CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在遺傳性視網(wǎng)膜疾病中的應用

孫璽皓 綜述 唐仕波 陳建蘇 審校

中南大學愛爾眼科學院 愛爾眼科研究所,長沙 410015

遺傳性視網(wǎng)膜疾病(inherited retinal diseases,IRDs)是一類因基因組異常而導致光感受器細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞結(jié)構(gòu)及功能損害的疾病,常造成視力不可逆喪失[1]。目前一些IRDs的致病基因及具體突變位點已經(jīng)明確,但仍缺乏有效的治療方法。隨著第3代基因編輯技術(shù)成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein system,Cas)的出現(xiàn),基因治療和細胞替代治療的可行性增加,為IRDs患者治療帶來了曙光。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的作用機制

2013年,Charpentier和Doudna在Nature上介紹了一種使用單向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)靶向DNA進行切割的細菌酶,可實現(xiàn)對細菌、斑馬魚及人類細胞等多種生物基因組的編輯[2],并因此獲得了2020年的諾貝爾化學獎。目前用于哺乳動物基因組編輯的是來源于化膿性鏈球菌(S.pyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)[3],該系統(tǒng)主要包括核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白和sgRNA,通過識別、切割、修復3個步驟完成對基因組的編輯[4-5]。先由sgRNA識別目標DNA序列5'端的原間隔序列臨近基序(protospacer adjacent motifs,PAM)來定位需要編輯的位點[6];識別靶位點后引導Cas9內(nèi)切酶切割靶點位DNA雙鏈,隨后對目標區(qū)域進行非同源末端鏈接(nonhomologous end joining,NHEJ)修復或者在有同源修復模板的情況下進行更精準的同源定向修復(homology-directed repair,HDR)。

與既往的基因編輯技術(shù)不同,CRISPR/Cas9是通過sgRNA引導Cas9內(nèi)切酶切割目標位點,故通過改變sgRNA的序列便可重新定位含有PAM區(qū)的目標位點[4]。與鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活物樣效應核酸酶等基因組編輯工具相比,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有設計簡單、構(gòu)建容易,操作周期短等優(yōu)點[7];但同時其也存在同源重組效率低、易發(fā)生脫靶、可能引起p53激活,PAM區(qū)相對較窄等問題[8-10]。隨著研究的不斷深入,這些問題逐步得到了解決。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)化

2.1 降低脫靶率

在進行基因組編輯時,CRISPR/Cas9可能會造成目標位點之外的基因組改變,這種現(xiàn)象為脫靶效應[9]。脫靶不僅發(fā)生在DNA水平,同時也存在于RNA水平[11],這不僅降低了基因編輯的精準性,也增加了其不可控的風險。為此研究者通過改變sgRNA的長度,對其進行化學修飾,使用雙sgRNA識別靶位點,優(yōu)化Cas9蛋白酶的結(jié)構(gòu)等方式降低脫靶率[12-14]。

2.2 提升精準性

通常Cas9蛋白需在sgRNA的引導下識別目標位點,進而造成靶位點附近DNA雙鏈斷裂,同時引入同源修復模板,達到插入或修復某段DNA的目的。但該過程易造成目標位點附近堿基的隨機插入與缺失,并且其效率因細胞類型和狀態(tài)、所需編輯的基因組位置以及修復模板的不同而產(chǎn)生很大差異[15]。為此,研究者開發(fā)了單堿基編輯系統(tǒng),其可以進行單個堿基的編輯,包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器,前者可以實現(xiàn)編輯窗口內(nèi)單個堿基C或G到T或A的轉(zhuǎn)換,而后者可以實現(xiàn)T或A到C或G的轉(zhuǎn)化,但其應用范圍較窄[16-18]。隨后,Anzalone等[19]所構(gòu)建的新型堿基編輯系統(tǒng)Prime Editing打破了堿基互換之間的限制,實現(xiàn)所有類別堿基的自由置換,而且可以實現(xiàn)多個堿基的插入與刪除,進一步擴大了單堿基編輯系統(tǒng)的應用范圍。但Prime Editing的組成構(gòu)件較大,在一定程度上限制了其在體內(nèi)的應用。

2.3 擴展編輯范圍

PAM區(qū)的存在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的編輯范圍[20]。Walton等[21]通過改變Cas9蛋白的結(jié)構(gòu),擴大了PAM區(qū)的范圍,使Ⅱ型CRISPR/Cas9能夠識別NYN(Y即C+T)或者NRN(R即A+G)的PAM區(qū)?？蓪⒕庉嫹秶鷶U大至幾乎全基因組的任何位點,進一步增加了其實用性。但PAM區(qū)的擴大會降低其特異性,增加脫靶的可能性。

2.4 提高安全性

除了提升CRISPR/Cas9的特異性與有效性之外,提高其安全性也十分重要。Harrington等[22]發(fā)現(xiàn)AcrIIC1可以直接結(jié)合Cas9蛋白保守的催化結(jié)構(gòu)域,而AcrIIC3可以誘導Cas9蛋白二聚化,從而阻止其與靶DNA的結(jié)合,達到控制Cas9蛋白活性的目的。而Dong等[23]則發(fā)現(xiàn)AcrIIA4蛋白可通過在結(jié)構(gòu)上模擬PAM區(qū),阻止Cas9對雙鏈DNA底物的識別,避免細胞和組織中不必要的基因組編輯。Nihongaki等[24]則通過對Cas9蛋白進行改造,使其活性可以受光的調(diào)控,進而控制CRISPR/Cas9在體內(nèi)外表達的時間,降低其長期表達所引起的副作用。

3 CRISPR/Cas9在IRDs應用途徑與方法

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在IRDs中的應用主要包括2個途徑,即體外或者體內(nèi)基因編輯。體外基因編輯的應用主要在細胞水平矯正人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)或者特異性誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),然后誘導其分化為視網(wǎng)膜相關(guān)細胞,移植到患眼,替代原有的病變細胞;體內(nèi)基因編輯主要通過相關(guān)的載體將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至體內(nèi),直接糾正異常組織與細胞基因組中的突變位點。

3.1 體外基因編輯

iPSCs是一類具有自體再生功能的細胞,通過誘導分化便可以衍生出不同的視網(wǎng)膜細胞[25]。隨著體外3D視網(wǎng)膜類器官(retinal organoids,ROs)分化方案的不斷完善,分化成熟的視網(wǎng)膜類器官具有一定的生理結(jié)構(gòu)并且包含多種視網(wǎng)膜細胞[26-27],使其有可能替代傳統(tǒng)的動物模型來進行實驗研究,甚至可以將其進行移植替代原有的病變組織[28]。而由于CRISPR/Cas9可以精準地修正基因組突變,故將其和iPSCs聯(lián)合應用可以更好地發(fā)揮二者的優(yōu)勢[29]。

Zhu等[30]將人來源的iPSCs分化的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞植入到視網(wǎng)膜色素變性模型小鼠的視網(wǎng)膜下腔,發(fā)現(xiàn)移植的hiPSCs-RPE細胞不僅在小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)生整合與替換而且能夠分泌神經(jīng)保護因子,抑制小膠質(zhì)細胞的活化、減少細胞凋亡,從而抑制光感受器細胞的丟失。雖然其長期的安全性和有效性有待確認,但證明了細胞替代治療的可行性。Mandai等[31]將iPSCs來源的RPE細胞移植到新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性患者眼內(nèi),雖然最佳矯正視力沒有改善或惡化,但證明了其可行性。隨后Nishida等[32]通過3D打印模具對所產(chǎn)生的RPE細胞植片的形態(tài)進行了改良,產(chǎn)生了條狀的人iPSCs來源的RPE細胞植片,該條狀細胞植片在體外具有良好的擴增效率,而移植到裸鼠的視網(wǎng)膜下腔后,可以與宿主的RPE細胞整合,并表達正常的RPE細胞極性。而若在iPSCs誘導分化前通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)修復致病位點,再將分化成熟的細胞輸送至病變部位,即可以實現(xiàn)自體細胞的替代治療,在一定程度上解決供體匱乏的問題。并且由于移植物來源于患者本身,故在理論上不會引起免疫排斥反應[33]。目前已有臨床試驗進行了iPSCs來源的RPE細胞的移植治療,而由于光感受器細胞培養(yǎng)時間長,分化效率較低,分化后的視網(wǎng)膜光感受器細胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,難以獲得高純度的細胞[34],故iPSCs來源的光感受器相關(guān)細胞的移植治療距離實際的臨床應用還有相當長的距離。

3.2 體內(nèi)基因編輯

利用基因編輯技術(shù)直接在活體視網(wǎng)膜組織內(nèi)糾正異常的基因組突變位點,從而避免iPSCs誘導分化的繁瑣步驟以及外源性細胞在移植后與周圍細胞整合的問題[35]。但這需要選擇特異性較高的載體或者采用物理轉(zhuǎn)染的方式將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至體內(nèi)。傳遞載體可以分為病毒載體和非病毒載體,常見的病毒載體有慢病毒、腺病毒(adenovirus,AD)和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)等。慢病毒及AD能夠攜帶較大的基因片段,但其轉(zhuǎn)染效率較低[36];AAV雖然只能攜帶不超過4.7 kb的基因片段,但在體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率較高,并且具有較高的安全性和極低的免疫原性,故應用較為廣泛[37]。根據(jù)對不同組織的轉(zhuǎn)染偏好可以將AAV分為不同的血清型,其中AAV2、AAV5和AAV8在視網(wǎng)膜組織中的轉(zhuǎn)染效率較高[38]。由于AAV裝載量的限制,大多數(shù)情況下需要采用雙AAV包裝CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),但雙AAV的傳遞方案大大降低了體內(nèi)基因編輯的效率[39-40]。非病毒載體的主要優(yōu)勢便是能夠攜帶更大的基因片段,生物安全性高,較少引起組織的免疫反應[41],但轉(zhuǎn)染效率通常較低。鑒于其較高的安全性,可以通過多次注射的方式來提高轉(zhuǎn)染效率。電穿孔作為一種物理轉(zhuǎn)染方法,通過高壓電擊瞬間提高細胞膜的通透性,可以使外源性分子傳遞至細胞內(nèi),并且穿過核膜進入細胞核內(nèi)[42]。故通過顯微注射聯(lián)合電穿孔的方法可將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至靶細胞內(nèi)。

Hung等[43]運用雙AAV2作為載體將sgRNA和Cas9蛋白通過玻璃體腔注射的方式傳遞至表達Thy1-黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),抑制YFP在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達,從而在不影響視網(wǎng)膜正常功能的情況下,對成年小鼠視網(wǎng)膜組織進行了基因編輯。但CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在體內(nèi)的長期表達可能會增加脫靶率以及引起機體的免疫應答反應[44]。故Li等[45]進一步改進了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),使其在視網(wǎng)膜組織中發(fā)揮作用后通過自我干擾的方式降低Cas9蛋白活性,減少持續(xù)表達所帶來的副作用,從而提高CRISPR/Cas9在體內(nèi)應用的安全性。Nishiguchi等[46]設計了微同源介導的末端連接,將同源重組片段長度減少至20 bp,使單個AAV便能裝載CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的全部元件,并將其應用于Gnat1和Pde6c基因突變所致的視桿與視錐細胞異常小鼠體內(nèi),從而恢復Gnat1基因表達,挽救視桿細胞的功能,治療后模型鼠視網(wǎng)膜功能有所恢復,視敏度有所提高。該研究中的基因編輯效率約為10%,高于雙AAV傳遞策略(<5%)[47],從而進一步提高了基因編輯的實用性。

4 CRISPR/Cas9在IRDs中的應用

由于IRDs多為單個基因突變所致,無需進行多個靶位點的修正,并且視網(wǎng)膜下腔處于免疫豁免的狀態(tài)[48],適合應用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進行治療[49]。

4.1 CRISPR/Cas9在視網(wǎng)膜色素變性中的應用

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種常見的遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病[50]。Buskin等[51]運用CRISPR/Cas9的HDR方式對PRPF31基因突變所致RP患者的iPSCs進行修復,并與患者來源的視網(wǎng)膜類器官進行對比,發(fā)現(xiàn)纖毛發(fā)生和細胞粘附等異常疾病表征得以改善,從而改善RPE發(fā)育。Deng等[52]采用同樣的方法對RPGR基因突變所致RP患者的iPSCs進行修復,得出了與Buskin等[51]類似的結(jié)論。這些研究證明了CRISPR/Cas9在體外糾正IRDs異常表型的潛力。

在體內(nèi)水平,Moreno等[53]通過雙AAV2將靶向抑制NRL基因的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至視網(wǎng)膜色素變性模型小鼠視網(wǎng)膜下腔,抑制繼發(fā)性視錐細胞丟失,發(fā)現(xiàn)治療后小鼠的視功能有所改善。Bakondi等[54]采用顯微注射聯(lián)合電穿孔的方式將Cas9和sgRNA運輸至視紫紅質(zhì)基因S334ter位點突變所導致RP大鼠的視網(wǎng)膜下腔,成功敲除突變的視紫紅質(zhì)等位基因后,發(fā)現(xiàn)大鼠的光感受器凋亡得到抑制,視網(wǎng)膜變性程度有所緩解。這些研究均證明了CRISPR/Cas9在體內(nèi)治療RP的潛力。

4.2 CRISPR/Cas9在遺傳性X連鎖青少年視網(wǎng)膜劈裂癥中的應用

遺傳性X連鎖青少年視網(wǎng)膜劈裂癥(hereditary X-linked juvenile retinoschisis,XLRS)是青年男性黃斑變性的主要原因之一[55]。Huang等[56]建立了RS1基因突變(c.625C>T與c.488G>A)所導致XLRS患者來源的iPSCs細胞系,隨后將iPSCs分化為ROs,在體外重現(xiàn)了XLRS的主要病理特征,包括視網(wǎng)膜劈裂、視黃醇生成缺陷和外節(jié)和纖毛形態(tài)異常。然后Huang等[56]應用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對患者來源iPSCs突變位點進行修正,并分化為ROs,發(fā)現(xiàn)異常的疾病表型得以修復,在體外證明了CRISPR/Cas9基因編輯的有效性。并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學進一步分析發(fā)現(xiàn)IQCB1和OPA1等基因表達的下調(diào)也得到恢復,而這些基因的下調(diào)常導致視網(wǎng)膜感光細胞和其他神經(jīng)細胞之間的通訊障礙,與視神經(jīng)的萎縮有關(guān)[57-58]。Huang等[56]的研究為之后對XLRS的藥物篩選,發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點奠定了一定的基礎(chǔ)。而Yang等[59]將CRISPR/Cas9以玻璃體腔注射的方式傳遞至小鼠眼內(nèi),誘導RS1基因編碼區(qū)625位點處的堿基C突變?yōu)門,以體內(nèi)基因編輯的方式構(gòu)建XLRS的動物疾病模型。Moore等[60]以無機納米粒子-納米金剛石作為載體,攜帶整個CRISPR/Cas9基因編輯的元件以及示蹤熒光標記物,從而構(gòu)建RS1 c.625C>T突變所致XLRS的點突變的小鼠疾病模型,雖然模型鼠并未出現(xiàn)視網(wǎng)膜囊腫,但表現(xiàn)出與XLRS相似的病理特征,如視網(wǎng)膜外層厚度減少,感光細胞形態(tài)出現(xiàn)異常等。不過該研究并沒有進行基因組測序證實該位點發(fā)生突變。以上研究證明了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)不僅可以在體內(nèi)外構(gòu)建與患者突變位點一致的細胞或動物疾病模型,而且可以在患者來源的iPSCs內(nèi)糾正其突變位點,為后續(xù)在動物體內(nèi)應用以及臨床轉(zhuǎn)化提供了研究基礎(chǔ)。

4.3 CRISPR/Cas9在LCA10中的應用

LCA10是由CEP290基因突變所導致的常染色體隱性遺傳疾病,大多數(shù)患者在嬰兒期便表現(xiàn)出嚴重的視錐及視桿營養(yǎng)不良[61]。由于CEP290編碼序列較大(約7.5 kb),超過了普通AAV的包裝能力,限制了基因替代療法在該疾病中的應用[62]。而CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以有效地糾正或刪除特定的DNA片段,恢復正?；虻谋磉_,使其成為LCA10潛在的治療方法。Ruan等[63]采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在293T細胞系中引入CEP290基因突變并采用雙AAV5將CRISPR/Cas9傳遞至野生型小鼠視網(wǎng)膜下腔,進而引起CEP290基因第25內(nèi)含子(該內(nèi)含子與人CEP290基因的內(nèi)含子26同源)的缺失,分別成功構(gòu)建了LCA10的細胞模型和動物模型。并且研究了具有自限能力的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),減少其在體內(nèi)持續(xù)表達所帶來的副作用。而Maeder等[64]應用EDIT-101靶向CEP290基因異常片斷的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)消除了LCA10轉(zhuǎn)基因小鼠中CEP290基因突變所產(chǎn)生的異常剪接供體,從而恢復CEP290基因的正常表達,逆轉(zhuǎn)光感受器異常。隨后通過視網(wǎng)膜下注射的方式將AAV載體傳遞至非人靈長類動物恒河猴眼內(nèi),探討了在靈長類動物體內(nèi)視網(wǎng)膜內(nèi)進行基因編輯的效率與病毒計量的關(guān)系,當病毒的濃度約1.00×1012時,其在視網(wǎng)膜內(nèi)的基因編輯效率能夠到達(27.9±20.7)%。該研究不僅證明了CRISPR/Cas9具有在非人靈長類動物視網(wǎng)膜內(nèi)編輯基因組的能力,且能夠達到治療水平(10%的編輯效率)[64]。但有研究發(fā)現(xiàn)以AAV為載體的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)會引起輕度的炎癥反應。這可能是由于AAV作為一種病毒載體具有一定的免疫原性[65]。隨后經(jīng)過不斷的完善優(yōu)化,2018年11月美國食品藥品監(jiān)督管理局批準了EDIT-101臨床試驗新藥的申請,允許張鋒團隊開展使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療LCA10的臨床試驗(NCT03872479),使LCA10成為眼科領(lǐng)域中首個嘗試運用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進行治療的臨床試驗。

5 小結(jié)及展望

在體外,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以修正IRDs患者來源的iPSCs突變位點,并將其分化為視網(wǎng)膜相關(guān)細胞,這對于研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制,進行藥物篩選以及后續(xù)的細胞替代治療有著重要的現(xiàn)實意義;在體內(nèi),可以通過相關(guān)的載體將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至眼內(nèi)以糾正IRDs中的基因突變,從而逆轉(zhuǎn)異常的疾病表型,為研究和治療IRDs提供一個新的方向。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在體外可以通過HDR的方式修復大部分IRDs的突變位點,但由于同源修復模板的存在,HDR方式在體內(nèi)編輯的效率顯著低于NHEJ方式,因此目前在體內(nèi)水平主要通過NHEJ方式抑制某個基因的表達,從而糾正異常疾病表型,而單堿基編輯器的出現(xiàn)和不斷迭代為單個堿基突變引起的IRDs提供了更加精準的治療方式。故要使CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在臨床上具有更加現(xiàn)實的意義,還需要進一步優(yōu)化其編輯效率,降低脫靶率,提升載體傳遞的安全性和有效性。相信隨著研究的不斷深入,科學技術(shù)的不斷發(fā)展,這些問題也將逐步得到解決,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)必將給IRDs患者帶來福音。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突