中國漢族Cohen綜合征一家系VPS13B基因變異及臨床表型分析

李瑞敏郭慶歌 李亞 游雅 雷博

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院,新鄉(xiāng) 453003;2河南省人民醫(yī)院眼科 河南省立眼科醫(yī)院,鄭州 450003

Cohen綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳病,又稱腦-肥胖-眼-骨骼異常綜合征,目前尚無該疾病明確的表型與基因型的相關(guān)性報(bào)道[1-4]。Cohen綜合征的典型面部特征包括毛發(fā)濃密、低發(fā)際線、短人中、波浪狀眼瞼、喇叭樣鼻子、上頜發(fā)育不良、小下頜、高窄腭弓和上中門牙凸出;其他特征包括高度近視和/或視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、小頭畸形、關(guān)節(jié)過度活動(dòng)/伸展、發(fā)育遲緩和四肢纖細(xì)、軀干肥胖、過度的社交行為或過度開朗的性格;生化檢查特征包括中性粒細(xì)胞減少[4-5]。發(fā)育遲緩多在嬰兒期出現(xiàn),表現(xiàn)為明顯的呼吸困難和喂養(yǎng)困難;幼兒期及學(xué)齡前期患者可表現(xiàn)出典型的軀干性肥胖和顱面畸形,也可見視神經(jīng)萎縮、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、小舌、猿線掌、胸前突、脊柱側(cè)凸、內(nèi)眥贅皮、細(xì)長指/趾等[5]。Cohen綜合征患者的眼部表現(xiàn)較為少見,通常表現(xiàn)為高度近視和視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良[6-9]。Cohen綜合征由位于8q22.2染色體上的液泡蛋白分選13同源物B(vacuolar protein sorting 13 homolog B,VPS13B)基因變異引起[10]。VPS13B有62個(gè)外顯子,編碼含4 022個(gè)氨基酸的跨膜蛋白。VPS13B蛋白是高爾基體相關(guān)外周膜蛋白,參與分泌蛋白的糖基化,在維持高爾基體完整性、穩(wěn)態(tài)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用;除此之外,其在細(xì)胞蛋白的囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)及分類和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)以及眼的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10-12]。目前,Cohen綜合征在世界范圍內(nèi)報(bào)道的患者不足1 000例,包含200多個(gè)致病變異,變異類型有缺失/插入、剪接、錯(cuò)義、調(diào)控、小缺失/插入及無義變異,其中錯(cuò)義變異和無義變異最常見[11-13]。Cohen綜合征是一種累及全身多系統(tǒng)的疾病,臨床容易漏診、誤診。本研究擬對Cohen綜合征新的VPS13B基因變異進(jìn)行致病性分析,并通過復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn),進(jìn)一步認(rèn)識VPS13B基因臨床表型和基因型關(guān)聯(lián),為Cohen綜合征的診斷及遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究方法,收集2021年9月于河南省立眼科醫(yī)院就診的中國漢族Cohen綜合征一家系,共2代3人,其中患者1例。詳細(xì)詢問先證者及其父母全身病史、家族史以及婚育史并記錄,繪制患者家系圖譜。行全身體格檢查及眼部相關(guān)檢查。本研究方案嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》,并由河南省立眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批文號:HNEECKY-2019(15號)]?；颊弑O(jiān)護(hù)人均知情并簽署書面知情同意書。

1.2方法

1.2.1眼科臨床檢查 采用國際標(biāo)準(zhǔn)視力表檢查視力;采用裂隙燈顯微鏡(日本Topcon公司)檢查眼前節(jié)大致情況;采用手指自測眼壓方法測量眼壓;采用雙目間接檢眼鏡檢查眼底;采用眼底照相機(jī)(意大利CenterVeu公司)以及全景激光掃描眼底鏡(英國歐堡公司)檢查眼底及視網(wǎng)膜自發(fā)熒光情況;采用掃頻源光學(xué)相干斷層掃描(swept-source optical coherence tomography,SS-OCT)儀[視微影像(河南)科技有限公司]檢查視網(wǎng)膜形態(tài);采用視覺電生理系統(tǒng)閃光視網(wǎng)膜電圖(flash electroretinogram,F-ERG)(德國羅蘭公司)檢查視網(wǎng)膜功能情況;采用閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential,F-VEP)(德國羅蘭公司)檢查受試者視神經(jīng)的傳導(dǎo)功能。

1.2.2DNA的提取及目標(biāo)區(qū)域測序 采集先證者及其父母外周靜脈血3～5 ml于EDTA抗凝管內(nèi),充分顛倒混勻后放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。根?jù)DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明快速提取DNA,采用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(美國Nanodrop公司)進(jìn)行DNA濃度及純度的檢測,儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)。對先證者進(jìn)行全外顯子測序,視網(wǎng)膜遺傳病相關(guān)基因檢測測序目標(biāo)區(qū)域平均測序深度為100×,其中目標(biāo)序列的97.62%測序深度達(dá)20×以上。分別采用XYGeneRanger 2.0軟件(上海尋因生物科技有限公司)、TGex軟件(上海閃譯生物科技有限公司)、EGIS軟件(上海瀚垚生物醫(yī)學(xué)科技有限公司)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點(diǎn)的檢測及篩選,人類基因組參考序列為hg19。采用gnomAD、ExAC以及1000genomes等數(shù)據(jù)庫分析等位基因頻率,排除等位基因頻率高于正常人群2%的變異。

1.2.3生物信息學(xué)分析和Sanger驗(yàn)證 為評估變異的致病性,應(yīng)用VarCards查詢MutationTaster[14]、LRT(Likelihood Ratio Test)、DANN(Domain-Adversarial Training of Neural Networks)、FATHMM-MKL(Functional Analysis Through Hidden Markov Models)、CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)[15]等不同算法對新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測[16]。應(yīng)用公共數(shù)據(jù)平臺gnomAD、ExAC、1000genomes數(shù)據(jù)庫檢索東亞人群的等位基因頻率。應(yīng)用NetGene2和NNSplice預(yù)測剪接位點(diǎn)[17-19]。對篩選出來的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)相關(guān)引物,M1正向引物序列為:5'-GGAGGTT GCCCCATTGGTAA-3',反向引物序列為5'-ACATCAC AGGCCACTCTTGG-3';M2正向引物序列為5'-GCCT AGAGGATCTTCATTGCCTT-3',反向引物序列為5'-AACATCATCCCTGGGCAATCTT-3',然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過Sanger測序進(jìn)行家系共分離驗(yàn)證。采用2015年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》[20]進(jìn)一步評估其遺傳變異的評分以及致病性。

1.2.4文獻(xiàn)回顧分析 回顧目前已報(bào)道的中國所有VPS13B基因相關(guān)的文獻(xiàn),以“Cohen綜合征”、“Cohen syndrome”和“VPS13B基因”為關(guān)鍵詞,檢索在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://omim.org)、PubMed數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、維普中文科技期刊以及中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中Cohen綜合征相關(guān)文獻(xiàn)。檢索時(shí)間設(shè)定為1973年1月1日至2022年12月1日?？偨Y(jié)文獻(xiàn)中不同患者的臨床表現(xiàn)以及致病位點(diǎn),從而分析基因型和臨床表型的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 家系臨床特點(diǎn)

先證者(Ⅱ1),男,5歲,足月順產(chǎn),父母非近親結(jié)婚,出生時(shí)因新生兒肺炎于新生兒重癥監(jiān)護(hù)室治療1周后好轉(zhuǎn)出院。出生后1個(gè)月內(nèi)曾出現(xiàn)喂養(yǎng)困難,目前生長發(fā)育正常。1歲8個(gè)月時(shí)因中度精神發(fā)育遲緩于外院行康復(fù)治療,療效一般,無癲癇病史。入院查體:體重21 kg,身高110 cm,頭圍49.5 cm;表現(xiàn)為言語障礙,過度的社交行為(如與陌生人拍手握手、興奮地來回踱步),四肢肌張力減退;頭發(fā)、眉毛及睫毛濃密,發(fā)際線低,球狀鼻尖,人中短,上唇短(圖1A);手指和腳趾纖細(xì)、扁平足(圖1B);無心臟及其他器官異常。先證者父母臨床表型無明顯異常。

圖1 先證者面部及手足的臨床表型 A:面部特征 頭發(fā)、眉毛及睫毛濃密,發(fā)際線低,球狀鼻尖,人中短,上唇短 B:手足表現(xiàn) 手指和腳趾纖細(xì),扁平足

眼科一般檢查:先證者雙眼高度近視,小瞳檢影右眼-9.0 DS,左眼-9.0 DS,最佳矯正視力檢查不配合;雙眼指測眼壓正常;裂隙燈顯微鏡檢查雙眼前節(jié)未見明顯異常;雙眼上瞼下垂,下瞼內(nèi)翻倒睫,夜盲、畏光。無擴(kuò)瞳彩色眼底照相可見雙眼視盤邊界清楚、顏色淡,眼底豹紋狀改變(圖2A)。超廣角掃描激光眼底成像可見雙眼周邊部視網(wǎng)膜多發(fā)散在骨細(xì)胞樣色素沉著(圖2B)。雙眼眼底自發(fā)熒光可見雙眼黃斑中心低熒光,中周部熒光增強(qiáng)(圖2C)。SS-OCT可見雙眼視網(wǎng)膜外層變薄、萎縮,右眼黃斑中心凹內(nèi)層可見小囊腔(圖2D)。先證者父母SS-OCT檢查均未見明顯異常(圖2E,F)。先證者F-VEP可見雙眼P2波峰時(shí)輕中度延遲,振幅正常(圖3A);F-ERG可見雙眼各反應(yīng)平坦,未引出波形,呈熄滅型(圖3B)。

圖2 先證者及其父母眼底影像學(xué)檢查 A:先證者無擴(kuò)瞳眼底照相 可見雙眼視盤邊界清楚、顏色淡,眼底豹紋狀改變 B:先證者超廣角掃描激光眼底成像 可見雙眼周邊部視網(wǎng)膜多發(fā)散在骨細(xì)胞樣色素沉著(箭頭) C:先證者眼底自發(fā)熒光 可見雙眼黃斑中心低熒光(箭頭),中周部熒光增強(qiáng) D:先證者SS-OCT 可見雙眼視網(wǎng)膜外層變薄、萎縮,右眼黃斑中心凹內(nèi)層可見小囊腔 E:先證者父親SS-OCT 視網(wǎng)膜未見明顯異常 F:先證者母親SS-OCT 視網(wǎng)膜未見明顯異常 OD:右眼;OS:左眼

圖3 先證者視覺電生理檢查 A:F-VEP可見雙眼P2波峰時(shí)輕中度延遲,振幅正常 B:F-ERG可見雙眼各反應(yīng)平坦,未引出波形,呈熄滅型 OD:右眼;OS:左眼

2.2 基因檢測

通過全外顯子組測序?qū)ο茸C者行基因檢測,檢測到先證者攜帶VPS13B基因復(fù)合雜合變異,其中包含1個(gè)新的無義變異及1個(gè)已報(bào)道的剪接變異。

M1:VPS13Bc.11713C>T(p.Gln3905*)是1個(gè)新的無義變異,位于chr8-100883818,在gnomAD(EAS)、ExAC(EAS)、1000genomes(EAS)數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道。MutationTaster、LRT、DANN、FATHMM-MKL、CADD軟件均預(yù)測該變異是有害變異。根據(jù)ACMG指南,該變異為致病變異:PVS1+PM2-supporting。

M2:VPS13Bc.6940+1G>T是1個(gè)已報(bào)道的剪接變異,位于chr8-100732781,在gnomAD_exome(EAS)中的等位基因頻率為0.000 058 21,在1000genomes(EAS)中的等位基因頻率為0.001,在ExAC(EAS)數(shù)據(jù)庫中未出現(xiàn)過。MutationTaster、CADD軟件算法預(yù)測該變異有害。根據(jù)ACMG指南,該變異為致病變異:PVS1+PM2-supporting。

Sanger測序結(jié)果證實(shí),先證者父親攜帶雜合變異M1:VPS13Bc.11713C>T (p.Gln3905*);先證者母親攜帶雜合變異M2:VPS13Bc.6940+1G>T。先證者父母臨床表型正常,該家系符合常染色體隱性遺傳規(guī)律和家系共分離(圖4)。

圖4 先證者的家系圖譜以及Sanger測序圖 A:先證者(Ⅱ1)的家系圖譜 :男性攜帶者;⊙:女性攜帶者;■:男性患者;:先證者 B:家系成員Sanger測序驗(yàn)證圖 先證者父親(Ⅰ1)攜帶雜合變異M1:VPS13B c.11713C>T (p.Gln3905*);先證者母親(Ⅰ2)攜帶雜合變異M2:VPS13B c.6940+1G>T;先證者(Ⅱ1)攜帶M1和M2

2.3 文獻(xiàn)回顧分析

目前已發(fā)現(xiàn)VPS13B基因291個(gè)變異位點(diǎn)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)。已報(bào)道的中國Cohen綜合征患者中VPS13B基因變異位點(diǎn)共24個(gè),其中包括移碼變異位點(diǎn)10個(gè),占41.7%;錯(cuò)義變異位點(diǎn)5個(gè),占20.8%;剪接變異位點(diǎn)5個(gè),占20.8%;無義變異位點(diǎn)4個(gè),占16.7%(圖5)。

圖5 已報(bào)道的中國家系中VPS13B基因變異位點(diǎn)及蛋白質(zhì)示意圖 黑色為已報(bào)道變異位點(diǎn),紅色為本研究發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn),其中c.11713C>T是新發(fā)變異位點(diǎn)

Cohen綜合征患者發(fā)病年齡為28天～12歲,平均6歲?；颊叩纳窠?jīng)系統(tǒng)、眼、腦、骨骼等全身癥狀呈散發(fā)狀態(tài),早期臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性。回顧已報(bào)道的中國Cohen綜合征人群的臨床特征文獻(xiàn),共收集20例患者,其中16例以發(fā)育遲緩為主訴就診,1例以反復(fù)抽搐就診,3例以發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促為主訴就診。20例患者均有發(fā)育遲緩(占100%);15例患者有典型面部特征(占75%);13例患者有小頭畸形(占65%);11例患者有中性粒細(xì)胞減少癥(占55%);9例患者關(guān)節(jié)過度活動(dòng)/伸展(占45%);7例患者有過度社交行為(占35%);5例患者有眼部表型,出現(xiàn)近視或者視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(占25%);4例患者有四肢纖細(xì),軀干肥胖(占20%);僅有1例患者有癲癇表現(xiàn)(表1)。

表1 中國家庭VPS13B變異位點(diǎn)及Cohen綜合征的臨床特征

3 討論

Cohen綜合征常累及全身多個(gè)器官及系統(tǒng),臨床表型具有高度異質(zhì)性。Cohen綜合征尚缺少統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),為該病的臨床診斷帶來了極大挑戰(zhàn)。2004年,Kolehmainen等[3]總結(jié)的Cohen綜合征的8個(gè)診斷指標(biāo)被廣泛使用:Cohen綜合征的典型面部特征、高度近視和/或視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、小頭畸形、關(guān)節(jié)過度活動(dòng)/伸展、發(fā)育遲緩、四肢纖細(xì)和軀干肥胖、過度的社交行為或過度開朗的性格、中性粒細(xì)胞減少癥,多于6個(gè)指標(biāo)陽性可診斷為Cohen綜合征[3]。然而,由于癥狀累及多個(gè)器官,該標(biāo)準(zhǔn)在識別Cohen綜合征時(shí)的特異性不高,僅為77%,僅依靠臨床表現(xiàn)不能確診為Cohen綜合征。Cohen綜合征患者均出現(xiàn)發(fā)育遲緩,75%有面部特征,對于高度近視合并發(fā)育遲緩以及面部特征的患者臨床診斷應(yīng)給予重視,重點(diǎn)排查Cohen綜合征。目前未發(fā)現(xiàn)Cohen綜合征基因型與臨床表型明顯的相關(guān)聯(lián)系,但可以通過詳細(xì)詢問患者全身病史以及全面檢查減少誤診和漏診。

國內(nèi)外共有12篇以眼部表現(xiàn)為主的相關(guān)文獻(xiàn)。在已報(bào)道的20例中國患者中僅5例有眼部表現(xiàn)(占25%),一方面是由于Cohen綜合征患者眼部表型發(fā)生率較其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)生率低;另一方面,可能是由于部分患者以全身神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主,未行相關(guān)眼科檢查而忽略了眼科臨床表型,使眼部損害不能得到及時(shí)認(rèn)知,無法對此類患者做出全面且正確的診斷。迄今為止,國內(nèi)尚無首診于眼科的Cohen綜合征報(bào)道。

在本研究中,利用全外顯子測序鑒定出2個(gè)VPS13B基因變異M1:c.11713C>T(p.Gln3905*)和M2:c.6940+1G>T(NM_017890),其中M1變異在國內(nèi)外均未報(bào)道過。生物信息學(xué)分析預(yù)測,上述2個(gè)基因變異均具有致病性,證實(shí)了Cohen綜合征的診斷。M1無義變異導(dǎo)致序列第61位外顯子第11 713位點(diǎn)堿基C變異為堿基T,相應(yīng)蛋白質(zhì)序列第3 905位谷氨酰胺氨基酸發(fā)生無義變異,該變異可能會(huì)導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子,產(chǎn)生截短蛋白或無義介導(dǎo)的mRNA降解,導(dǎo)致VPS13B蛋白的功能喪失或表達(dá)量降低,產(chǎn)生較為嚴(yán)重的Cohen綜合征。M2變異位點(diǎn)位于VPS13B基因38號內(nèi)含子的第1位,該位點(diǎn)為剪接位點(diǎn)供體,堿基G變異為T,導(dǎo)致該剪接位點(diǎn)無法被識別,整個(gè)38號外顯子區(qū)域不表達(dá),從而導(dǎo)致208個(gè)核苷酸的丟失,進(jìn)一步導(dǎo)致在編碼2 247處過早產(chǎn)生終止密碼子而產(chǎn)生截?cái)嗟腣PS13B蛋白質(zhì)[24,31,33]。VPS13B基因(也稱為COH1基因)主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液、肌肉和心臟中[7]。VPS13B基因編碼的VPS13B蛋白質(zhì)屬于保守VPS13家族蛋白質(zhì)中的一種,在進(jìn)化過程中保守,具有重要的生物學(xué)功能[6,34]。VPS13B蛋白是維持高爾基體完整性和發(fā)揮功能所必需的外周膜蛋白,其通過與GTPase RAB6的相互作用介導(dǎo)高爾基體的形成,與順式高爾基基質(zhì)蛋白GM130共定位,參與分泌蛋白的糖基化以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸,是神經(jīng)突觸生長所必需的蛋白。VPS13B基因是RAB6的效應(yīng)蛋白,當(dāng)VPS13B基因發(fā)生變異時(shí),高爾基體VPS13B蛋白質(zhì)功能受損,會(huì)造成神經(jīng)突生長抑制,從而導(dǎo)致Cohen綜合征患者表現(xiàn)出不同的臨床特征,其中神經(jīng)系統(tǒng)表型最突出,包括進(jìn)行性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、非進(jìn)行性智力障礙和產(chǎn)后發(fā)展的小頭畸形[6-8]。VPS13B蛋白對光感受器的良好發(fā)展必不可少。除此之外,VPS13B蛋白質(zhì)還與神經(jīng)元的發(fā)育、脂肪形成、糖基化、囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能有關(guān)[6-8,34]。

目前,Cohen綜合征尚無特異性的治療方法。初級治療為對癥治療,可根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行個(gè)體化康復(fù)訓(xùn)練。Cohen綜合征患者的運(yùn)動(dòng)和語言發(fā)育遲緩需要采取積極規(guī)范的康復(fù)訓(xùn)練措施配合治療,從而改善發(fā)育遲緩、肌張力減退和關(guān)節(jié)過度伸展的問題[9,35]。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子可用于治療中性粒細(xì)胞減少癥[35]。Cohen綜合征患者應(yīng)定期進(jìn)行眼科檢查以評估患者屈光不正和視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的情況。對于屈光不正患者,早期矯正對兒童發(fā)育有積極影響;對患有視網(wǎng)膜病變的患者,目前缺少有效治療方法,以對癥治療為主。除此之外,還應(yīng)監(jiān)測Cohen綜合征患者的生長發(fā)育情況,如身高和體重增加情況。

綜上所述,本研究通過全外顯子測序檢測到1個(gè)Cohen綜合征家系VPS13B基因1個(gè)新的致病變異c.11713C>T,擴(kuò)大了VPS13B基因致病變異譜。Cohen綜合征具有高度的基因型和表型異質(zhì)性,不能僅依靠臨床表型進(jìn)行診斷,需聯(lián)合基因測序診斷。對于高度近視患兒,眼科臨床醫(yī)生應(yīng)注意詳細(xì)詢問病史并進(jìn)行全面檢查避免漏診。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李瑞敏:參與選題、設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、撰寫文章;李亞、郭慶歌、游雅:實(shí)施研究、分析及解釋數(shù)據(jù);雷博:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、指導(dǎo)試驗(yàn)、對文章的知識性內(nèi)容進(jìn)行審閱和修改