DHX9調(diào)控白血病細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制研究

黃楠芳 宋 揚(yáng) 郭 娟 張 征 李 曉 許 峰

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種造血干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞的惡性腫瘤,由干擾關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程的遺傳異常積累引起,其特征是分化受損和未成熟血細(xì)胞增殖增加[1,2]。標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療可以實(shí)現(xiàn)疾病緩解,但復(fù)發(fā)難治性疾病仍然是一個(gè)挑戰(zhàn),5年總生存率低于30%[3]。DHX9,也稱為RNA解旋酶A(RHA),是DExH-box解旋酶家族的成員,能夠解開(kāi)RNA和DNA雙鏈體及異常多核苷酸結(jié)構(gòu),在調(diào)控基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄以及DNA復(fù)制等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4,5]。既往研究表明,DHX9與結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌等多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),但目前為止,DHX9在白血病中的表達(dá)及發(fā)病機(jī)制中的作用尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4,6～8]。DHX9家族成員DHX15、DDX41已被報(bào)道與AML發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),進(jìn)一步表明RNA解旋酶家族的異常有助于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展[9,10]。因此,本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)分析及構(gòu)建低表達(dá)DHX9的白血病細(xì)胞系,探討DHX9在白血病中的表達(dá)水平及作用機(jī)制。

材料與方法

1.GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析:歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)發(fā)起的MILE研究納入542例AML患者、207例骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者、76例慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者及74例非白血病/健康對(duì)照的基因表達(dá)譜分析。數(shù)據(jù)分析采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(美國(guó)Affymetrix公司)分析。數(shù)據(jù)處理最終生成每個(gè)微陣列的探針集水平相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度,該信號(hào)值(202420_s_at)代表了DHX9的相對(duì)表達(dá)水平。

2.主要試劑和儀器:K562細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存株。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,100X青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司,IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,慢病毒及促轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技有限公司,全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,ECL發(fā)光液試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR試劑盒均購(gòu)自蘇州EZB生物有限公司,抗DHX9抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,抗caspase-9、Bcl-2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signalling Technology公司,二抗山羊抗鼠購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,抗β-actin抗體購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司,引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司,蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng):K562細(xì)胞復(fù)蘇后接種在含10%胎牛血清、1%100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中,置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱,每?jī)商靷鞔驌Q液1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4.病毒感染:用完全培養(yǎng)基制備2ml密度為105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液并接種至6孔板,根據(jù)復(fù)感染指數(shù)(MOI=50)加入慢病毒和促轉(zhuǎn)染試劑,置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育12～16h后,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染48h后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株。

5.細(xì)胞總mRNA提取及qPCR檢測(cè):細(xì)胞總mRNA提取及qPCR檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。提取細(xì)胞RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以此為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:1μl cDNA,5μl SYBR Green qPCR Master Mix,0.2μl Primer F/R(10μmol/L),3.6μl ddH2O。擴(kuò)增程序:95℃5min,95℃10s,60℃30s,循環(huán)數(shù)40,以GAPDH為內(nèi)參基因,用2-△△CT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,擴(kuò)增引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

6.Western blot法檢測(cè):取電泳凝膠,每孔加入20μg細(xì)胞總蛋白,120V恒壓電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉,切取目的條帶,加入1∶1000稀釋的抗體4℃搖床孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次,每次10min,加入1∶5000稀釋的二抗,室溫?fù)u床孵育1h,TBST洗滌3次,使用ECL發(fā)光液檢測(cè)結(jié)果,并用Image J計(jì)算灰度值。

7.Annexin V-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,PBS洗滌兩遍,1000×g離心5min,棄上清,加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,加入5μl Annexin V-FITC、10μl碘化丙啶染色液,輕輕混勻,室溫(20～25℃)避光孵育10～20min,隨后置于冰浴,1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

8.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將等量對(duì)照組和DHX9敲低組K562細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),并分別于24、48、72和96h加入10μl CCK-8(cell counting kit-8)試劑孵育1.5h,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度。以每孔吸光度為縱坐標(biāo)繪制增殖曲線。

9.Gene expression microarray(GEM):用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)掃描儀掃描芯片的熒光信號(hào)強(qiáng)度,使用Partek基因組學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Robust Multi-Array Average(RMA)算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,使用Cluster 3.0軟件對(duì)基因和樣本進(jìn)行分層聚類,在對(duì)照(n=3)和DHX9敲低的K562細(xì)胞(n=3)之間鑒定差異基因表達(dá)譜。

結(jié) 果

1.DHX9基因在AML、MDS及CML中的表達(dá):通過(guò)分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中542例AML、207例MDS、76例CML患者和74例對(duì)照樣本(GSE13159)基因芯片中DHX9 表達(dá)水平,AML組DHX9基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高(P<0.01),較MDS組及CML組也明顯增高(P均<0.001);而CML組DHX9表達(dá)水平明顯低于AML、MDS及對(duì)照組(P均<0.001),詳見(jiàn)圖1。

圖1 GEO數(shù)據(jù)集(GSE13159)中DHX9在AML、MDS及CML中的表達(dá)

2.慢病毒介導(dǎo)的DHX9敲低體系構(gòu)建及驗(yàn)證:為了研究DHX9在AML中的作用機(jī)制,筆者在AML細(xì)胞系K562中構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的DHX9敲低體系。病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)qPCR檢測(cè)顯示,DHX9表達(dá)水平明顯下降(0.48±0.06,P<0.01,圖2A),進(jìn)一步的Western blot法驗(yàn)證了DHX9敲低效率(圖2B)。

圖2 DHX9敲低對(duì)K562細(xì)胞凋亡及增殖的影響A.轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞中DHX9mRNA表達(dá)水平;B.轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞中DHX9蛋白質(zhì)水平;C、D.Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;E.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001

3.DHX9對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響:Annexin V-PI實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DHX9敲低細(xì)胞株呈現(xiàn)增高的細(xì)胞自身凋亡率(7.10%±0.26% vs 3.14%±0.42%,P<0.001,圖2中C、D)。當(dāng)加入抗腫瘤藥物阿扎胞苷(5-azacytidine,AZA)(4μmol/L)處理48h后,再次檢測(cè)DHX9敲低和對(duì)照細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,DHX9敲低細(xì)胞株對(duì)阿扎胞苷凋亡敏感度明顯高于對(duì)照細(xì)胞株(11.29%±1.51% vs 8.20%±0.97%,P<0.05,圖2中C、D)。DHX9敲低導(dǎo)致K562細(xì)胞凋亡增加,并增加其對(duì)抗腫瘤藥物的凋亡敏感度。

4.DHX9對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響:CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照細(xì)胞株增殖迅速,而DHX9敲低細(xì)胞增殖緩慢,增殖曲線明顯低平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖2E)。DHX9敲低明顯抑制K562細(xì)胞的增殖。

5.GEM和生物信息分析鑒定DHX9調(diào)控p53信號(hào)通路:針對(duì)DHX9敲低的K562細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,獲得了2264個(gè)差異基因(圖3A)。生物信息的分析顯示,差異表達(dá)基因主要富集在癌癥通路、凋亡和p53通路(P均<0.001,圖3B)。

圖3 DHX9調(diào)控p53信號(hào)通路A.GEM鑒定差異表達(dá)基因;B.通路分析差異表達(dá)基因主要富集在癌癥通路、凋亡、p53信號(hào)通路

6.DHX9對(duì)p53相關(guān)凋亡通路的影響:p53凋亡通路的抑制是急性白血病細(xì)胞凋亡抵抗及化療耐藥的重要機(jī)制。為進(jìn)一步研究DHX9調(diào)控AML細(xì)胞凋亡的機(jī)制,通過(guò)Western blot法檢測(cè)p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白caspase-9表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)下降。上述結(jié)果表明,抑制DHX9表達(dá)能夠激活p53信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

討 論

DHX9是DExH-box解旋酶家族的成員,能夠解開(kāi)RNA和DNA雙鏈體及異常多核苷酸結(jié)構(gòu),調(diào)控基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄以及DNA復(fù)制等過(guò)程[4,5]。DHX9與多種基因存在相互作用,TDRD3通過(guò)其Tudor結(jié)構(gòu)域直接與DHX9相互作用,協(xié)同抑制啟動(dòng)子相關(guān)R-Loop的形成[11]。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí),DHX9能夠促進(jìn)斷裂DNA末端切除,并協(xié)同BRCA1驅(qū)動(dòng)同源重組修復(fù),維持基因組穩(wěn)定性[12]。DHX9還能與SNORA42相互作用并觸發(fā) DHX9/p65 軸來(lái)促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展[13]。使用Crispr/Cas9敲除多種細(xì)胞系DHX9基因均以失敗告終,小鼠DHX9的純合缺失導(dǎo)致胚胎致死效應(yīng),表明DHX9的功能是必不可少的[12]。研究表明,DHX9與多種實(shí)體腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān),在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中,DHX9表達(dá)顯著上調(diào),并能促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6,14]。

圖4 DHX9敲低對(duì)caspase-9、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響A.Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、Bcl-2的表達(dá)水平,β-actin作為內(nèi)參基因;B.caspase-9、Bcl-2表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001

DHX9在結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá),通過(guò)刺激NF-κB靶基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、抗凋亡及侵襲[4]。DHX9表達(dá)上調(diào)還與前列腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[5]。然而,在甲狀腺癌中,沉默DHX9增強(qiáng)了癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]。盡管DHX9在實(shí)體腫瘤中研究廣泛,但目前尚缺乏在血液惡性腫瘤中的研究報(bào)道。DHX9家族成員DHX15、DDX41已被報(bào)道與AML發(fā)病相關(guān),其中DDX41胚系突變被認(rèn)為是>5% AML患者的病因,表明RNA解旋酶家族的異常有助于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展[10,16]。DHX9可能同樣在血液惡性腫瘤的發(fā)生及疾病進(jìn)展機(jī)制中發(fā)揮著調(diào)控作用。

p53作為一種轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)參與細(xì)胞周期停滯、凋亡及DNA修復(fù)等過(guò)程的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),因而在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17,18]。p53是腫瘤發(fā)生和治療過(guò)程中的關(guān)鍵基因,腫瘤組織p53水平升高是一些抗腫瘤藥物發(fā)揮效應(yīng)所必需的[19]。據(jù)報(bào)道,p53在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),因此,重新激活p53可能是治療腫瘤的新策略[20]。鐵螯合劑地拉羅司增強(qiáng)線粒體功能障礙,并通過(guò)穩(wěn)定p73來(lái)恢復(fù)p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),改善OS并延緩MDS白血病轉(zhuǎn)化[21]。順鉑通過(guò)ATR/ATM及其下游靶標(biāo)信號(hào)介導(dǎo)p53信號(hào)激活,在白血病中發(fā)揮獨(dú)特的抗癌作用[20]。研究表明,DHX9協(xié)同p53調(diào)控細(xì)胞生命進(jìn)程。在人原代成纖維細(xì)胞中,DHX9缺失以p53依賴的方式阻斷DNA復(fù)制,導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)早衰老[22]。Dong等[23]在DHX9缺陷小鼠的胸腺上皮細(xì)胞中觀察到p53信號(hào)通路上調(diào)。上述研究揭示DHX9對(duì)p53存在調(diào)控作用。DHX9作為一種依賴于RNA和DNA的解旋酶,與DNA損傷和修復(fù)相關(guān);而p53作為一種腫瘤抑制因子,在涉及多種信號(hào)通路的DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮核心作用[24]。DNA的損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡可能是聯(lián)系DHX9和p53的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示,在AML中,DHX9表達(dá)水平顯著上調(diào)。通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)DHX9的K562細(xì)胞發(fā)現(xiàn),敲低DHX9顯著增加細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,并增加細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物阿扎胞苷的敏感度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DHX9缺乏引起的差異表達(dá)基因顯著富集在p53信號(hào)通路,且敲低DHX9后,凋亡相關(guān)蛋白caspase-9表達(dá)增加,Bcl-2則表達(dá)下調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抑制DHX9能夠激活p53依賴的細(xì)胞凋亡程序,提示DHX9可能作為一種致癌基因,促進(jìn)AML細(xì)胞的增殖。然而,DHX9在其他血液腫瘤或白血病的其他細(xì)胞系是否也有同樣的調(diào)控作用,以及DHX9通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控p53信號(hào)通路有待于進(jìn)一步研究。

AML是一種高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,約占成人白血病的70%[25]。從高劑量阿糖胞苷和柔紅霉素的“7+3”療法,到同種異體干細(xì)胞移植,近年來(lái),隨著對(duì)AML的逐步了解,以靶向藥物為代表的新型療法在抗腫瘤治療中獲得顯著療效[26]。然而,復(fù)發(fā)難治性白血病仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。進(jìn)一步闡明發(fā)病機(jī)制,尋找早期診治靶點(diǎn)需求十分迫切。由于DHX9在多種惡性腫瘤中存在過(guò)表達(dá),抑制DHX9對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有致死性,因此,可能成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)[27]。本研究探討了DHX9在AML中的生物學(xué)功能,揭示了DHX9對(duì)p53信號(hào)通路的調(diào)控作用,并提出DHX9可能作為一種致癌基因促進(jìn)AML的發(fā)生、發(fā)展。