22個(gè)月。KD組和對(duì)照組性別、月齡比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.KD組急性期、KD組緩解期和對(duì)照組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表達(dá)及血漿MMP9、VEGF水平比較:KD組急性期PBMC中STAT3 mRNA、SOCS3 mRNA、MMP9 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)及血漿MMP9、VEGF水平均高于KD組緩解期和對(duì)照組(P<0.05);KD組緩解期PBMC中STAT3 mRNA、SOCS3 mRNA、MMP9 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)及血漿MMP9、VEGF水平均高于對(duì)照組(P<0.05),詳見表1。

表1 各組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表達(dá)和血漿MMP9、VEGF水平比較

3.KD組急性期、KD組緩解期和對(duì)照組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平比較:KD組急性期PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平均高于KD組緩解期和對(duì)照組(P<0.05);KD組緩解期PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白水平表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05),詳見表2、圖1。

圖1 各組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

表2 各組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

4.KD患兒CAL組和無CAL組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表達(dá)及血漿MMP9、VEGF水平比較:CAL組PBMC中STAT3 mRNA、SOCS3 mRNA、MMP9 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)及血漿MMP9、VEGF水平均高于無CAL組(P<0.05),詳見表3。

表3 兩組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表達(dá)及血漿MMP9、VEGF水平比較

5.KD患兒CAL組和無CAL組STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平比較:CAL組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平均高于無CAL組(P<0.05),詳見表4、圖2。

表4 兩組PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

6.KD組STAT3、SOCS3與MMP9、VEGF的相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,KD組急性期PBMC中STAT3、SOCS3的mRNA和蛋白表達(dá)分別與MMP9、VEGF呈正相關(guān)(P<0.05)。

討 論

KD特征是冠狀動(dòng)脈和其他中等大小動(dòng)脈廣泛的血管炎癥,血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和損傷是KD血管炎發(fā)生的最初環(huán)節(jié)。KD患者血清中炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,隨后血管壁基質(zhì)發(fā)生降解,炎性細(xì)胞可向血管壁深部擴(kuò)散,從而導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)重建,后期可出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈狹窄、冠狀動(dòng)脈瘤[1]。

MMP9屬于鋅依賴內(nèi)肽酶家族,可由多種細(xì)胞產(chǎn)生,具有特異的膠原酶和彈性蛋白酶活性。MMP9可以降解主要由膠原組織、彈性蛋白和蛋白多糖組成的內(nèi)皮下層,有助于炎性細(xì)胞進(jìn)入到血管壁深層,與血管壁的損傷和重構(gòu)關(guān)系密切[5]。既往研究顯示并發(fā)CAL的KD患兒血清MMP9水平明顯增加,經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)MMP不僅是并發(fā)CAL的危險(xiǎn)因素,而且是并發(fā)CAL的預(yù)測(cè)因子[6]。VEGF由血管平滑肌細(xì)胞生成,通過結(jié)合靶細(xì)胞上的受體發(fā)揮其生物活性,VEGF不僅可以增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分裂,刺激新血管形成[7]。另外,VEGF還可刺激巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集,并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子,發(fā)揮促炎的作用,既往研究顯示,VEGF在KD中表達(dá)明顯上升,提示VEGF參與了KD的炎性反應(yīng)過程[8]。

本研究結(jié)果顯示, KD患兒急性期PBMC和血漿中MMP9、VEGF表達(dá)較對(duì)照組明顯上升,緩解期MMP9、VEGF表達(dá)均有不同程度的下降,但兩個(gè)時(shí)期均明顯高于對(duì)照組,提示MMP9和VEGF參與了KD的病理生理過程。對(duì)KD患兒進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), CAL組MMP9、VEGF表達(dá)明顯高于無CAL者,與既往研究結(jié)果一致,提示KD患兒MMP9和VEGF表達(dá)增加與并發(fā)CAL密切相關(guān)[9,10]。

STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,被上游細(xì)胞因子激活后,其酪氨酸705或絲氨酸727位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,磷酸化的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核通過調(diào)控相關(guān)下游基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。研究發(fā)現(xiàn)在KD患兒和動(dòng)物模型中STAT3表達(dá)上調(diào),提示STAT3及其相關(guān)信號(hào)通路參與了KD的病理生理過程[3]。SOCS3是由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白,可反饋性抑制STAT3表達(dá),負(fù)性調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。本研究結(jié)果顯示,KD患兒PBMC中STAT3、SOCS3的表達(dá)在急性期達(dá)到峰值,在緩解期逐漸降低,但仍高于健康對(duì)照組,提示KD患兒STAT3-SOCS3信號(hào)通路被激活。

在機(jī)體正常狀態(tài)下,STAT3受到細(xì)胞因子誘導(dǎo)后表達(dá)上升,可通過上調(diào)其靶基因SOCS3的轉(zhuǎn)錄對(duì)STAT3進(jìn)行負(fù)性調(diào)控,進(jìn)而下調(diào)STAT3的表達(dá),維持動(dòng)態(tài)平衡。由于在KD急性期,大量細(xì)胞因子持續(xù)性存在,細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的SOCS3表達(dá)增加不能完全抑制細(xì)胞因子對(duì)STAT3的誘導(dǎo)活化,反饋抑制回路失調(diào),導(dǎo)致STAT3、SOCS3持續(xù)過度表達(dá),表現(xiàn)為STAT3-SOCS3信號(hào)通路異?；罨?。有研究表明,MMP9、VEGF是STAT3信號(hào)通路的下游因子,STAT3表達(dá)升高可上調(diào)MMP9、VEGF基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),增強(qiáng)其生物學(xué)功能[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn),KD患兒PBCM中STAT3、SOCS3的表達(dá)分別與MMP9、VEGF呈正相關(guān),提示STAT3-SOCS3信號(hào)通路可能通過上調(diào)MMP9、VEGF的表達(dá)導(dǎo)致CAL。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示KD患兒STAT3-SOCS3信號(hào)通路被異常激活,可能通過上調(diào)MMP9、VEGF的表達(dá)導(dǎo)致CAL。但本研究存在一定的局限性,首先由于本研究未使用冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑作為判斷CAL的依據(jù),可能會(huì)對(duì)CAL的評(píng)估有影響。其次本研究中KD患兒并發(fā)CAL的樣本量較小,可能會(huì)對(duì)結(jié)論存在一定影響,因此需要進(jìn)行大樣本量多中心研究來驗(yàn)證。本研究?jī)H探討了STAT3-SOCS3信號(hào)通路對(duì)CAL的影響,在KD的病理生理過程中,STAT3-SOCS3信號(hào)通路可能與其他信號(hào)通路相互聯(lián)系、相互影響,構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同參與CAL的形成,但其詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究予以證實(shí)。