LINC00152通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路調(diào)控LPS誘導小膠質(zhì)細胞炎性反應的機制研究

劉新志 陳 臣 胡 燕 劉治艷 劉 濤

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是腦卒中的危重類型,發(fā)生率、致殘率及病死率均很高,且預后差[1]。迄今,ICH發(fā)病機制尚不明確,且缺乏有效臨床治療手段[2]。研究表明炎性反應在ICH后損傷是關鍵,小膠質(zhì)細胞被認為是最早激活的炎癥效應細胞,而PI3K/Akt/NF-κB與ICH后炎性反應密切相關[3～5]。非編碼 RNA(ncRNA)是一類從基因組轉(zhuǎn)錄但不具蛋白表達功能的轉(zhuǎn)錄本,長度在200個核苷酸以上的被稱為長鏈非編碼RNA((long non-coding RNA,lncRNA)。lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮關鍵作用,參與腦損傷后血管再生、凋亡和炎癥等過程,亦是預測ICH損傷程度的生物學標志物[6, 7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),lncRNA-LINC00152在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有重要作用,而在ICH中未見報道,課題組預實驗發(fā)現(xiàn)沉默LINC0152可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小膠質(zhì)細胞炎性反應[8]?；诖?本研究以小膠質(zhì)細胞為研究對象,誘導建立細胞炎癥模型,使用反義寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)LINC00152,觀察小膠質(zhì)細胞表型、炎性因子及PI3K/Akt/NF-κB通路的變化,探討其分子機制。此研究結果將為今后ICH的治療提供實驗基礎及新藥物靶點。

材料與方法

1.實驗細胞及主要試劑與儀器:HMC3人小膠質(zhì)細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,細胞培養(yǎng)條件為MEM+10%FBS+1%PS,37℃、5% CO2、飽和濕度。胎牛血清(FBS)(上海依科賽生物制品有限公司,貨號:FND500),MEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司,貨號:FND500),胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)(美國GIBCO公司,貨號:25200-056),PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:ZLI-9062),TNF-α、IL-6、IL-1βELISA Kit、Anti-Human CD86 (B7-2) PE、Anti-Human CD206 (MMR) PE-Cyanine7均購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司,NOS試劑盒(南京建成生物科技有限公司,貨號:A014-1),lncRNA ASO Negative Control、ASO-LINC00152購自廣州銳博生物技術有限公司,PI3K(美國CST公司,貨號:4249T),Akt(美國CST公司,貨號:4691T),p-Akt(英國Abcam公司,貨號:ab192623),NF-κB p65及Phospho-NF-κB p65(美國CST公司,貨號:8242T、3033T),流式細胞儀(美國BD公司,貨號:LSRFortessa),PCR儀(美國Bio-Rad公司,MyCycler Thermal Cycler)。

2.細胞轉(zhuǎn)染及分組:利用lipo3000將100nmol/L riboTRACERTMFluorescent Oligo(指示劑)轉(zhuǎn)染HMC3細胞。實驗分為以下4組,即空白組(Control組):HMC3細胞正常培養(yǎng)72h;LPS組:HMC3細胞正常培養(yǎng)48h后,1μg/ml LPS干預24h;陰性對照組(LPS+ ASO-NC組):1μg/ml LPS提前1h干預,隨后轉(zhuǎn)染ASO-NC共同干預23h,換液后ASO-NC繼續(xù)干預48h;LPS+ASO-LINC00152組:1μg/ml LPS提前1h干預,隨后轉(zhuǎn)染ASO-LINC00152共同干預23h,換液后ASO-LINC00152繼續(xù)干預48h。轉(zhuǎn)染后,去培養(yǎng)基,加1ml Trizol消化細胞,使Trizol平鋪在細胞層面上,反復搖晃細胞培養(yǎng)瓶,直至細胞完全消化,置于1.5ml EP管中,備用。

3.流式細胞檢測:取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的HMC3,用完全培養(yǎng)基制備成5×104cells/ml單細胞懸液,接種至6孔板中(2毫升/孔),培養(yǎng)過夜細胞貼壁后,按照上述實驗方法進行干預;干預完成后,收集細胞,PBS重懸洗滌兩次,離心,棄上清。加入PBS計數(shù)至1×107/ml,吸取100μl細胞懸液至流式管中,每管加入5μl CD86-PE、CD206 PE-Cy7抗體;4℃避光孵育20min,離心,棄上清,用400μl預冷的PBS重懸細胞,過200目無菌篩網(wǎng);采用流式細胞儀檢測CD86+(M1型)和CD206+(M2型)的比例。通過陰性樣本管調(diào)整FSC、SSC電壓及FSC閾值,使細胞群位于合適位置,圈目的細胞群,選擇CD86-PE、CD206 PE-Cy7通道顯示直方圖,再調(diào)整相應熒光電壓,使陰性細胞峰位于靠左熒光表達陰性區(qū)域內(nèi),沿陰性細胞群設門,對樣本管進行上樣;設門左邊為熒光陰性表達比例,右邊為熒光陽性表達比例。對CD86、CD206 陽性表達比例進行統(tǒng)計分析。

4.ELISA檢測:取上述分組細胞上清液,檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量,具體檢測方法詳見相關試劑盒。

5.iNOS 活性檢測及:按上述實驗方法進行干預后,收集細胞檢測iNOS 含量,參考試劑盒相關方法。

6.RT-qPCR檢測:按上述實驗方法處理細胞,后續(xù)按照RT-qPCR實驗報告操作。用TRLZOL試劑提取各組細胞總RNA,按5× All-In-One RT MasterMix(美國ABM公司,貨號:G492)說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,利用EvaGreen 2×qPCR MasterMix-Low ROX(美國ABM公司,貨號:MasterMix-LR)及熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR分析。熒光定量PCR程序:95℃預變性10min;95℃變性15s,60℃退火/延伸60s,40個循環(huán)。采用GAPDH為內(nèi)參,以2-ΔΔCt表示樣品中目的基因相對表達量。實驗重復3次。熒光定量mRNA檢測引物信息詳見表1。

表1 熒光定量mRNA檢測引物信息表

7.Western blot法檢測:按上述分組及方法處理完成后,收集細胞,PBS洗1遍后收集細胞。根據(jù)課題組前期實驗方法進行Western blot法分析[9]。一抗孵育:PI3K(1∶800稀釋)、Akt(1∶1000稀釋)、p-Akt(1∶600稀釋)、p65(1∶1000稀釋)、p-p65(1∶800稀釋)、β-actin(1∶1000稀釋)。完后用 TBST 沖洗3次,再用HRP標記的二抗[兔抗(R)1∶5000,鼠抗(M)1∶15000]。采用 ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測、拍照。

結 果

1. 流式細胞檢測:與Control組比較,LPS組、LPS+ASO-NC組和LPS+ASO-LINC00152組的CD86+表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Control組比較,LPS組和LPS+ASO-NC組的CD206+表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而LPS+ASO-LINC00152組的CD86+表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與LPS組比較,LPS+ASO-NC組和LPS+ASO-LINC00152組的CD86+表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),LPS+ASO-LINC00152組的CD206+表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS+ASO-NC組比較,LPS+ASO-LINC00152組的CD86+、CD206+表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果提示,LPS+ASO-LINC00152組中CD86+(M1型)表達下調(diào),而CD206+(M2型)表達上調(diào)(圖1、圖2)。

圖1 流式檢測細胞表面CD86+、CD206+比例

圖2 流式檢測CD86+、CD206+表達與LPS組比較,*P<0.05;與Control組比較,#P<0.05;與LPS+ASO-NC組比較,ΔP<0.05

2.ELISA檢測:與Control組比較,LPS組、LPS+ASO-NC組和LPS+ASO-LINC00152組中TNF-α、IL-1β、IL-6比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+ASO-LINC00152組中的IL-6比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而TNF-α、IL-1β表達有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3)。

圖3 各組細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α檢測結果與LPS組比較,*P<0.05;與Control組比較,#P<0.05

3.iNOS活性檢測:與Control組比較,LPS組、LPS+ASO-NC組和LPS+ASO-LINC00152組中iNOS差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+ASO-NC組和LPS+ASO-LINC00152中的iNOS表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS+ASO-NC組比較,LPS+ASO-LINC00152組的iNOS表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。

圖4 各組中iNOS活性的水平與LPS組比較,*P<0.05;與Control組比較,#P<0.05;與LPS+ASO-NC組比較,ΔP<0.05

4.RT-qPCR檢測:各組間PI3K、Akt、p65基因表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖5)。

5.Western blot法檢測:各組間PI3K、Akt、p65表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與Control組比較,LPS組、LPS+ASO-NC組中p-Akt及p-p65差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+ASO-LINC00152中的p-Akt及p-p65表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS+ASO-NC組比較,LPS+ASO-LINC00152組的p-Akt及p-p65表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖6)。

圖6 各組PI3K、Akt、p-Akt、p65、p-p65蛋白表達水平與LPS組比較,*P<0.05;與Control組比較,#P<0.05;與LPS+ASO-NC組比較,ΔP<0.05

討 論

ICH發(fā)生后,小膠質(zhì)細胞最先被激活,分泌大量的趨化因子、炎性因子、蛋白酶以及其他細胞毒性產(chǎn)物,增加血液中的炎性細胞聚集,導致炎癥放大級聯(lián)效應,從而加重神經(jīng)損傷程度。活化的小膠質(zhì)細胞具有兩種表型(M1和M2型),M1型是可釋放大量致炎性細胞因子,如IL-1β、TNF-α及活性氧等,損傷正常細胞及組織,而M2型釋放一系列抗炎性細胞因子,如 IL-10 和轉(zhuǎn)化生長因子-β,發(fā)揮神經(jīng)保護效應,表型不同作用截然相反[10]?？梢?小膠質(zhì)細胞在ICH中具有雙重作用,抑制其向M1表型轉(zhuǎn)化或誘導其向M2表型轉(zhuǎn)化,是抑制ICH后炎性反應改善預后的關鍵環(huán)節(jié)。

lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮關鍵作用,參與腦損傷后血管再生、凋亡和炎癥等過程,亦是預測ICH損傷程度的生物學標志物[6,7]。LINC00152位于2p11.2染色體上,是一個lncRNA分子,有828個核苷酸,在多種人類組織中均有高表達,目前研究主要聚焦于腫瘤領域,在ICH中未見報道[11]。因此,本研究采用LPS誘導的小膠質(zhì)細胞的炎癥模型,模擬ICH后炎性反應,探索LINC00152在ICH中對小膠質(zhì)細胞的影響。本研究發(fā)現(xiàn)ASO- LINC00152組在LPS誘導的小膠質(zhì)細胞極化表型中CD86+(M1型)比例較低,而CD206+(M2型)比例較高,提示ASO- LINC00152可能使LPS誘導的小膠質(zhì)細胞極化表型由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。同時,ASO-LINC00152有明顯抑制了IL-6、TNF-α、IL-1β炎性細胞因子表達趨勢,可作為ASO-LINC00152抑制小膠質(zhì)細胞極化M1表型轉(zhuǎn)化的佐證。然而,缺乏對M2表型轉(zhuǎn)化時產(chǎn)生的抗炎性細胞因子IL-10和TGF-β的檢測,是本實驗的局限性。

本研究發(fā)現(xiàn),ASO- LINC00152調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB通路抑制炎癥,基于抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞中p-Akt、p-p65蛋白表達。ICH后腦損傷是由多種基因和信號通路參與的復雜病理生理過程,包括炎癥、氧化應激、神經(jīng)細胞毒性、凝血酶形成等多方面,尤其是PI3K/Akt/NF-κB通路[12,13]。PI3K/Akt/NF-κB廣泛存在于神經(jīng)細胞中,且參與介導炎性反應,該通路激活可以改善ICH后神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)炎癥[5]。異丙酚可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/NF-κB通路減輕ICH后的炎癥性腦損傷[14]。研究顯示,PI3K/Akt也參與了小膠質(zhì)細胞炎性反應的調(diào)控[15,16]。腦缺血再灌注損傷中,紅景天苷調(diào)控了p-Akt與總Akt的比值,增加神經(jīng)元核蛋白,減少梗死周圍區(qū)域小膠質(zhì)細胞,發(fā)揮抗炎保護神經(jīng)元的作用[17]。此外,LPS可刺激小膠質(zhì)細胞大量表達炎性細胞因子和趨化因子,E3泛素連接酶c-Cbl可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/NF-κB通路,抑制小膠質(zhì)細胞介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥,起到腦保護作用[18]。本研究ASO- LINC00152調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB通路在LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥模型中發(fā)揮抗炎作用,與同行研究結論一致。

綜上所述, LINC00152在神經(jīng)炎癥中具有一定的作用,與PI3K/Akt/NF-κB信號通路關系密切。沉默LINC00152通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/NF-κB信號通路,可能使LPS誘導的小膠質(zhì)細胞表型發(fā)生改變,減少炎性因子釋放,從而發(fā)揮抑制炎性反應的作用。本研究可為今后ICH的治療提供實驗基礎及新藥物靶點。