PGC-1α調(diào)控非酒精性脂肪肝病線粒體功能的作用研究

王雪梅 王怡婷 車 悅 汪潔英 門 可

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指沒有過量飲酒史,以脂肪變性和蓄積為主要病理特征。約1/5的NAFLD患者由于炎性反應(yīng)進(jìn)展成非酒精性脂肪性肝炎,肝纖維化發(fā)生肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[1]。NAFLD的患病率是25.24%,胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病也更容易發(fā)生在NAFLD患者身上[2]。NAFLD的發(fā)病機制常見的是“二次打擊”理論,即先是脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)蓄積,后是炎癥和氧化應(yīng)激加重病變[3]。NAFLD的細(xì)胞模型復(fù)制方法都是打破能量代謝平衡,促進(jìn)脂肪變性和蓄積。人肝癌細(xì)胞HepG2、人胚胎肝細(xì)胞L02和小鼠肝實質(zhì)原代細(xì)胞都是良好的模型載體,干預(yù)方式常用棕櫚酸和油酸按照不同的比例混合成游離脂肪酸孵育細(xì)胞,或者用高濃度血清干預(yù),還有就是葡萄糖和胰島素共同干預(yù)[4,5]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)相對獨立的細(xì)胞器,有雙層膜結(jié)構(gòu)和獨立的DNA。線粒體通過呼吸鏈的氧化還原反應(yīng),完成氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[6]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activatedreceptors alpha,PPARα)是一種核激素受體,參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。PPARα的靶基因肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1A(carnitine palmitoyltransferase-1A,CPT-1A)是催化脂肪酸氧化的關(guān)鍵限速酶[8]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptors gamma co-activator 1α,PGC-1α)參與調(diào)節(jié)線粒體生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),其中核呼吸因子1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,mtTFA)參與調(diào)控線粒體DNA的生物合成,NRF-1和mtTFA都是PGC-1α的靶基因[9,10]。線粒體功能在NAFLD脂質(zhì)蓄積中的作用有待于進(jìn)一步闡明,本研究旨在探討PGC-1α介導(dǎo)線粒體功能調(diào)控肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,為尋找NAFLD治療新靶點提供理論依據(jù)和參考。

材料與方法

1.主要試劑與材料:HepG2人肝癌細(xì)胞株由西安醫(yī)學(xué)院病理教研室贈予;人源過表達(dá)慢病毒載體PPARGC1A,NM_001330751和陰性對照病毒(LV-control)購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司;甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)試劑盒、肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、油紅O染液均購自南京建成生物工程研究所;實時熒光定量試劑盒購自Life Technologies公司;DNA引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司;PPARα、CPT-1A、PGC-1α、NRF-1、mtTFA蛋白一抗購自英國Abcam公司,蛋白一抗GAPDH購自美國Cell Signaling Technology公司;蛋白二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;增強型化學(xué)發(fā)光顯影液(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒購自美國Invitrogen公司;1%磷酸酶抑制劑購自美國Thermo公司;0.5%蛋白酶抑制劑、RIPA緩沖液、BCA蛋白質(zhì)分析、粒體膜電位檢測C2006、活性氧檢測S0033S購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;油酸SLB07659V、棕櫚酸SLB02406V購自美國Sigma公司。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法:待HepG2生長至50%～70%融合度,不同病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)轉(zhuǎn)染慢病毒LV-PPARGC1A(2×108TU/ml);陰性對照病毒LV-control(CON238,uBI-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin,1×109TU/ml),加入病毒感染增強劑A和P,待轉(zhuǎn)染72h后觀察轉(zhuǎn)染效果。實時熒光定量PCR法檢測PGC-1α過表達(dá)情況,引物序列:上游引物::5′-CAGAGAGTATGAGAAGCGAGAG-3′,下游引物:5′-AGCATCACAGGTATAACGGTAG-3′。GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列:上游引物:5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, 下游引物:5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。

3.HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型和分組:取油酸和棕櫚酸按照2∶1(濃度0.66mol/L∶0.33mol/L)的比例用DMSO分別溶解,混合制成游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)。10%胎牛血清溶于DMEM高糖培養(yǎng)基,置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分為對照組、FFA模型組(1.5mmol/L FFA孵育24h)、LV-PGC-1α干預(yù)組(PPARGC1A慢病毒轉(zhuǎn)染后,1.5mmol/L FFA孵育24h)、LV-control 干預(yù)組(陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染后,1.5mmol/L FFA孵育24h)。

4.細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì):細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,試劑盒測定TC、TG含量,表示為mmol/(g·prot)。油紅O染色,于510nm處測定吸光度(A)值,檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。

5.肝損傷指標(biāo)和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo):試劑盒檢測細(xì)胞上清液中AST、ALT的含量變化。比色法檢測細(xì)胞內(nèi)中SOD和GSH-PX的活性,MDA含量。

6.線粒體ATP含量和線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)復(fù)制倍數(shù):裂解細(xì)胞測定蛋白濃度和細(xì)胞內(nèi)ATP含量,單位為納摩爾/克(nmol/g)。試劑盒提取細(xì)胞DNA并測定濃度,檢測ND1基因代表線粒體mtDNA的復(fù)制倍數(shù),GAPDH是內(nèi)部參數(shù)。配置20μl反應(yīng)體系進(jìn)行DNA擴增,用2-ΔΔct方法得出定量結(jié)果。ND1引物序列:上游引物:5′-GGAGTAATCCAGGTCGGT-3′,下游引物:5′-TGGGTACAATGAGGAGTAGG-3′。GAPDH引物序列:上游引物:5′-AAGGTGGAGGAGTGGGTGT-3′,下游引物:5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′。

7.Western blot法檢測脂質(zhì)分解相關(guān)蛋白、線粒體生物合成蛋白表達(dá):冰上裂解細(xì)胞得到蛋白上清液,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,蛋白變性后10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)40μg并轉(zhuǎn)膜。封閉1h,孵育蛋白一抗于4℃下過夜。37℃二抗體孵育1h,ECL顯影固定。使用Image J軟件分析A值,以GAPDH蛋白校正結(jié)果。比較PPARα、CPT-1、PGC-1α、NRF-1和mtTFA的蛋白表達(dá)。

結(jié) 果

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率:LV-PGC-1α干預(yù)過表達(dá)PGC-1α基因,過表達(dá)效果顯著(圖1)。比較3種不同病毒感染復(fù)數(shù)MOI=30、MOI=50、MOI=100在4種轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率,熒光倒置顯微鏡觀察顯示,隨著MOI的增加,慢病毒對HepG2的轉(zhuǎn)染效率逐步增加,并且增高程度呈線性關(guān)系,熒光強度隨轉(zhuǎn)染效率增高。MOI=100,72h時病毒轉(zhuǎn)染加入增強劑P后的轉(zhuǎn)染效率最高,MOI=50接近MOI=100時的轉(zhuǎn)染效率,因此選擇MOI=50,添加增強劑P,轉(zhuǎn)染72h為實驗終點。實時熒光定量PCR測定HepG2細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的PGC-1α顯著過表達(dá),詳見圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后PGC-1α基因過表達(dá)

2.PGC-1α過表達(dá)對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用:油紅O染色檢測細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,與對照組比較,FFA模型組的脂質(zhì)蓄積顯著增加;與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的脂質(zhì)負(fù)荷顯著降低。510nm處的A值組間差異顯著(F=25.431,P<0.001),詳見圖3。LV-PGC-1α干預(yù)顯著降低細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量,詳見表1。

表1 HepG2細(xì)胞內(nèi)TG和TC的含量

圖3 HepG2細(xì)胞油紅O染色觀察脂質(zhì)蓄積情況(×400)及半定量檢測510nm處的A值

3.肝細(xì)胞損傷指標(biāo):與對照組比較,FFA模型組細(xì)胞上清液中ALT和AST顯著增高,LV-PGC-1α干預(yù)組的ALT和AST較LV-control干預(yù)組降低,詳見表2。

表2 細(xì)胞上清液AST和ALT變化

4.肝細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo):與對照組比較,FFA模型組細(xì)胞中的SOD酶活性顯著降低、GSH-PX酶活性顯著降低,MDA含量顯著增加;與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的SOD活性增加,GSH-PX酶活性顯著升高,MDA水平下降,提示PGC-1α可減輕高脂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,詳見表3。

表3 HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)

5.PGC-1α過表達(dá)對HepG2細(xì)胞ATP含量的影響:檢測細(xì)胞ATP含量,組間差異顯著(F=21.675,P<0.001)。與對照組比較,FFA模型組的ATP含量顯著降低(3.80±0.42μmol/g vs 8.08±0.89μmol/g,P<0.001);與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的ATP含量增加(5.30±1.10μmol/g vs 3.82±0.26μmol/g,P<0.05),詳見圖4。

圖4 HepG2細(xì)胞線粒體ATP含量

6.PGC-1α過表達(dá)對HepG2細(xì)胞mtDNA復(fù)制數(shù)作用:結(jié)果顯示,mtDNA復(fù)制數(shù)組間差異顯著(F=13.780,P<0.001),FFA干預(yù)降低細(xì)胞的mtDNA復(fù)制倍數(shù)。與對照組比較、FFA模型組的mtDNA復(fù)制數(shù)顯著降低;與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的mtDNA復(fù)制數(shù)增加,詳見圖5。

圖5 HepG2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)變化

7.Western blot法檢測脂質(zhì)氧化相關(guān)因子、線粒體生物合成因子的蛋白表達(dá):與對照組比較,FFA模型組的脂質(zhì)氧化相關(guān)因子PPARα和CPT-1A的表達(dá)顯著下調(diào)、線粒體生物合成相關(guān)因子PGC-1α、NRF-1、mtTFA的表達(dá)下降。與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組PPARα顯著上調(diào),PGC-1α、NRF-1、mtTFA的表達(dá)顯著增加,詳見圖6、表4。PGC-1α過表達(dá)通過增加線粒體的生物合成,促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解來減輕FFA引起HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積。

表4 各組細(xì)胞脂質(zhì)分解相關(guān)因子、線粒體生物合成因子的蛋白表達(dá)

討 論

NAFLD病理表現(xiàn)為脂質(zhì)異常積聚在肝細(xì)胞,其中棕櫚酸和油酸是人體內(nèi)普遍的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸[11,12]。多項機制研究表明,FFA和TG造成的肝臟脂毒性與NAFLD嚴(yán)重程度密切相關(guān)。FFA激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體應(yīng)激,通過激活氧化應(yīng)激相關(guān)信號通路以及炎性信號通路,誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝紊亂、炎性反應(yīng)和凋亡[13,14]。本研究用FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞造成NAFLD模型,LV-PGC-1α干預(yù)后觀察其對脂質(zhì)蓄積的作用。結(jié)果表明,PGC-1α過表達(dá),細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量顯著降低,脂滴蓄積減少,AST和ALT水平降低,氧化應(yīng)激指標(biāo)下降,細(xì)胞ATP含量增加,mtDNA復(fù)制倍數(shù)增加,脂質(zhì)氧化和線粒體生物合成相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。即PGC-1α通過增強線粒體生物合成、ATP生成、加強脂肪酸氧化分解,降低HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

NAFLD患者肝臟以TG的形式堆積脂肪,而TG主要來源于FFA等的酯化作用[15]。核激素受體包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的遺傳網(wǎng)絡(luò)的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,包括PPARα,固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白等[16,17]。核激素受體不僅能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá),還可以結(jié)合脂質(zhì)分子作為細(xì)胞內(nèi)受體。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c主要控制脂肪酸生物合成基因,PPARα參與調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化,CPT-1是催化脂肪酸氧化的關(guān)鍵限速酶,促進(jìn)脂肪酸分解。肝臟脂質(zhì)的分解途徑有脂肪酸氧化,以極低密度脂蛋白將TG運出肝臟[18]。脂代謝吸收、合成和分解過程中的任何一個環(huán)節(jié)異常,都可能導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過度蓄積。本研究結(jié)果顯示,PGC-1α過表達(dá)后,脂質(zhì)分解相關(guān)基因PPARα和CPT-1上調(diào)。

NAFLD病理情況下,TG分解時脂肪酸β氧化作用加強。線粒體氧化磷酸化過程中會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),適量的ROS被機體的抗氧化系統(tǒng)清除,但是過量的ROS引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激[19]。mtDNA是獨立的雙鏈DNA,因為缺乏DNA修復(fù)酶,更容易受到ROS的攻擊[20]。線粒體既是ROS的主要來源,也是ROS攻擊的主要靶標(biāo)。首先,ROS攻擊mtDNA發(fā)生氧化損傷,氧化應(yīng)激通過形成氧自由基破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸分子(DNA/RNA)的結(jié)構(gòu)與功能。8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷是mtDNA損傷的一種分子標(biāo)志物[21]。氧化應(yīng)激加速細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,期間伴隨著MDA的含量增加,抗氧化酶SOD和GSH-PX經(jīng)過消耗其活性降低[22,23]。其次,線粒體PGC-1α調(diào)控mtDNA的生物合成,表現(xiàn)為其靶基因下調(diào)后,mtDNA的拷貝數(shù)減少,氧化磷酸化速率減慢,使得ATP含量下降[24]。

本研究中PGC-1α過表達(dá)減輕脂質(zhì)氧化應(yīng)激,線粒體生物合成增加,ATP含量上調(diào),脂質(zhì)氧化分解增強,降低肝細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積[25]。先前研究證實,在PGC-1α基因缺乏小鼠的主動脈中NRF-1和mtTFA蛋白表達(dá)下降,加速小鼠主動脈血管的老化,這與本研究結(jié)果一致[26,27]。

綜上所述,FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成過量的TG,造成脂質(zhì)蓄積,引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙,脂質(zhì)氧化速率減緩。本研究進(jìn)一步明確,PGC-1α過表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)分解相關(guān)因子PPARα和CPT-1上調(diào),線粒體生物合成因子NRF-1、mtTFA的表達(dá)顯著增加,增強肝細(xì)胞線粒體的β氧化,降低肝臟的氧化應(yīng)激損傷和脂質(zhì)蓄積,為非酒精性脂肪肝病的治療找到新的作用靶點提供了思路和參考依據(jù)。

本研究也存在一定局限性,如僅探討了NAFLD病變中線粒體生物合成相關(guān)的因子和肝臟脂質(zhì)氧化分解相關(guān)的基因的表達(dá),有待于全面系統(tǒng)探討肝臟脂質(zhì)合成和代謝的其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。肝臟作為人體脂質(zhì)代謝的核心器官,通過調(diào)節(jié)TG和TC的代謝,影響作用于循環(huán)系統(tǒng)的的脂質(zhì)水平,深入探討肝臟線粒體對于脂質(zhì)的調(diào)節(jié)機制,對于預(yù)防和治療高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病具有重要的參考價值。