姜黃素聯(lián)合5-氨基水楊酸介導Notch信號通路治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的分子機制研究

薛永舉,楊 麗,柯希權(quán),朱 玉,王 猛

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是以非特異性炎癥病變?yōu)橹鞯哪c道疾病,病變位置可累及直腸和結(jié)腸黏膜層[1],其病因主要為遺傳傾向、環(huán)境觸發(fā)因素、腸道微生物作用和免疫失調(diào)[2]。UC的臨床特征為持續(xù)性或復發(fā)性腹瀉、大便伴黏液血或化膿、腹痛和各種全身癥狀[3]。這種疾病很難治愈,目前治療主要針對癥狀緩解[1]。UC的并發(fā)癥包括貧血、低蛋白血癥、中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔和下消化道出血,嚴重威脅病人的健康[4]。近年來,隨著飲食習慣的改變,UC的患病率急劇上升。

5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)在治療輕中度UC的臨床試驗中起重要作用[5],主要以抑制環(huán)氧合酶和脂加氧酶的活性在臨床治療中起作用[6]。但近段時間內(nèi)也有研究[7]報道,5-ASA 可以影響腸道微生物群的生長環(huán)境,從而改變腸道微生物的黏附力和持久性[7],導致UC病人在治療后腸道黏膜細菌減少。因此,需要一種更可靠、風險更低有抗炎治療作用的藥用植物或其活性成分,尤其是含食物驅(qū)動成分。姜黃素(二阿魏酰甲烷)就是這樣一種具有廣泛治療應用的化合物。已證明具有廣泛的生物和藥理活性,大量研究證據(jù)支持姜黃素的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和傷口愈合作用[8-12]。有Meta分析顯示,姜黃素輔助療法可有效緩解UC病人的臨床病情,而不會引起嚴重不良反應[13]。由于其溶解性和生物利用度較差,天然姜黃素無法發(fā)揮其治療功效的全部潛力。因此,為了提高姜黃素的生物利用度,將其與5-ASA進行復合。本研究將探究姜黃素與5-ASA聯(lián)合使用是否能夠在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導UC大鼠中發(fā)揮更顯著的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 本實驗所使用的動物均為SD大鼠,采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號:SCXK(湘)2019-0004)。飼養(yǎng)和繁殖均在湖南斯萊克景達實驗動物有限公司醫(yī)藥實驗動物中心恒溫室(24±2)℃中,每日光照/黑暗循環(huán)各12 h,用常規(guī)標準飼料喂養(yǎng),自由獲取食物和水。SD大鼠為雄性,體質(zhì)量180～220 g,飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃,濕度40%～70%的條件下。所有動物實驗嚴格遵照動物護理和使用委員會的指南進行。

1.2 實驗試劑 姜黃素(貨號:C7090,廠家:索來寶);5-ASA(貨號:14055,廠家:MCE);TNBS(貨號:SLCK4178,廠家:Sigma);蘇木素染液(貨號:ZLI-9610,廠家:中衫金橋);伊紅染色液(貨號:G1100,廠家:索來寶);Mouse Monoclonal Anti-Actin(貨號:TA-09,廠家:中杉金橋);辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)(貨號:ZB-2305,廠家:中杉金橋);目的一抗:Rabbit Anti Notch1(貨號:af5037,廠家:affinify);目的一抗:Rabbit Anti HESL (貨號:df7569,廠家:affinify);目的一抗:Rabbit Anti Jagged1(貨號:bs-1448R,廠家:Bioss);Trizon Reagent(貨號:CW0580S)和超純RNA提取試劑盒(貨號:CW0581M)北京康為世紀生物科技有限公司;HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(貨號:R223-01)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號:Q711-02)采購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司 。

1.3 實驗儀器 顯微鏡(型號:CX43)采購于奧林巴斯(中國)有限公司;切片機(型號:2235)采購于徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司;全自動酶標儀(型號:WD-2102B)和蛋白垂直電泳儀(型號:DYY-6C)采購于北京市六一儀器廠;高速臺式冷凍離心機(型號:H1750R)采購于湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;熒光PCR儀(型號:CFX Connect 實時)采購于伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠UC模型制備 大鼠經(jīng)禁食不禁水48 h,麻醉后由肛門輕緩插入直徑為2 mm的橡膠輸液管,深度為7 cm,輸液管內(nèi)裝有TNBS(按照2 mL/kg溶入0.25 mL的50%乙醇中)。使用注射器來推動橡膠輸液管中的TNBS,使之注入大鼠結(jié)腸,隨后將大鼠持續(xù)倒置60 s。隨后讓大鼠平躺在籠中,等待自然清醒,任其自由飲食。48 h后取2只模型組大鼠的結(jié)腸組織觀察及HE染色,肉眼可見模型組結(jié)腸黏膜充血水腫,伴壞死及潰瘍形成,HE染色見結(jié)腸組織炎細胞浸潤及隱窩炎甚至隱窩膿腫形成,證明模型制備成功(見圖1)。

1.4.2 藥物治療處理 將18只UC大鼠隨機分組進行藥物治療,分為5-ASA組、姜黃素中劑量組和姜黃素中劑量+5-ASA 組,每組各6只。對模型組UC大鼠每天以5 mL/kg的5-ASA進行灌胃,對姜黃素中劑量組UC大鼠每天以5 mL/kg的姜黃素溶液進行灌胃,對姜黃素中劑量+5-ASA聯(lián)用組UC大鼠每天以5 mL/kg的姜黃素溶液和5-ASA進行灌胃,模型組和正常組大鼠以溶劑對照按相同方式灌胃處理,共灌胃10 d。

1.4.3 疾病活動指數(shù)(DAI)評分 各組大鼠注藥后每日觀察它們的一般情況,如精神狀態(tài)、進食、活動和大便情況等,并每天使用聯(lián)苯胺法測大便隱血,根據(jù)觀察結(jié)果進行DAI評價。DAI 評分標準見表1。

表1 DAI評分標準

1.4.4 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI) 處死動物觀察大體標本并評價CMDI。CMDI評分標準見表2。

表2 CMDI評分標準

1.4.5 HE染色和組織學評分 大鼠結(jié)腸黏膜石蠟切片,先進行烤片、脫蠟、水化,再用蘇木素染液染色3～5 min,經(jīng)流水沖洗后,用1%鹽酸乙醇分化,反藍液反藍,伊紅染色3～5 min后,切片脫水,封片,在顯微鏡(BX43,Olympus)下觀察,進行組織學評分。組織學指標包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、病變深度及纖維化,按有無及輕重分別記0、1、2分,病變深度達黏膜下層、肌層、漿膜層分別計1、2、3分,各項相加得總分。

1.4.6 免疫組織化學 免疫組織化學可以檢測大鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)Notch信號通路中Notch1、jaggled1、Hes1的蛋白表達情況。大鼠結(jié)腸黏膜切片,烤片、脫蠟、水化后,用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。經(jīng)5% BSA抗原封閉2 h后,用Notch1(1∶100,兔抗)、jaggled1(1∶100兔抗)、Hesl(1∶100兔抗)進行一抗孵育,4 ℃過夜后,進行辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶100)孵育,經(jīng)DAB適當時間顯色,再用蘇木精復染反藍,用梯度乙醇和二甲苯脫水透明后,用中性樹脂進行封片,最后在顯微鏡(BX43,Olympus)下進行觀察,拍片記錄。

1.4.7 Western blotting 取大鼠結(jié)腸黏膜組織適當重量,加入磷酸酶蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液的混合物,用組織研磨儀進行研磨,提取組織總蛋白(對于細胞:取細胞,棄去培養(yǎng)基,用RIPA裂解液提取總蛋白)。在4 ℃、16 000 g的設(shè)定條件下,高速離心機離心15 min,仔細吸取上清液避免吸取到EP管底沉淀物質(zhì),用BCA蛋白測定法來進行蛋白定量。對蛋白樣品進行變性后,進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE),后用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(millipore)后用脫脂奶粉室溫搖床上封閉2 h后,用TBST清洗3×10min,隨后在4 ℃條件下過夜孵育一抗,次日用TBST清洗3×10 min,室溫搖床上孵育二抗2 h,漂洗3×10 min。用ECL顯影液浸濕PVDF膜,置于超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司)中進行顯影。

1.4.8 RT-PCR 采用Trizol試劑提取結(jié)腸黏膜組織中的總RNA,采用RNA 超純提取試劑盒提取mRNA,利用紫外可見分光光度計測定mRNA的濃度和純度(OD260/OD280),通過RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,采用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應步驟如下:預變性 95 ℃,10 min;變性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,基因的相對表達量根據(jù)2-△△Ct法計算。引物序列見表3。

表3 引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對UC大鼠疾病活動和結(jié)腸黏膜損傷的影響 各組大鼠結(jié)腸組織對比,可以看出除對照組外,其余各組結(jié)腸黏膜均有不同程度損傷,模型組損傷最嚴重,藥物干預后略有下降(見圖2A)。在造模后第1天與對照組相比,其他4組大鼠出現(xiàn)松散大便和稀便,大便肉眼可見隱血,且DAI顯著高于對照組。隨著時間的推移,5-ASA組、姜黃素中劑量組和聯(lián)合給藥組大便隱血消退,消退所需要的時間短于模型組(見圖2B)。與對照組相比,模型組CMDI評分明顯上升(P<0.01),其他給藥組較模型組CMDI下降(P<0.05～P<0.01),且聯(lián)合給藥治療組CMDI評分下降最為明顯(P<0.01)(見表4)。

表4 各組CMDI評分比較分)

2.2 姜黃素對UC大鼠結(jié)腸黏膜病理的影響 與對照組比較,模型組的結(jié)腸黏膜組織肉眼明顯可觀察到出血糜爛和潰瘍,顯微鏡下觀察發(fā)S現(xiàn)杯狀細胞消失,腸壁增厚,黏膜下層有大量的炎性細胞深入浸潤(見圖3)。與模型組相比,5-ASA組、姜黃素中劑量組和聯(lián)合用藥組結(jié)腸組織學損傷評分明顯下降(P<0.01);且聯(lián)合用藥組結(jié)腸組織學損傷評分下降更為明顯(P<0.01)(見表5)。

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理情況分)

2.3 姜黃素對UC大鼠結(jié)腸黏膜組織中Notch1通路蛋白表達的影響 與對照組相比,模型組Notch1、jaggledl、Hes1蛋白水平表達量明顯升高(P<0.01);與模型組相比,5-ASA組和姜黃素中劑量組、聯(lián)合用藥組Notch1、jaggledl、Hes1蛋白均明顯表達下降(P<0.01)(見表6～8)。大鼠結(jié)腸黏膜中Hes1、jaggledl、Notch1免疫組織化學示意圖見圖4。

表6 各組大鼠結(jié)腸黏膜中Hes1表達情況

表7 各組大鼠結(jié)腸黏膜中jaggledl表達情況

表8 各組大鼠結(jié)腸黏膜中Notch1表達情況

2.4 姜黃素對UC大鼠結(jié)腸黏膜Hes1、jaggledl、Notch1蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組Hes1、jaggledl、Notch1蛋白表達明顯上升(P<0.01);與模型組相比,5-ASA組和姜黃素中劑量組、聯(lián)合用藥組Hes1、jaggledl、Notch1蛋白表達水平均明顯下降(P<0.01),下降幅度:聯(lián)合用藥組>姜黃素中劑量組>5-ASA組>模型組(見表9～11、圖5)。

表9 大鼠結(jié)腸黏膜中Hes1蛋白表達情況

表10 大鼠結(jié)腸黏膜中jaggledl蛋白表達情況

表11 大鼠結(jié)腸黏膜中Notch1蛋白表達情況

2.5 姜黃素對UC大鼠結(jié)腸黏膜Notch1、jaggledl、Hes1 mRNA表達的影響 與對照組比較,模型組Notch1、jaggled1、Hes1mRNA表達水平明顯升高(P<0.01);與模型組相比,5-ASA組和姜黃素中劑量組Notch1、jaggled1、Hes1mRNA表達水平明顯下降(P<0.01)(見表12～14)。

表12 大鼠結(jié)腸黏膜中Hes1的mRNA表達情況

表13 大鼠結(jié)腸黏膜中jaggledl的mRNA表達情況

表14 大鼠結(jié)腸黏膜中Notch1的mRNA表達情況

3 討論

UC是一種慢性及復發(fā)性炎癥[14],結(jié)腸黏膜的炎性反應是其主要病理特征[15],且病因復雜,臨床發(fā)現(xiàn)可能與遺傳因素、免疫缺陷、環(huán)境刺激等多種因素有關(guān)[16-19],其最突出的表現(xiàn)是血性腹瀉,其他癥狀有腹痛、消瘦、直腸緊迫感、里急后重等。UC發(fā)病機制較復雜,研究[20]發(fā)現(xiàn)腸黏膜屏障功能障礙在UC發(fā)病中起極重要作用[20],而結(jié)腸黏膜屏障損傷的主要原因是結(jié)腸上皮細胞增殖、分化失常[21]。已知構(gòu)成結(jié)腸上皮的主要細胞是杯狀細胞,而當杯狀細胞缺失時,黏膜會發(fā)生一定的缺損、腸道的通透性也會升高、免疫功能發(fā)生改變以及腸源性感染也時有發(fā)生。本研究通過將100 mg/kg TNBS肛門給藥構(gòu)建大鼠UC模型[22],HE染色結(jié)果表明UC模型組的大鼠結(jié)腸黏膜部位發(fā)生出血,糜爛和潰瘍,杯狀細胞消失,腸壁增厚,黏膜下層炎性細胞浸潤。

姜黃素是一種源自姜黃的多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎和免疫抑制作用,并下調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-12和IL-17的表達[23-25]。姜黃素還具有抗菌和抗腫瘤的潛力,可以改善與UC相關(guān)的癥狀[26-27]。本研究按照姜黃素(100 mg/kg)和5-ASA(100 mg/kg)單獨和聯(lián)合對UC大鼠給藥進行灌胃治療,結(jié)果顯示,姜黃素和5-ASA單獨或聯(lián)合使用均能夠顯著降低 TNBS 誘導的 UC 大鼠CMDI評分和DAI評分。HE病理染色結(jié)果顯示姜黃素和5-ASA單獨給藥組炎性細胞有所減少,結(jié)腸黏膜出血糜爛潰瘍情況緩解,且姜黃素-5-ASA聯(lián)合給藥組不見出血潰瘍情況,只有少量炎性細胞,效果最顯著。說明姜黃素聯(lián)合5-ASA給藥可有效緩解腸黏膜的損傷,發(fā)揮治療UC的作用。

研究人員最初是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的Notch信號通路。隨后有大量的研究證明,在許多哺乳動物中Notch信號通路也廣泛存在。胚胎干細胞、造血干細胞、淋巴細胞、腸上皮細胞和各種腫瘤細胞是Notch信號通路主要表達的位置。此通路在跨膜受體蛋白家族進化中是相對保守的信號通路。有研究[28]稱,Notch通路靶基因Hes1和Math1以及配體Dll1可能是治療UC的新的治療靶點,其作用可能為進一步研究提供理論基礎(chǔ)。事實上,Notch信號通路是腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中細胞命運決定的主要調(diào)節(jié)器,在維持結(jié)腸上皮細胞增殖和分化中起著重要作用,治療UC最關(guān)鍵的信號通路之一[29]。據(jù)報道[29-30],DSS結(jié)腸炎小鼠炎癥腸細胞的增生性隱窩中存在Notch信號通路基因的過度表達。Notch受體、Notch配體、CSLDNA結(jié)合蛋白、靶基因、效應分子等是Notch信號通路的主要組成成分。而在哺乳動物中,Notch受體之一的Notch1 在腸道中存在[31],當Notch受體與配體結(jié)合時,就會使Notch信號通路被激活,從而使下游靶基因 Hesl等發(fā)生轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),隨后使腸上皮細胞增殖分化,靶基因Hesl的表達促使結(jié)腸上皮細胞向吸收系細胞分化[32]。研究[33]表明,當把小鼠的Hesl基因敲除后,發(fā)現(xiàn)杯狀細胞等分泌細胞在小鼠結(jié)腸增多,而腸細胞卻發(fā)生減少[34]。而一些實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在UC小鼠結(jié)腸上皮組織中,Notch1、Hesl mRNA水平和蛋白水平表達量均較正常小鼠有顯著升高的趨勢,在經(jīng)過特定藥物干預后,可以顯著降低小鼠結(jié)腸上皮組織 Notch1、Hesl mRNA和蛋白水平的表達。值得注意的是,Notch信號通路基因的異常表達和失調(diào)與幾種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān),Notch1、Notch2、Hes1和Jagged1等Notch基因的表達在隱窩中富集[35]。在研究人員[36]對UC研究過程中發(fā)現(xiàn),人類結(jié)腸細胞系中,Notch信號通路的異常表達導致了轉(zhuǎn)錄因子HES1的表達也隨之增加,并抑制腸上皮細胞分化為杯狀細胞從而減弱黏液屏障。那么在姜黃素治療大鼠UC中是否有Notch信號通路的調(diào)控呢?DEY等[37]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制Notch1/Hes1信號通路進而減輕氧化應激對內(nèi)皮細胞的損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可下調(diào) Notch1 通路從而改善氣道炎癥[38]。在本研究通過免疫組織化學、Western blotting、qPCR檢測姜黃素、5-ASA單獨和聯(lián)合對UC大鼠給藥后的結(jié)腸黏膜中Notch1、jaggledl、Hes1 蛋白和mRNA表達發(fā)現(xiàn),UC模型組中Notch1、jaggled1、Hes1表達上升,而與模型組相比,姜黃素中劑量組和5-ASA Notch1、jaggled1、Hes1表達下降,且姜黃素中劑量+5-ASA聯(lián)合用藥組Notch1、jaggled1、Hes1基因下降趨勢最明顯。

綜上所述,姜黃素與5-ASA聯(lián)合應用能有效抑制UC大鼠結(jié)腸黏膜炎性反應的病理改變,并且加快恢復腸黏膜組織損傷的修復,而本研究中發(fā)現(xiàn)下調(diào)結(jié)腸黏膜組織中Notch1、jaggled1、Hes1蛋白和mRNA表達水平是其可能存在的作用機制。因此,可以通過抑制Notch信號通路的過度活化來抑制其發(fā)揮作用,并且促進結(jié)腸黏膜上皮細胞正常分化,黏液層結(jié)構(gòu)和功能完整來最終實現(xiàn)對UC的治療作用。