中國(guó)漢族先天性視網(wǎng)膜劈裂癥一家系臨床及分子遺傳學(xué)分析

王婷婷 朱益華 范夢(mèng)杰 羅小玲 張林燕 張達(dá)人 丁小燕 劉旭陽(yáng),

1廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心,廈門 361000;2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,福州 350004;3深圳市人民醫(yī)院眼科 暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院,深圳 518040;4中山大學(xué)附屬中山眼科中心,廣州 510060

先天性視網(wǎng)膜劈裂癥,又稱X連鎖遺傳性視網(wǎng)膜劈裂癥(X-linked retinoschisis,XLRS),是一種少見(jiàn)的遺傳性致盲眼病,主要為X連鎖隱性遺傳,極少部分病例為常染色體隱性遺傳,患者幾乎為男性,女性一般為致病基因攜帶者,發(fā)病率為1/5 000～1/25 000[1]。該病為視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的層間分離,可發(fā)生于視網(wǎng)膜后極部和周邊部,主要在黃斑中心凹和顳下象限。XLRS臨床表現(xiàn)主要為自幼視力下降,可伴有斜視、眼球震顫等表現(xiàn),眼底可見(jiàn)視網(wǎng)膜劈裂呈輪輻狀改變,可出現(xiàn)玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離、黃斑裂孔等并發(fā)癥,預(yù)后不良[1]。XLRS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前比較認(rèn)可的機(jī)制主要有Müller細(xì)胞缺陷學(xué)說(shuō)、視網(wǎng)膜血管異常學(xué)說(shuō)、玻璃體異常學(xué)說(shuō)[2]。分子遺傳學(xué)研究顯示該病的致病基因是位于X染色體上的RS1基因,包含6個(gè)外顯子,編碼一段由224個(gè)氨基酸組成的蛋白。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的RS1基因突變位點(diǎn)超過(guò)200個(gè),大部分是位于4～6外顯子的錯(cuò)義突變,其他類型突變包括無(wú)義突變、剪接突變和移碼突變[3-5]。本研究發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)國(guó)內(nèi)僅2位研究者報(bào)道,且無(wú)臨床表型及基因型的詳細(xì)描述,而國(guó)外尚無(wú)報(bào)道。本研究對(duì)XLRS一家系的臨床表型及基因型進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究方法,收集2021年8月于廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心就診的漢族XLRS一家系共3代8人。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào):XMYKZX-KY-2021-012),所有受檢者或未成年人的監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1全身檢查及眼部檢查 詳細(xì)詢問(wèn)受檢者病史。全身檢查包括口面部、骨骼、關(guān)節(jié)、肌肉及聽(tīng)力檢查。眼部檢查包括裸眼視力、醫(yī)學(xué)驗(yàn)光、最佳矯正視力、非接觸式眼壓計(jì)(TX-20型,日本佳能公司)、裂隙燈顯微鏡、直接檢眼鏡、彩色眼底照相(Visucam 524,德國(guó)蔡司公司)、廣角眼底照相(英國(guó)歐堡公司)、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)儀(Cirrus HD-OCT 5000,德國(guó)蔡司公司)、視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)(美國(guó)LKC公司)。

1.2.2全外顯子組測(cè)序分析及基因變異篩選 采用Haplo Painter軟件繪制家系圖,并進(jìn)行系譜分析。采集先證者10 ml外周血及家系成員2 ml外周血分于乙二胺四乙酸抗凝管中,按DNA提取試劑盒(福建佰孟醫(yī)學(xué)科技有限公司)說(shuō)明書方法提取基因組DNA,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop 2000紫外分光光度儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)檢測(cè)DNA濃度及純度后進(jìn)行基因組建庫(kù)。采用快速DNA酶切文庫(kù)構(gòu)建試劑盒[納昂達(dá)(南京)生物科技有限公司]進(jìn)行酶切打斷、末端修復(fù)、磷酸化以及加polyA,片段兩端分別連接接頭制備DNA文庫(kù)。將文庫(kù)與帶有生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交,使用磁珠將全外顯子區(qū)域進(jìn)行捕獲并富集,經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢,取合格樣本使用DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)(深圳華大智造科技股份有限公司)進(jìn)行高通量測(cè)序。

采用Chromas軟件(technelysium平臺(tái))識(shí)別基因組單核苷酸變異(single nueleotide variants,SNV)和插入缺失(Insertion-deletion,InDel)變異;通過(guò)與dbSNP(v141)、1000 Genomes等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),過(guò)濾掉常見(jiàn)SNV和InDel變異后,篩選得到的變異用于下一步擴(kuò)大驗(yàn)證。

1.2.3家系基因變異位點(diǎn)Sanger測(cè)序驗(yàn)證及致病性分析 采用Premier 5.0 設(shè)計(jì)候選變異位點(diǎn)引物。分別對(duì)家系內(nèi)其他患者及正常人的基因組DNA各個(gè)候選變異位點(diǎn)所在的上下游區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(正向引物序列:5'-GCCTTGTTTGCAGTCCACGA-3';反向引物序列:5'-TCACTGTGCACCTCTTGGTTT-3')。將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純化后,使用ABL3730XL型DNA測(cè)序儀(美國(guó)ABL公司)進(jìn)行Sanger測(cè)序,并根據(jù)突變?nèi)巳撼霈F(xiàn)頻率、家系內(nèi)基因型和表型是否共分離及CADD、FATHMM、REVEL、SIFT、PROVEAN、LRT、Polyphen2HDiv、Polyphen 2HVar生物信息學(xué)分析工具進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 XLRS家系的遺傳方式及特點(diǎn)

該漢族XLRS家系共3代8人,家系中無(wú)近親結(jié)婚史,其中符合XLRS臨床診斷的患者共3例,均為男性,且為隔代發(fā)病,另有1例女性相關(guān)基因攜帶者為先證者母親,表型正常者5人,其中1人已去世。因此該家系符合X連鎖隱性遺傳方式(圖1)。

圖1 XLRS家系圖 ▇:患病男性;□:正常男性;○:正常女性;⊙:女性攜帶者;:先證者;:已故男性

2.2 XLRS家系患者及攜帶者臨床表現(xiàn)

家系中所有成員均無(wú)全身性病變。先證者(Ⅲ1),10歲,男,自幼視力下降,右眼視力數(shù)指/30 cm,矯正視力-4.50 DS→0.05,左眼視力0.05,矯正視力-3.75 DS/-0.75 DC×20→0.25;眼壓右眼10.1 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),左眼13.0 mmHg;雙眼角膜透明,前房中深,虹膜紋理清,瞳孔圓,晶狀體透明。廣角眼底照相示雙眼黃斑區(qū)劈裂呈現(xiàn)輪輻狀外觀,周邊部視網(wǎng)膜皺褶(圖2)。OCT示雙眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜呈囊樣擴(kuò)張改變,其囊腔中被垂直的橋狀組織所分割,無(wú)炎癥滲出性改變,右眼較左眼明顯(圖2)。ERG示暗適應(yīng)狀態(tài)下,視桿細(xì)胞振幅重度降低,潛伏期延長(zhǎng);明適應(yīng)狀態(tài)下,視錐細(xì)胞振幅重度降低,潛伏期延長(zhǎng)。

圖2 先證者Ⅲ1廣角彩色眼底照相及OCT圖 廣角眼底照相示雙眼黃斑區(qū)劈裂呈輪輻狀外觀;OCT示雙眼黃斑區(qū)囊樣擴(kuò)張 OCT:光學(xué)相干斷層掃描

先證者胞弟(Ⅲ2),7歲,與先證者有類似眼部表現(xiàn)。右眼視力0.06,矯正視力-4.25 DS/-0.50 DC×85°→0.2,左眼視力0.08,矯正視力-2.25 DS/-1.00 DC×90°→0.3;眼壓右眼14.1 mmHg,左眼10.0 mmHg;雙眼角膜透明,前房中深,虹膜紋理清,瞳孔圓,晶狀體透明。彩色眼底照相示雙眼黃斑區(qū)劈裂,隱約呈現(xiàn)輪輻狀外觀(圖3)。OCT示雙眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜呈現(xiàn)囊樣擴(kuò)張改變,其囊腔中被垂直的橋狀組織所分割,無(wú)炎癥滲出性改變(圖3)。

圖3 先證者胞弟Ⅲ2彩色眼底照相及OCT圖 彩色眼底照相示雙眼黃斑區(qū)劈裂呈輪輻狀外觀;OCT示雙眼黃斑區(qū)囊樣擴(kuò)張 OCT:光學(xué)相干斷層掃描

先證者外公(Ⅰ3),71歲,右眼自幼盲,曾于外院行左眼白內(nèi)障手術(shù)。視力右眼無(wú)光感,左眼0.04;眼壓右眼14.0 mmHg,左眼13.0 mmHg。雙眼角膜透明,前房中深,虹膜紋理清,瞳孔圓;右眼晶狀體混濁,眼底無(wú)法窺入,左眼人工晶狀體位正,晶狀體后囊膜混濁。OCT示左眼黃斑中心凹變平,各層界限不清,視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層萎縮。

先證者母親(Ⅱ2),33歲。雙眼視力1.0;雙眼角膜透明,前房中深,虹膜紋理清,瞳孔圓,晶狀體透明,眼底視網(wǎng)膜平伏。OCT示雙眼視網(wǎng)膜各層界限清,視網(wǎng)膜厚度正常(圖4)。

圖4 先證者母親Ⅱ2雙眼OCT圖 雙眼視網(wǎng)膜各層界限清晰

2.3 基因測(cè)序及致病性分析

通過(guò)高通量目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序和Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn),該家系患者均存在RS1基因上1個(gè)已知的半合子變異c.214G>C:p.Glu72Gln,與疾病共分離。先證者母親為相關(guān)基因攜帶者,該位點(diǎn)為雜合變異,家系中其余正常成員該位點(diǎn)為野生型(圖5)。該變異人群頻率低于0.01,經(jīng)生物信息學(xué)分析,CADD、FATHMM、SIFT、PROVEAN均預(yù)測(cè)有害;Polyphen2HDiv、Polyphen 2HVar預(yù)測(cè)很可能致病;REVEL預(yù)測(cè)得分為0.931。

圖5 XLRS家系RS1基因Sanger測(cè)序結(jié)果 A:該家系患者為RS1基因半合子變異c.214G>C B:女性攜帶者(Ⅱ2)該位點(diǎn)為雜合變異 C:家系正常成員該位點(diǎn)為野生型

3 討論

XLRS臨床表現(xiàn)為黃斑部呈放射狀的細(xì)小視網(wǎng)膜皺褶和囊樣擴(kuò)張改變,視網(wǎng)膜劈裂可以分為中層和外層劈裂,其中中層劈裂可單獨(dú)存在,而外層劈裂總是伴隨中層劈裂[6-8]。當(dāng)液化的玻璃體通過(guò)視網(wǎng)膜劈裂部位進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔時(shí),容易出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離;當(dāng)視網(wǎng)膜血管長(zhǎng)入玻璃體腔時(shí),容易出現(xiàn)玻璃體積血,造成更嚴(yán)重的視力下降。此外,患者還可能出現(xiàn)眼球震顫、斜視、黃斑裂孔、新生血管性青光眼等并發(fā)癥,對(duì)視力造成威脅[9-10]。

臨床上,相關(guān)的眼科輔助檢查對(duì)XLRS的診斷和治療顯得尤為重要。彩色眼底照相可觀察到視網(wǎng)膜劈裂呈輪輻狀外觀,而周邊部視網(wǎng)膜劈裂表現(xiàn)可能不明顯。OCT可快速獲得視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的高分辨率橫截面圖像。XLRS患者的OCT檢查顯示黃斑中心凹劈裂主要發(fā)生在內(nèi)核層,偶爾發(fā)生在外核層/外叢狀層,很少發(fā)生在神經(jīng)纖維層,OCT表現(xiàn)為黃斑區(qū)及周邊視網(wǎng)膜呈囊樣擴(kuò)張改變,囊腔中被垂直的橋狀組織分割[11]。文獻(xiàn)報(bào)道XLRS患者ERG顯示b波下降、a波不變,b/a波振幅值下降[12]。熒光素眼底血管造影顯示患者黃斑部在動(dòng)脈期表現(xiàn)為不規(guī)則的點(diǎn)狀強(qiáng)熒光,部分密集呈點(diǎn)狀或塊狀,晚期形態(tài)無(wú)顯著改變[12]。

本研究家系的特征為患者皆為男性、隔代遺傳,符合X連鎖隱性遺傳模式。先證者及其胞弟、外公均自幼視力差,其中先證者及其胞弟表現(xiàn)為明顯的黃斑區(qū)囊樣擴(kuò)張改變,囊腔中可見(jiàn)垂直的橋狀組織,劈裂發(fā)生于神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14];先證者外公視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層萎縮。先證者母親為RS1基因變異的攜帶者,眼底未見(jiàn)明顯異常,雙眼視力1.0,與文獻(xiàn)報(bào)道女性攜帶者通常具有正常的視網(wǎng)膜功能相一致[7,15-16]。也有研究顯示,因父母近親結(jié)婚導(dǎo)致純合子變異的XLRS女性患者可出現(xiàn)相應(yīng)眼底癥狀[17-18]。

XLRS的致病基因?yàn)镽S1基因,視網(wǎng)膜RS1蛋白盤狀結(jié)構(gòu)域內(nèi)的致病突變將破壞光感受器細(xì)胞、雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞間的黏附和信號(hào)傳遞,影響視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性,導(dǎo)致疾病的發(fā)生[19-20]。石慧等[21]發(fā)現(xiàn)RS1基因c.625C>T:p.Arg209Cys位點(diǎn)突變的XLRS患者表現(xiàn)為黃斑多個(gè)囊樣改變區(qū),視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層分離,中間多條橋狀視網(wǎng)膜組織連接,分割成多個(gè)囊樣低反光區(qū)。蔡博等[10]對(duì)XLRS家系進(jìn)行基因型和表型分析,發(fā)現(xiàn)RS1基因c.668G>A:p.C223Y位點(diǎn)及c.618G>A:p.W206X位點(diǎn)突變的患者均表現(xiàn)為雙眼黃斑囊腔隆起,近黃斑旁小囊腔減少,囊壁變薄,外界膜、肌樣體帶和橢圓體帶破壞,外顯子1缺失的患者表現(xiàn)為雙眼黃斑囊腔隆起,近黃斑旁見(jiàn)多個(gè)小囊腔。但Yi等[22]發(fā)現(xiàn)同樣為RS1基因c.668G>A:p.C223Y突變的中國(guó)患者表現(xiàn)為黃斑區(qū)和周邊視網(wǎng)膜劈裂,伴視網(wǎng)膜裂孔,說(shuō)明該突變位點(diǎn)的XLRS患者臨床表型具有異質(zhì)性。也有研究者認(rèn)為XLRS表型與基因型之間目前尚未明確對(duì)應(yīng)關(guān)系,除了RS1基因突變,可能還存在其他基因調(diào)控或環(huán)境影響因素[23]。

馬翔等[12]比較輕型XLRS(僅表現(xiàn)為黃斑中心凹劈裂,病情穩(wěn)定)和重型XLRS(黃斑中心凹劈裂合并周邊部視網(wǎng)膜劈裂或伴玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥)的基因突變類型,發(fā)現(xiàn)外顯子1突變(L9CfsX20移碼突變及IVS1+2T→C內(nèi)含子1剪切位點(diǎn)突變)的XLRS患者表現(xiàn)為重型XLRS,可能是由于RS1基因上游缺失與外顯子1～3突變阻止或破壞了功能性mRNA的合成與信號(hào)傳遞,導(dǎo)致RS1蛋白缺失或無(wú)功能,因此外顯子1～3突變常導(dǎo)致嚴(yán)重的XLRS。外顯子4的Arg102Gln突變,外顯子5的Asp145His突變,外顯子6的Arg209His突變、Arg213Gl突變和Arg213Gln突變也表現(xiàn)為重型XLRS,但外顯子6的Arg209His突變家系內(nèi)存在輕型XLRS患者,說(shuō)明基因的其他作用參與了疾病的嚴(yán)重程度。外顯子5的Arg156Gly和Trp163X突變、外顯子4的Ser73Pro突變、外顯子6的Arg200Cys和Cys 223Arg突變均表現(xiàn)為輕型XLRS;但Hayashi等[24]報(bào)道外顯子4的Ser73Pro突變可導(dǎo)致重型XLRS,說(shuō)明相同的基因突變?cè)诓煌蚁祷颊唛g的臨床表型可能存在差異。

本研究家系中患者僅表現(xiàn)為黃斑區(qū)輪輻狀劈裂,周邊部視網(wǎng)膜皺褶,為輕型XLRS;RS1基因變異位點(diǎn)為外顯子4的c.214G>C:p.Glu72Gln突變,該變異導(dǎo)致RS1基因第214位堿基G被替換為C,導(dǎo)致第72號(hào)氨基酸由谷氨酸變成谷氨酰胺,該區(qū)域編碼RS1蛋白的盤狀結(jié)構(gòu)域。截至目前,只有2位中國(guó)研究者報(bào)道3個(gè)病例[25-26];尚未見(jiàn)國(guó)外研究者報(bào)道該變異位點(diǎn),推測(cè)該變異位點(diǎn)可能有種族遺傳特異性。俞萍等[25]在2001年報(bào)道了1個(gè)XLRS家系和1個(gè)散發(fā)XLRS病例,但缺少相關(guān)臨床特征描述。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)1例RS1基因c.214G>C:p.Glu72Gln突變患者23歲發(fā)病,雙眼黃斑萎縮、周邊部視網(wǎng)膜劈裂、色素沉著。而本研究中先證者及其胞弟無(wú)視網(wǎng)膜色素沉著,可能與患者年齡較小有關(guān)。

XLRS需與其他眼病相鑒別。Norrie病與ND基因突變相關(guān),患者常在出生或嬰兒時(shí)期出現(xiàn)完全的視網(wǎng)膜脫離、白瞳癥,全身可能出現(xiàn)聽(tīng)力障礙、智力低下。Goldmann-Favre綜合征為隱性遺傳,與NR2E3基因變異相關(guān);臨床表現(xiàn)為中央或周邊部視網(wǎng)膜劈裂、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變性、玻璃體變性,熒光素眼底血管造影可見(jiàn)低熒光素滲漏,ERG顯示a波和b波振幅均下降。Stickler綜合征為常染色體顯性遺傳或常染色體隱性遺傳,致病基因?yàn)镃OL2A1、COL11A2等,是一種多器官受累的膠原結(jié)締組織病,主要累及眼部、口面部、內(nèi)耳、骨骼及關(guān)節(jié),眼部表現(xiàn)包括先天性近視、白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜脫離、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮、視網(wǎng)膜裂孔[27-28]。

目前尚缺少明確可治愈XLRS的方法,對(duì)出現(xiàn)XLRS并發(fā)癥的患者可進(jìn)行對(duì)癥治療,伴有玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離的患者行激光或手術(shù)治療。有研究者提出局部2%多佐胺滴眼液點(diǎn)眼可改善患者視力,但療效不明確[29-31]。因此,指導(dǎo)患者、攜帶者通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行科學(xué)的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷,可以有效避免患兒的出生,降低XLRS發(fā)病率。

綜上,本研究通過(guò)家系調(diào)查和眼科檢查確定了RS1基因c.214G>C:p.Glu72Gln半合子變異與XLRS發(fā)病相關(guān),所發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)國(guó)外尚未見(jiàn)報(bào)道,國(guó)內(nèi)僅對(duì)1例XLRS患者的臨床表型進(jìn)行描述。本研究結(jié)果為XLRS臨床表型及基因變異位點(diǎn)相關(guān)性提供了更多的數(shù)據(jù),對(duì)指導(dǎo)疾病診斷和防治具有一定意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝感謝廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心黃星星主治醫(yī)師參與數(shù)據(jù)收集

作者貢獻(xiàn)聲明王婷婷:參與數(shù)據(jù)收集和分析、論文撰寫及修改;劉旭陽(yáng)、丁小燕:參與研究設(shè)計(jì)、論文修改和定稿;朱益華、范夢(mèng)杰、羅小玲、張林燕、張達(dá)人:參與數(shù)據(jù)收集和分析、臨床與遺傳學(xué)研究