MAO-A通過激活ROS/JNK通路加重心肌細胞脂質(zhì)沉積

代地林 吳 園 包明威

肥胖是影響心肌肥大和心力衰竭的獨立危險因素,減重可以逆轉(zhuǎn)部分心臟重構(gòu)。2016年WHO報道,全球有超過19億成年人(≥18歲)超重,超過6.5億人肥胖[1]。預計到2030年,將有21.6億人超重,11.2億人肥胖[2]。研究顯示,交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活是肥胖的早期改變,表現(xiàn)為全身去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)溢出增加以及心率變異性降低[3]。除了交感神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)外,肥胖還表現(xiàn)為血脂異常、胰島素抵抗、脂肪積累等病理生理改變,這些改變是促進心血管疾病發(fā)生的危險因素[4]。

單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)是一種定位于線粒體外膜的酶,它通過分解代謝NE等神經(jīng)胺產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[5]。大量的ROS生成和隨后的氧化應激可能通過靶向線粒體功能來影響心肌細胞的存活和功能,從而促進心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[6, 7]。雖然MAO-A發(fā)揮作用的具體機制尚不清楚,但在幾種模型的心臟中,已發(fā)現(xiàn)MAO-A水平增加對心臟功能有損害作用[7, 8]?；贛AO-A對神經(jīng)胺的降解作用,MAO-A抑制劑在臨床上已用于抑郁癥患者的治療以及作為治療壓力負荷性心力衰竭等心臟病的工具藥而被廣泛研究[9～11]。本研究旨在探討MAO-A對高脂環(huán)境培養(yǎng)的心肌細胞脂質(zhì)沉積的影響及其機制。

材料與方法

1.實驗儀器與試劑:微量分光光度計(中國杭州奧盛儀器有限公司)、DG-3022A酶標儀(美國ThermoFisher公司)、實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、光學正置顯微鏡(日本Olympus公司)。3T3-L1前脂肪細胞購自中國拜意爾生物技術(shù)有限公司,Ⅱ型膠原酶購自德國Biofroxx公司,胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司,DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司,100U/ml青霉素-鏈霉素(PS)購自美國Genom公司,溴脫氧尿苷(Brdu)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、油紅O染液、Mayer蘇木精、胰島素(10μg/ml)、地塞米松(0.25μmol/L)和3-異丁基-1-的誘導劑Ⅰ甲基黃嘌呤 (IBMX, 0.5mmol/L)購自美國Sigma公司,Transwell 小室(孔徑為 0.4μm)購自美國Corning公司,DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Fluoromount-G?封片液購自美國southernbiotech公司,棕櫚酸(palmitic acid,PA)購自西安鯤創(chuàng)科技有限公司,NE、氯吉蘭(clogyline,CLG)購自美國MCE公司,Trizol試劑購自英國Ambion公司,甲醛、60%異丙醇購自國藥集團化學試劑有限公司,α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin,α-SCA)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,JNK購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,p-JNK購自美國Cell Signaling Technology公司。

2.心肌細胞的分離與培養(yǎng):40只出生1～3天的SD大鼠由武漢大學動物實驗中心提供。將整個心臟無菌取出后,用預冷的PBS洗滌液清洗數(shù)次,除去殘留的血液和多余的組織。將心臟組織剪成約1cm3的組織碎塊并轉(zhuǎn)移至含有Ⅱ型膠原酶和0.25%胰酶的消化液中,在37℃的水浴鍋中消化5min,收取上清于裝有等體積含有10%胎牛血清的終止液中終止消化。反復重復以上消化步驟,直至心臟組織消化完全。收取的上清11000×g離心10min,棄上清,加入等體積含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液,吹打混勻,用0.22μm的細胞濾器過濾后均勻地種在培養(yǎng)皿中,放于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5h。吸取上清于離心管中,11000×g離心5min,棄上清。用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液懸浮細胞、計數(shù)、均勻地種在6孔板和裝有爬片的12孔板中。避光環(huán)境下加入Brdu溶液(終濃度為0.1mmol/L)抑制非肌細胞的生長。將孔板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)細胞的生長情況定期更換培養(yǎng)液。所有實驗方案均經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理學審批號:WDRM 20210814)。

3.心肌細胞鑒定及細胞面積測定:細胞爬片經(jīng)4%甲醛固定、0.5% Triton X-100室溫通透、山羊血清封閉后,加入α-SCA(1∶100)一抗稀釋液并放入濕盒,4℃孵育過夜。棄去一抗稀釋液,加入Cy3標記的羊抗兔二抗稀釋液,39℃孵育1h。滴加DAPI避光孵育5min,對標本進行染核,PBS清洗多余的DAPI,用吸水紙吸干爬片上的液體,用Fluoromount-G?封片液封片,鏡下觀察心肌細胞形態(tài)并采集圖像。自加入二抗開始,所有操作于暗室進行。使用Image-Pro Plus軟件分析平均心肌細胞面積。

4.NRCM/3T3-L1共培養(yǎng)體系的建立、細胞處理與分組:將3T3-L1前脂肪細胞種植在Transwell小室中誘導成熟,誘導方法如文獻[12]所述。簡單來說,將 3T3-L1 前脂肪細胞接種在Transwell小室的上室,密度為5×105個細胞/平方厘米,并在含有添加10% FBS 和1% PS的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48h后,將基礎培養(yǎng)基更換為含有DMEM、10% FBS、1% PS、胰島素(10μg/ml)、地塞米松(0.25μmol/L)和IBMX(0.5mmol/L)的誘導劑Ⅰ。48h后,將誘導劑Ⅰ更換為含有DMEM、10% FBS、1% PS和胰島素(10μg/ml)的誘導劑Ⅱ。48h后,再次將誘導劑Ⅱ換成基礎培養(yǎng)基,每2天更換1次基礎培養(yǎng)基。3T3-L1前脂肪細胞誘導成熟(3T3-L1脂肪細胞)后,將Transwell小室移至種有心肌細胞的孔板上,并加入含有PA(400μmol/L)的培養(yǎng)液孵育18h構(gòu)建NRCM/3T3-L1共培養(yǎng)體系。接下來,在共培養(yǎng)體系中分別加入含有NE(1μmol/L)、H2O2(200μmol/L)和CLG(MAO-A特異性抑制劑,1μmol/L)的培養(yǎng)液孵育,將細胞分為對照組(心肌細胞單獨培養(yǎng))、PA組(心肌細胞與3T3-L1脂肪細胞共培養(yǎng),并加入PA)、NE組(心肌細胞與3T3-L1脂肪細胞共培養(yǎng),并加入PA、NE)、H2O2組(心肌細胞與3T3-L1脂肪細胞共培養(yǎng),并加入PA、H2O2)、NE+CLG組(心肌細胞與3T3-L1脂肪細胞共培養(yǎng),并加入PA、NE、CLG)、CLG組(心肌細胞與3T3-L1脂肪細胞共培養(yǎng),并加入PA、CLG),48h后收取心肌細胞進行后續(xù)的檢測。藥物作用濃度和時間的選擇基于既往研究[13～16]。

5.實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR):取心肌細胞,加入Trizol試劑提取RNA。用微量分光光度計測定A260、A280以及A260/A280,計算RNA的純度和濃度。根據(jù)測得的濃度取適量RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將cDNA于50℃ 2min,95℃ 10min;95℃ 30s,60℃ 30s,40個循環(huán)的反應參數(shù)下進行實時RT-qPCR檢測。繪制溶解曲線,獲得的測定數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。使用GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_量進行校正。心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)上游引物: 5′-GCCGGTAGAAGATGAGGTCA-3′, 下游引物: 5′-GCAGATCTATCGGAGGGGTC-3′。

6.心肌細胞內(nèi)ROS水平測定:細胞爬片經(jīng)DHE染料染色、4%甲醛固定后,在細胞爬片上滴加hoechst33342染液,室溫孵育5min。吸水紙吸去爬片上多余的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后,鏡下觀察心肌細胞熒光染色情況并采集圖像。以上操作均在暗室中進行。使用Image-Pro Plus軟件分析心肌細胞DHE染色的熒光強度。

7.油紅O染色:細胞爬片經(jīng)4%甲醛固定、60%異丙醇浸洗后,用油紅O染液染色10min。再用60%異丙醇分色至背景無色后,使用Mayer蘇木精復染、PBS浸洗藍化、蒸餾水洗后,使用Fluoromount-G?封片液封片。鏡下觀察心肌細胞脂滴染色情況并采集圖像。使用Image-Pro Plus軟件分析心肌細胞內(nèi)脂滴含量。

8.Western blot法檢測:取心肌細胞,經(jīng)漂洗、裂解、離心后,收集細胞蛋白。取適量蛋白上清稀釋,使用DG-3022A酶標儀測定A568,計算樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠,制備好的蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗稀釋液,4℃孵育過夜。洗去多余的一抗,用二抗稀釋液室溫孵育2h。洗去多余的二抗,增強化學發(fā)光顯影。條帶灰度值用Image-Pro Plus軟件測量。將目的條帶與內(nèi)參GAPDH的比值作為半定量指標。

結(jié) 果

1.原代心肌細胞的鑒定:免疫熒光染色顯示,大于95%的細胞為心肌細胞(圖1)。

圖1 原代心肌細胞鑒定(免疫熒光染色)A.α-SCA;B.DAPI;C.Merge。紅色代表原代心肌細胞胞質(zhì),藍色代表細胞核

2.3T3-L1共培養(yǎng)體系加PA刺激能誘導心肌細胞肥大表型:與對照組比較,PA組中的心肌細胞面積(14.681±0.481μm2vs 19.932±0.220μm2,P<0.01)明顯增大,且心肌細胞肥大標志物ANP的相對mRNA水平(1.006±0.017 vs 1.914±0.152,P<0.01)也明顯增加,說明3T3-L1共培養(yǎng)體系加PA能誘導心肌細胞肥大表型(圖2)。

圖2 3T3-L1共培養(yǎng)體系加PA能誘導心肌細胞肥大表型A.-SCA染色的熒光顯微照片。紅色代表α-SCA染色的原代心肌細胞胞質(zhì),藍色代表細胞核;B.α-SCA染色觀察心肌細胞面積變化的半定量統(tǒng)計結(jié)果;C.心肌細胞肥大標志物ANP的相對mRNA水平

3.氯吉蘭抑制心肌細胞內(nèi)單胺氧化酶A的蛋白水平:與對照組比較,PA組心肌細胞內(nèi)MAO-A相對蛋白水平(0.117±0.022 vs 0.430±0.092,P<0.01)增加;與PA組比較,NE明顯增加心肌細胞中MAO-A的相對蛋白水平(0.430±0.092 vs 1.114±0.091,P<0.01),CLG降低心肌細胞中MAO-A相對蛋白水平(0.430±0.092 vs 0.251±0.054,P<0.05);與NE組比較,NE+CLG組的MAO-A相對蛋白水平明顯降低(1.114±0.091 vs 0.599±0.062,P<0.01,圖3)。

圖3 氯吉蘭抑制單胺氧化酶A的蛋白水平A.MAO-A的Western blot法條帶圖;B.MAO-A相對蛋白水平的定量分析。*P<0.05,**P<0.01

4.抑制MAO-A降低心肌細胞內(nèi)ROS水平:與對照組比較,PA組心肌細胞內(nèi)ROS水平(0.001±0.001 vs 0.004±0.002,P<0.01)增加;與PA組比較,NE明顯增加心肌細胞內(nèi)ROS水平(0.004±0.002 vs 0.013±0.001,P<0.01);與NE組比較,NE+CLG組心肌細胞內(nèi)ROS水平(0.013±0.001 vs 0.006±0.001,P<0.01)明顯降低,說明抑制MAO-A的相對蛋白水平可減少心肌細胞內(nèi)的氧化應激(圖4)。

圖4 抑制MAO-A對心肌細胞內(nèi)ROS的影響A.原代心肌細胞DHE免疫熒光染色代表圖。紅色代表DHE熒光;B.DHE免疫熒光染色觀察心肌細胞內(nèi)ROS水平的半定量統(tǒng)計結(jié)果

5.抑制MAO-A改善心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積:與對照組比較,PA組心肌細胞的脂滴面積比(0.001±0.001 vs 0.054±0.002,P<0.01)增加;與PA組比較,NE和H2O2均明顯增加心肌細胞的脂滴面積比(0.054±0.002 vs 0.106±0.005,P<0.05;0.054±0.002 vs 0.092±0.002,P<0.01);與NE組比較,NE+CLG組心肌細胞的脂滴面積比(0.106±0.005 vs 0.072±0.001,P<0.01)明顯減少,說明抑制MAO-A的相對蛋白水平可部分減少心肌細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積(圖5)。

圖5 抑制MAO-A對心肌細胞內(nèi)脂滴含量的影響A.原代心肌細胞油紅O染色代表圖。紅色代表脂滴,紫色代表細胞核;B.油紅O染色觀察心肌細胞內(nèi)脂滴含量的半定量統(tǒng)計結(jié)果。*P<0.05,**P<0.01

6.抑制MAO-A降低心肌細胞內(nèi)JNK信號通路蛋白的磷酸化水平:Western blot法檢測結(jié)果顯示,各組心肌細胞內(nèi)JNK總蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計學意義;與對照組比較,PA組心肌細胞內(nèi)p-JNK的相對蛋白水平(0.032±0.007 vs 0.263±0.119,P<0.05)增加;與PA組比較,NE和H2O2明顯增加心肌細胞內(nèi)p-JNK的相對蛋白水平(0.263±0.119 vs 0.969±0.082,P<0.05; 0.263±0.119 vs 0.640±0.101,P<0.05),CLG可明顯降低NE引起的異常改變,說明抑制MAO-A可以下調(diào)JNK信號通路(圖6)。

圖6 抑制MAO-A對心肌細胞內(nèi)JNK信號通路的影響A.JNK、p-JNK的Western blot法條帶圖;B.JNK、p-JNK相對蛋白水平的定量分析。*P<0.05,**P<0.01

討 論

肥胖導致全身交感神經(jīng)過度激活和許多代謝性病理變化,如血脂異常、胰島素抵抗、脂肪細胞的增殖和肥大等[3,4,17]。本研究使用3T3-L1脂肪細胞與原代心肌細胞在含有PA的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)來模擬肥胖大鼠心肌細胞脂肪浸潤的內(nèi)環(huán)境。通過在共培養(yǎng)體系中加入NE和H2O2來探索MAO-A對高脂培養(yǎng)的心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響及機制。NE和H2O2分別用于模擬肥胖大鼠交感過度激活及氧化應激的狀態(tài)。眾所周知,MAO-A可通過降解底物去甲腎上腺素、血清素等神經(jīng)胺產(chǎn)生ROS[6,7]。MAO-A驅(qū)動的H2O2產(chǎn)生已被證實會引起不同類型的細胞反應,如肥大和死亡等[7,18]。近年來,MAO-A介導的氧化應激在心血管疾病中的作用逐漸成為研究熱點[19,20]。

本研究評估了MAO-A是否可以被外源性MAO-A底物NE激活及其對心肌細胞的影響。在共培養(yǎng)體系中,筆者使用NE和CLG處理細胞,發(fā)現(xiàn)NE處理細胞不僅增加了心肌細胞內(nèi)MAO-A的相對蛋白水平,還增加了心肌細胞內(nèi)ROS水平和脂滴含量,這些變化可被CLG抑制。另外,筆者發(fā)現(xiàn),CLG組心肌細胞內(nèi)ROS水平與PA組比較差異無統(tǒng)計學意義,說明MAO-A以依賴NE的方式引起心肌細胞內(nèi)的氧化應激。這與Manzella等[20]的研究一致,即用NE處理H9c2細胞會增加MAO-A介導的氧化應激水平。

為了評估MAO-A誘導的氧化應激是否增加JNK信號通路蛋白的磷酸化以及脂質(zhì)沉積,筆者在NRCM/3T3-L1共培養(yǎng)體系中用H2O2孵育來誘導心肌細胞氧化應激損傷。結(jié)果顯示,與PA組比較,H2O2組的心肌細胞中JNK的磷酸化水平和脂質(zhì)沉積明顯增加。Imam等[18]研究也顯示,使用H2O2處理的心肌細胞表現(xiàn)出JNK磷酸化增加,這與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果說明,MAO-A引起的氧化應激是引起心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的一個重要原因。JNK是一種應激活化蛋白激酶,屬于有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)超家族,可由肥胖和過量飲食糖激活,從而介導炎癥、異常脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗[21,22]。本研究中雖然沒有評估JNK信號通路在脂質(zhì)沉積中的作用,但前期有大量研究表明,使用JNK抑制劑或siRNA介導的JNK敲低均可明顯改善心肌細胞中脂質(zhì)沉積[23,24]。

綜上所述,MAO-A相對蛋白水平增加是導致高脂培養(yǎng)的心肌細胞內(nèi)ROS水平、以及JNK磷酸化水平和脂質(zhì)沉積增加的重要原因,其機制可能與ROS/JNK信號級聯(lián)反應激活有關(guān)。本研究為肥胖相關(guān)心臟損害的體內(nèi)研究和臨床研究提供了新的干預靶點。