《ACMG遺傳變異分類標準與指南》解讀

盛迅倫

甘肅愛爾眼視光醫(yī)院,蘭州 730050

單基因遺傳性眼病也稱為孟德爾遺傳眼病,單個病種發(fā)病率不高,但病種繁多,總體患病率很高。在人類孟德爾遺傳在線數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)中以“eye”作為關鍵詞搜索疾病表型可得到1 544種眼病條目(檢索時間為2022年11月23日)。遺傳性眼病具有高度遺傳異質性,致病基因眾多,其中僅遺傳性視網膜疾病(inherited retinal disease,IRD)包含100多個疾病條目(病種)[1]。OMIM收錄的人類孟德爾疾病相關基因16 888個(截至2022年11月23日),其中2 671個OMIM致病基因涉及眼部異常,僅IRD相關OMIM致病基因超過300個[2]。二代測序(next-generation sequencing,NGS)技術在不斷完善,其在臨床應用和研究中也逐漸普及。一個樣本經過NGS檢測后獲得大量測序數據,如何從海量數據中找到與疾病發(fā)生相關的基因變異,對基因組研究結果轉化為臨床診斷有著重要意義[3]。目前,遺傳變異的解析主要分為兩大部分:(1)NGS檢測產生的原始數據上傳生物信息部門,生信分析系統(tǒng)通過設置一系列篩選條件把變異縮小到一定范圍;(2)依據一些證據對最終篩選出的變異進行人工判斷。美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)編寫和發(fā)布了《遺傳變異分類標準與指南》(簡稱《指南》)[4];中國遺傳學會遺傳咨詢分會于2017年針對該《指南》發(fā)布了《ACMG遺傳變異分類標準中文版專家共識》解讀[5]。《指南》從內容上主要分為2個部分:第一部分主要闡述了用標準術語來描述孟德爾疾病相關的基因變異;第二部分描述了基于典型的數據類型(如人群數據、計算數據、功能數據、共分離數據)對變異進行5級分類的標準過程。本文就《指南》主要內容作簡要解讀。

1 基因變異的表述

1.1 術語

眼科醫(yī)生在閱讀基因檢測報告及撰寫遺傳性眼病相關論文時,常常對術語“突變”、“多態(tài)性”及“變異”產生混淆。變異是指DNA序列中與參考序列不同的任何核苷酸序列改變。單核苷酸多態(tài)性是指在人群中的變異頻率>1%的單個核苷酸變異,在人群中較高的發(fā)生率表明多態(tài)性是自然發(fā)生的,是中性的,通常不會導致明顯的臨床表型。突變(mutation)是指核苷酸序列中任何罕見的變化,通常帶有致病屬性[6]。雖然術語“突變”和“多態(tài)性”已被廣泛使用,但由于這2個術語已經錯誤地與致病性和良性結果關聯(lián)了起來,所以往往會造成混淆。錯義變異造成不同氨基酸的替代,可能導致蛋白質功能改變;如果錯義變異導致編碼的氨基酸化學性質與所替換的氨基酸相似,則蛋白質功能幾乎沒有變化。如從AAA變異到AGA,導致編碼的氨基酸從賴氨酸替換為精氨酸,但精氨酸與賴氨酸化學性質相似,對蛋白質功能和表型幾乎沒有影響,該變異可能為良性的。因此,《指南》建議使用中性詞“變異”加上修飾詞(致病的、可能致病的、意義不明的、可能良性的和良性的)替代上述2個術語。雖然,“可能的”這一術語具有廣泛的適用性,但對其定義沒有量化。術語“可能致病的”和“可能良性的”用來說明一個具有大于90%的概率引起致病或者良性的變異。應當指出的是,遺傳性眼病具有高度異質性,目前沒有數據能將大多數變異量化性地歸于上述5個變異類別之一。隨著研究的不斷深入,更多基因變異的表型譜被界定,能夠建立實驗和統(tǒng)計方法來客觀地賦予變異的致病可信度,并且采用更嚴格的方法來定義臨床專業(yè)人員所期望達到的可信度,從而能更完整地詮釋這些術語及可能性,標準化基因與疾病的聯(lián)系。

1.2 變異的表述

變異的表述有標準的格式,蛋白以前綴(p.)+參考序列氨基酸+位置編號+改變后的氨基酸表示,如p.Trp52Ala。其中氨基酸以三字母表示(因單字母容易和堿基混淆,故不建議以單字母表示);建議用“Ter”或“*”表示氨基酸翻譯終止,如p.Asn26Ter或p.Asn26*;“X”用來表示未指定或未知氨基酸,不用于表示翻譯終止。

2 變異解讀所需證據

ACMG基于典型的數據類型對變異進行5級分類,為準確進行變異解讀提供統(tǒng)一的規(guī)范指南。ACMG對序列變異進行的臨床解讀,不僅涵蓋生信程序預測,還有更多其他因素與證據,包括:人群變異頻率,病例對照變異頻率的差異、文獻報道數據、變異類型特異的證據、表型-基因型共分離、新發(fā)變異和基因功能研究等。

2.1 基因變異解讀常用數據庫

目前人類基因組中有大量變異不斷被發(fā)現(xiàn),且已被多種數據庫收錄。當對檢測到的基因變異進行致病性分析及分類時,可在已有的數據庫及發(fā)表的文獻中尋找有價值的參考信息。

2.1.1人群數據庫 對檢測到的基因變異進行致病性評估時,需要獲取變異在人群中的發(fā)生頻率。人群數據庫提供某變異在大規(guī)模人群中發(fā)生頻率的相關信息。常用的人群數據庫包括:(1)ExAC數據庫(Exome Aggregation Consortium,http://exac.broadinstitute.org/) 變異信息是通過對61 486個獨立個體進行全外顯子測序獲得。(2)Exome Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS) 變異信息是通過對歐洲和非洲裔幾個大規(guī)模人群的全外顯子測序獲得。(3)千人基因組數據庫(1000 Genomes Project,http://browser.1000genomes.org) 包含來自26個種群的2 504個體的數據,所有樣本都有外顯子測序數據。(4)dbSNP數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) 包含人類單核苷酸變異、微衛(wèi)星、小片段插入和缺失、種群頻率、分子檢測結果及基因組RefSeq定位信息。(5)dbVar數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar) 由多種來源獲得的基因結構變異(通常>50 bp)信息組成。前4個數據庫主要用于查詢點突變在正常人群中發(fā)生的頻率,最后一個數據庫主要用于查詢拷貝數變異在正常人群中發(fā)生的頻率。

2.1.2疾病數據庫 對于檢測到的變異,需要在疾病數據庫中查詢是否是已知變異,以及對其致病性的評估。常用的疾病數據庫包括:(1)ClinVar數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar) 收錄已確定變異的臨床意義及變異與臨床表型關系的數據,致力于建立基因、變異與疾病的臨床相關性知識庫。(2)人類基因突變數據庫(http://www.hgmd.org) 收集引起人類遺傳疾病或與人類遺傳疾病相關的核基因突變信息;應用該數據庫可以簡單、快速確認實驗得到的某種變異是否已被發(fā)現(xiàn),是否是導致人類遺傳疾病的原因,獲得某個特定基因或疾病的致病突變譜。(3)人類孟德爾遺傳在線數據庫(http://www.omim.org) 是人類基因和遺傳表型全面、權威的數據庫;包含疾病信息(疾病的發(fā)現(xiàn),與疾病相關的基因、臨床特征、遺傳方式等的詳細描述)、基因信息(基因定位、與基因相關的表型、基因功能、研究進展等的詳細描述),可以通過臨床特征、表型和基因型來搜索對應的信息。OMIM數據庫持續(xù)更新,是用來查詢特定致病基因相關臨床表型的較為可靠的數據庫[7]。

2.2 病例對照數據

遺傳性眼病多為罕見病,極罕見變異的病例對照研究可能無統(tǒng)計學意義。對于之前在多個具有相同表型的患者中觀察到且在對照中未觀察到的變異,可根據患者人數劃分相應的證據等級。值得注意的是,該情況下作為強致病證據的前提條件是ESP數據庫、千人數據庫、ExAC數據庫中正常對照人群未發(fā)現(xiàn)的變異(或隱性遺傳病中極低頻位點)。

2.3 變異類型特異的證據

有的證據只適用于特定的變異類型?；蜃儺悓е录膊〉闹虏C制主要包括:功能獲得(toxic gain-of-function,GOF)、顯性負性效應(dominant negative)及功能喪失(loss of function,LOF)。特定類型的變異包括:(1)無功能變異 包括無義突變、移碼突變、經典剪接位點±1或2點突變、起始密碼子變異、單個或多個外顯子缺失等,這些變異為截斷變異,可導致蛋白長度變短,進而影響蛋白結構,致病機制多為LOF,是極強致病性變異證據;(2)錯義變異 錯義變異可通過改變氨基酸的水平或破壞剪接位點改變DNA的序列來發(fā)揮作用;當某些錯義變異的致病機制是影響剪接位點改變引起LOF時,可作為不同強度的強致病證據。

當將這類變異歸類為致病時,需謹慎考慮以下原則:(1)3'端末端的功能缺失變異需謹慎解讀 截斷變異通常會啟動體內的無義介導的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)機制,造成蛋白表達量減少[8]。但當所預測變異產生的終止密碼子出現(xiàn)在最后一個外顯子或者倒數第二個外顯子的最后50個堿基對時,可能不會觸發(fā)NMD,發(fā)生NMD逃逸,那么這個蛋白很可能會表達,其致病機制可能為GOF。在致病性評估時要分析所預測的截短蛋白的長度及變異對蛋白質功能的影響程度。未經功能分析這些變異的致病性無法進行判定。(2)剪接位點變異需謹慎解讀 因外顯子剪切位點的供體/受體位點改變或產生了新的剪切位點,從而可能導致外顯子丟失、縮短,也可能會使內含子序列變成外顯子部分。剪切位點變異可能被預測為無功能變異,但其造成的影響需要通過RNA或蛋白質功能分析確認。

2.4 預測證據

近年來,在眾多數學模型及計算機軟件的支持之下,以基因變異致病性預測為主的基因組分析得以逐步發(fā)展?！吨改稀分辛信e了25款基于不同算法的基因變異致病性預測軟件。主要為變異有害預測和核苷酸保守性預測。每種工具使用的算法可能存在差異,但都會包含序列變異在核苷酸及氨基酸水平上作用影響的判斷,包括變異對主要轉錄本、可變轉錄本、其他基因組元件影響作用的確認,也包括對蛋白質潛在影響作用的判定。

變異有害預測的工具主要分為2類:一類可以預測錯義變異是否會破壞蛋白質的功能或結構;另一類可以預測是否影響剪接。預測算法在精確醫(yī)學中有很大的潛力,特別是在外顯子組測序結果中的應用,有助于診斷罕見的、難以分類的或令人困惑的疑似遺傳性眼病。

絕大多數編碼變異是罕見的,可用的功能數據也有限?；谧C據的信息可用性有限是使用預測算法的主要理由。在確定個體基因變異的影響方面,預測算法顯然不能超過基于證據的數據。然而,其允許眼科臨床工作者基于目前的知識推斷未知或不確定表現(xiàn)型的基因或變異。軟件預測結果是變異評級的重要依據,如果多種方法預測出該變異會對基因或基因產物造成有害的影響,可作為致病性證據。需要注意的是軟件分析結果只是預測,不建議僅使用這些預測結果作為唯一證據來源進行臨床判斷。

2.5 共分離分析

家系遺傳共分離是評估致病變異的必要條件。遺傳學共分離原則是指在1個家系里,患者和非患者在致病變異位置上的基因型應該不一樣。在致病基因上,患者應該是致病方式攜帶,而非患者應該是非致病方式攜帶。對于外顯率為100%的常染色體顯性(autosomal dominant,AD)遺傳病,其致病變異的遺傳學共分離特點是:凡患者以及與患者有相似輕微表型的家庭成員,均應視為疾病性狀外顯,基因型也一般呈現(xiàn)為雜合攜帶,無表型者均應為不攜帶雜合變異的野生型。對于存在不完全外顯率的AD遺傳病,其致病變異的遺傳學共分離特點是:凡患者以及與患者有相似輕微表型的家庭成員,均應視為疾病性狀外顯,基因型也一般呈現(xiàn)為雜合攜帶,但有些無表型者也可能攜帶致病的雜合變異。對于常染色體隱性(autosomal recessive,AR)遺傳病,其致病變異的遺傳學共分離特點是:患者均攜帶復合雜合或純合變異;凡無表型者,均攜帶雜合變異。這種在1個家系里,相同表型和基因型的連鎖綁定以及不同表型和基因型的明確區(qū)分,被稱為遺傳學共分離。凡是缺少家系共分離分析的遺傳病檢測,都是不嚴謹的。

2.6 新發(fā)變異

新發(fā)變異(denovovariation)是指父母本身沒有變異,一般來自精卵結合或受精卵發(fā)育過程中的自發(fā)變異。比如在患兒某個AD遺傳病的基因上發(fā)現(xiàn)一雜合變異,如果其父母均不患病且均不攜帶這個變異,那就可以確認為該變異為新發(fā)變異。當將1個新發(fā)變異歸類為強的致病證據時,需注意患者的家族史符合新發(fā)變異特征,例如,顯性遺傳病患者的父母均未患病也未攜帶變異,但相繼生育2例具有相同臨床表型并攜帶相同致病變異的患兒,不符合AD及新發(fā)變異的遺傳方式,推測該家系中基因變異來源可能是由于父母為生殖細胞嵌合的攜帶者。但在獨生子女家庭中,生殖細胞嵌合的存在不明顯,例如在獨生子患兒COL2A1基因上檢測到1個雜合移碼變異p.Pro554fs,其父母均未檢測到該變異,通常認為該變異為新發(fā)變異,但在遺傳咨詢時要考慮生殖細胞嵌合可能。

2.7 基因功能研究

功能實驗研究是一種研究變異致病性的非常強大的工具,可從分子水平、細胞水平、器官水平及動物水平提供不同強度的基因致病性驗證證據。對于發(fā)現(xiàn)的與某種疾病相關的新基因或已知致病基因的新變異,可采用功能學實驗補充遺傳學和生物信息學分析。例如,可通過構建新致病基因不同變異位點的質粒,對其變異蛋白表達量、細胞內定位、蛋白結構及功能進行分析;采用小干擾RNA干擾建立新致病基因功能失活的細胞模型,觀察細胞內的生物學變化;在mRNA水平上,檢測新致病基因在小鼠視網膜組織中的表達情況;構建動物模型,研究新致病基因功能失活對動物視網膜組織發(fā)育的影響,證實該基因突變的危害[9-11]。體內、體外功能實驗已明確會導致基因功能受損的變異,且功能實驗經驗證是有效的,具有重復性與穩(wěn)定性,可作為強致病證據。

3 序列變異的解讀原則

人類孟德爾遺傳性疾病序列變異解析原則主要包括:5級分類原則、4級分類原則和序列變異致病性證據累加作用原則。

3.1 5級分類原則

《指南》建議根據基因組序列變異類型、數據庫信息等將序列變異分為5級,即致病的、可能致病的、意義不明的、可能良性的和良性的。在解讀致病性變異和可疑致病性變異時,還應當適時地考慮到外顯率、表現(xiàn)度,甚至還需要考慮到致病機制。同一個致病基因的不同變異可能具有不同的外顯率和表現(xiàn)度,在基因檢測結果的臨床解釋中要考慮到。尤其是當家系中存在攜帶變異而沒有臨床表型的家庭成員時,對于外顯率較低或者是極低的變異,應盡量在臨床分析報告中敘述相關信息。即使根據《指南》可以將此類變異分類為“致病性變異”,也推薦使用“外顯率較低的致病性變異位點”、“外顯率極低的致病性變異位點”或者“患病風險相關的基因變異”對此類變異進行描述。

3.2 4級分類原則

《指南》制定了致病變異分級標準,根據序列變異類型、數據庫信息等將致病性變異證據分為4級,即非常強(PVS1)、強(PS1～4)、中等(PM1～6)或輔助證據(PP1～5)。如檢測出的變異為無功能變異,因無轉錄產物或由無義變異引起的轉錄子降解,導致基因產物完全缺失而基因功能受損,這類變異為非常強的致病性證據。當某個變異經體內、體外功能實驗明確會導致基因功能受損,即為強的致病性證據。如果檢測到的變異在ESP數據庫、千人數據庫、ExAC數據庫正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)(或為隱性遺傳病中極低頻位點),表明該變異在人群中的發(fā)生率極低,為中等的致病性證據。如果檢測到的變異與疾病在家系中共分離,為輔助致病性證據。

3.3 序列變異致病性證據累加作用原則

致病性變異證據中的數字只是作為有助于參考的分類標注,不具有任何意義。每個類別中的數字不表示分類的任何差異,僅用來標記以幫助指代不同的規(guī)則。對于檢測到的變異,可以基于觀察到的證據來選擇分級標準。在實際應用中解讀所需的證據主要來源于4個方面:人群數據、文獻報道數據、變異類型特異的證據、預測證據。將各類型的證據逐條分析,最后根據《指南》中的評分規(guī)則把一個個標準組合起來進而從5級系統(tǒng)中選擇1個分類。即通過致病性證據累加作用以判斷序列變異是致病的、可能致病的、可能良性或良性的,若不符合上述標準或致病性證據與良性證據相互矛盾,則判斷為意義不明。

4 謹慎使用基因檢測報告

規(guī)范的基因檢測報告提供了對檢測到的變異的分析,包括通過專業(yè)數據庫和生信預測軟件對變異進行注釋和篩選。對序列變異數據的解讀,其規(guī)則參考《指南》、ClinGen序列變異解讀專家組陸續(xù)發(fā)布的一系列通用建議和細則以及針對特定基因和疾病的解讀指南,進行進一步的細化解讀。盡管上述判定步驟和分類標準十分具體,但在使用基因檢測報告進行基因診斷和遺傳咨詢過程中仍需結合實際情況謹慎判定。

4.1 檢測結果陰性

當基因檢測報告提示本次檢測未發(fā)現(xiàn)與受檢者臨床表型高度相關且符合遺傳致病模式的致病/可能致病變異,不能作為否定該遺傳性疾病診斷的證據。例如1例臨床表現(xiàn)為典型的視網膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)的20歲男性患者,全基因組外顯子測序檢測報告為“陰性”,未檢出與受檢者臨床表型相關或部分相關的基因變異,也未檢出與受檢者臨床表型相關或部分相關的拷貝數變異,其檢測結果陰性的可能原因有:(1)檢測方法存在局限性,如NGS不能檢測基因組結構變異(如易位、倒位等)和大片段插入變異、基因調節(jié)區(qū)或深度內含子區(qū)域的變異、動態(tài)突變及復雜重組等特殊類型變異。該檢測方法無法完全覆蓋基因組高重復區(qū)域、高富含GC區(qū)域、復雜結構區(qū)域或假基因區(qū)域。(2)該報告對基因與疾病的相關性判定依賴現(xiàn)有的臨床表型、文獻報道和數據庫,受科學發(fā)展的階段性限制,RP仍有未被發(fā)現(xiàn)的致病基因。(3)該報告對變異致病性的判定依賴現(xiàn)有的文獻報道、數據庫及生物信息學軟件預測,受科學發(fā)展的階段性限制,一些致病性尚不明確的變異未列入報告。因此,即使基因報告檢測結果為陰性,仍建議以醫(yī)生診斷、其他臨床檢測和家族史為準,進行針對于臨床癥狀的干預和遺傳咨詢;如臨床高度懷疑某一基因或者某種遺傳病,但檢測結果為陰性,可考慮其他更有針對性的檢測方法。

4.2 意義不明變異

意義不明變異是指基于目前醫(yī)學進展和變異分類證據,該變異的致病性尚不明確。ACMG建議不宜將意義不明變異用于臨床決策,需結合臨床進行評估。此類變異主要包括以下2種情況:(1)目前沒有報道或數據庫收錄,或者研究較少,支持致病或支持良性的證據不充分;(2)目前支持致病和支持良性的證據均存在。結合臨床表型的分析,意義不明變異分類可能會發(fā)生改變。例如,對1例臨床表型為黃斑變性的受檢者進行全外顯子組測序,發(fā)現(xiàn)受檢者攜帶PROM1基因上的1個純合錯義變異c.1363G>C:p.G455R,一代測序驗證結果顯示變異遺傳自其父母。該變異尚無文獻報道,參照《指南》,其為意義不明變異,分類依據見表1。

表1 一變異(PROM1:NM_006017.3:exon13:c1363G>C:p.G455R)的分類

已知PROM1基因異?？蓪е翧RRP41型(OMIM#612095)、AD Stargardt病4型(OMIM#603786)、AD或AR視錐視桿細胞營養(yǎng)不良(OMIM#612657)。面對這樣的檢測報告,醫(yī)生需結合受檢者的臨床癥狀、家族史以及其他檢查結果進一步確定上述變異與臨床表型的相關性。如果進一步的視網膜影像學和功能學檢查結果明確受檢者為視錐視桿細胞營養(yǎng)不良,為支持證據(變異攜帶者的表型高度符合某種單基因遺傳疾病),經序列變異的解讀原則和指南評估,該變異應分類為可能致病的變異。

5 展望

高通量NGS的出現(xiàn),加速了罕見基因變異的發(fā)現(xiàn),但目前許多變異與孟德爾遺傳病的關系尚不明確。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)疑似遺傳性眼病的患者時,可運用NGS技術得到基因變異位點,但卻難以直接判斷該基因變異位點的致病性及其與臨床表型之間的關聯(lián)。《指南》的制定有助于標準化基因變異與疾病的聯(lián)系,促進對孟德爾遺傳病相關基因變異進行適當的分類。NGS技術在人類孟德爾遺傳性疾病分子診斷和遺傳學研究中的應用,仍有許多亟待解決的問題。尤其是目前的序列變異解析并非完美,所報道的變異分類并非完全確定,變異分類基于臨床數據和經驗。隨著基因組學數據的不斷增加,在現(xiàn)有指南基礎上,通過不同領域專家共同協(xié)作以建立更加精準的“基因-疾病”解讀指南是未來的發(fā)展方向。隨著NGS技術的發(fā)展和數據分析軟件的完善,檢測和分析變異的能力必將逐步提高,可以幫助人們不斷加深對人類遺傳變異所產生的效應的理解。同時,精準醫(yī)療計劃的不斷開展,也將為NGS技術積累更多翔實、可靠的臨床信息和基因組學數據,為其更好地應用于人類孟德爾遺傳性眼病分子診斷和預防干預提供有力保證。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突