急性缺血性腦卒中患者血清Janus 蛋白酪氨酸激酶2 和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1 水平及其與腸道菌群、免疫功能的關(guān)系研究

付楠良，郝婷婷，劉璽昌

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是臨床常見的腦卒中類型，約占全部腦卒中的60%～80%，具有較高的致殘率和死亡率，且隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)展，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，我國每年新發(fā)AIS患者例數(shù)超過200萬例，這對居民生命安全造成了嚴(yán)重威脅［1-2］。研究顯示，炎癥反應(yīng)參與了AIS發(fā)病的各個(gè)階段，其會(huì)破壞腸道黏膜屏障，造成腸道菌群失調(diào)，而腸道菌群失調(diào)可能通過細(xì)菌代謝產(chǎn)物打破免疫平衡，從而直接或間接地影響AIS的發(fā)生發(fā)展［3-4］。Janus蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）2作為Janus家族成員之一，在腦組織中廣泛表達(dá)，而JAK/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路可參與機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等的調(diào)控，其中JAK2/STAT3信號通路已被證實(shí)在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用［5-6］。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine singaling 1，SOCS1）作為一種負(fù)調(diào)控因子可通過JAK2/STAT3、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）等途徑減弱信號傳導(dǎo)，進(jìn)而在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用［7］?；诖?，本研究旨在分析AIS患者血清JAK2、SOCS1水平及其與腸道菌群、免疫功能的關(guān)系，以期為AIS的預(yù)防和診治提供數(shù)據(jù)參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2020年2月至2023年2月宜昌市中心人民醫(yī)院收治的AIS患者106例為AIS組，其中男56例，女50例；年齡38～79歲，平均（58.1±8.7）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，且經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診；（2）首次發(fā)病，且發(fā)病至住院時(shí)間＜24 h；（3）臨床資料完整；（4）對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤者；（2）存在其他腦血管疾病者；（3）存在急性或慢性感染者；（4）存在心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；（5）合并免疫系統(tǒng)疾病者。另選取同期在宜昌市中心人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康者106例為對照組，其中男58例，女48例；年齡36～78歲，平均（57.9±8.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完整；（2）對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：有顱內(nèi)手術(shù)史。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.076，P=0.783；t=0.168，P=0.866）。本研究獲得宜昌市中心人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號：2020119203）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清JAK2、SOCS1水平測定 抽取AIS患者入院次日晨起及對照組體檢當(dāng)日空腹肘靜脈血3～5 ml，3 500 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），取上清液，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定血清JAK2、SOCS1水平，具體方法為：采用Trizol試劑提取血清總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因。PCR總反應(yīng)體系為20.0 μl，包括SYBR PremixEx Tap 12.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，cDNA 2.0 μl，雙蒸水3.5 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性600 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。測定完成后采用2-ΔΔCt法計(jì)算JAK2、SOCS1相對表達(dá)量，即血清JAK2、SOCS1水平，上述操作重復(fù)3次，取平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 腸道菌群數(shù)量測定 取新鮮糞便（無尿液、血液污染）1 g于離心管中，加5 ml蒸餾水后300 r/min離心1 min（離心半徑8 cm）；按照10倍連續(xù)稀釋方式將其稀釋至10-8g/ml，取5 μl分別接種至乳酸桿菌培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)3 d，分別記錄乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸埃希菌、腸球菌數(shù)量。

1.2.3 免疫功能指標(biāo)測定 抽取AIS患者入院次日晨起及對照組體檢當(dāng)日空腹肘靜脈血3～5 ml，3 500 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），取上清液，使用流式細(xì)胞分析儀（CYTOMICS FC500，美國貝克曼庫爾特公司）測定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清JAK2、SOCS1水平 AIS組血清JAK2水平高于對照組，SOCS1水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組血清JAK2、SOCS1水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum JAK2 and SOCS1 levels between the two groups

表2 兩組血清JAK2、SOCS1水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum JAK2 and SOCS1 levels between the two groups

注：AIS=急性缺血性腦卒中

組別例數(shù)JAK2SOCS1對照組1061.0±0.21.1±0.2 AIS組1061.7±0.30.6±0.1 t值18.69120.007 P值＜0.001＜0.001

2.2 腸道菌群數(shù)量 AIS組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量低于對照組，大腸埃希菌、腸球菌數(shù)量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組腸道菌群數(shù)量比較（±s，lgCFU/g）Table 3 Comparison of intestinal flora quantity between the two groups

組別例數(shù)乳酸桿菌 雙歧桿菌 大腸埃希菌 腸球菌對照組1069.2±1.28.8±1.05.3±1.04.6±1.0 AIS組1067.0±1.86.5±1.57.4±2.26.7±1.7 t值10.04213.3569.02811.233 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 免疫功能指標(biāo) AIS組CD3+、CD4+z免疫功能指標(biāo)間的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，AIS患者血清JAK2水平與乳酸桿菌數(shù)量、雙歧桿菌數(shù)量、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均呈負(fù)相關(guān)，與大腸埃希菌數(shù)量、腸球菌數(shù)量、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均呈正相關(guān)（P＜0.05）；AIS患者血清SOCS1水平與乳酸桿菌數(shù)量、雙歧桿菌數(shù)量、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均呈正相關(guān)，與大腸埃希菌數(shù)量、腸球菌數(shù)量、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表4 兩組免疫功能指標(biāo)比較（±s，%）Table 4 Comparison of immune function indexes between the two groups

表4 兩組免疫功能指標(biāo)比較（±s，%）Table 4 Comparison of immune function indexes between the two groups

組別例數(shù) CD3+ T淋巴細(xì)胞百分比CD4+ T淋巴細(xì)胞百分比CD8+ T淋巴細(xì)胞百分比對照組10668.7±5.246.8±3.624.1±3.5 AIS組10660.1±5.436.2±3.128.1±3.5 t值11.79522.9908.370 P值＜0.001＜0.001＜0.001

表5 AIS患者血清JAK2、SOCS1水平與腸道菌群數(shù)量、免疫功能指標(biāo)間的相關(guān)性Table 5 Correlation between serum JAK2 and SOCS1 levels and intestinal flora quantity，immune function indexes in AIS patients

3 討論

AIS是臨床中常見的腦血管疾病，患者多表現(xiàn)為頭暈?zāi)垦?、偏癱，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)昏迷不醒。隨著AIS病情的進(jìn)展，患者血腦屏障功能被破壞，如果不能得到及時(shí)的救治，其生命安全將受到威脅［9］。既往研究顯示，免疫應(yīng)答/炎癥反應(yīng)在AIS的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，其可通過釋放大量炎癥遞質(zhì)而使缺血部位損傷加重，同時(shí)也可釋放神經(jīng)保護(hù)因子，進(jìn)而削弱對神經(jīng)元的損傷［10］。此外，另有研究顯示，腸道菌群在正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)腸黏膜屏障被破壞，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，造成腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，因而腸道菌群在AIS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［4，11］。因此，探尋影響AIS患者腸道菌群及免疫功能的指標(biāo)，對改善患者病情及預(yù)后有重要意義。

JAK2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且JAK2/STAT3信號通路與炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)紊亂等密切相關(guān)。研究證實(shí)，當(dāng)發(fā)生缺血性腦卒中時(shí)，JAK2/STAT3信號通路被缺血損傷、炎癥因子異常激活并轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［12-13］。既往研究顯示，當(dāng)發(fā)生腦梗死時(shí)，JAK2/STAT3信號通路被激活，主要表現(xiàn)為JAK2、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、磷酸化（phosphorylated STAT3，p-STAT3）表達(dá)水平升高，神經(jīng)功能受損［14］。本研究結(jié)果顯示，AIS組血清JAK2水平高于對照組，與韓玉惠等［14］研究結(jié)果一致，提示AIS患者血清JAK2水平升高，分析原因可能如下：當(dāng)患者發(fā)生AIS時(shí)，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，JAK2/STAT3信號通路被激活，使JAK2、磷酸化STAT3表達(dá)水平升高［15］。SOCS1定位于人染色體16p13.13，作為一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，其可參與調(diào)控免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等［16］。SOCS1在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其可抑制炎癥反應(yīng)，避免血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，王薇薇等［17］研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1可減輕AIS模型小鼠炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，AIS組血清SOCS1水平低于對照組，提示AIS患者血清SOCS1水平降低，分析原因可能為：AIS可引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答/炎癥反應(yīng)，使DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性增加，造成SOCS1異常甲基化，進(jìn)而使SOCS1基因沉默，導(dǎo)致血清SOCS1水平降低［18］。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，AIS患者血清JAK2水平與血清SOCS1水平呈負(fù)相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1可與JAK2直接結(jié)合，抑制JAK2磷酸化，從而抑制JAK2/STAT3信號通路的激活，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)［19］。

腸道菌群被稱為“第二大腦”，腸-腦之間是雙向的，一側(cè)功能障礙將影響另一側(cè)功能。本研究結(jié)果顯示，AIS組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量低于對照組，大腸埃希菌、腸球菌數(shù)量高于對照組，提示AIS患者消化功能受損，腸道菌群平衡被破壞。AIS可打破機(jī)體免疫平衡狀態(tài)，引起免疫功能紊亂［20］。本研究結(jié)果顯示，AIS組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比低于對照組，CD8+T淋巴細(xì)胞百分比高于對照組，提示AIS患者存在免疫功能受損，與上述研究結(jié)果［20］一致。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，AIS患者血清JAK2水平與乳酸桿菌數(shù)量、雙歧桿菌數(shù)量、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均呈負(fù)相關(guān)，與大腸埃希菌數(shù)量、腸球菌數(shù)量、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均呈正相關(guān)；AIS患者血清SOCS1水平與乳酸桿菌數(shù)量、雙歧桿菌數(shù)量、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均呈正相關(guān)，與大腸埃希菌數(shù)量、腸球菌數(shù)量、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均呈負(fù)相關(guān)。研究顯示，發(fā)生AIS時(shí)，機(jī)體SOCS1水平降低，導(dǎo)致其對JAK2/STAT3信號通路的抑制作用下降，而JAK2/STAT3信號通路的激活可促進(jìn)諸如IL-1、IL-6等促炎因子的大量分泌，導(dǎo)致腸上皮功能障礙加重，進(jìn)而使腸道菌群失衡，有益菌減少，有害菌增加，且大量促炎因子還會(huì)降低免疫功能［21］。

綜上所述，AIS患者血清JAK2水平升高，SOCS1水平降低，且二者間呈負(fù)相關(guān)；此外，血清JAK2、SOCS1水平均與腸道菌群數(shù)量及免疫功能指標(biāo)存在相關(guān)性，即隨著血清JAK2水平升高、SOCS1水平降低，乳酸桿菌數(shù)量、雙歧桿菌數(shù)量、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比逐漸降低，大腸埃希菌數(shù)量、腸球菌數(shù)量、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比逐漸升高，這為臨床治療AIS提供了新方向。然而本研究為回顧性、小樣本量、單中心研究，可能會(huì)對結(jié)果造成一定偏倚，未來可擴(kuò)大樣本量、聯(lián)合多中心進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：付楠良、郝婷婷進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集；付楠良撰寫論文；付楠良、劉璽昌進(jìn)行論文的修訂；劉璽昌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。