miR-497對糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復(fù)的抑制作用及其靶向wnt3a調(diào)控機制

黃鈺清 楊燕寧 王楊 潘玉苗 程思敏

武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心,武漢430060

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計,截止到2021年全球約有5.37億成年糖尿病患者,患病人數(shù)約占全球成年人口的10.5%,其中中國約有1.4億患者[1]。糖尿病角膜病變(diabetic keratopathy,DK)一般表現(xiàn)為眼部外傷或術(shù)后持續(xù)性角膜上皮缺損、愈合延遲、淺層點狀角膜炎,逐步發(fā)展為角膜潰瘍,嚴重影響患者生活質(zhì)量[2]。微小RNA(microRNA,miR)是一組約含22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA,通過特異性識別目的mRNA上3'UTR序列介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默[3-4]。近年來的研究證明miR-497是參與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因子之一,調(diào)控腫瘤細胞的增生、遷移以及糖代謝等[5]。Wnt/β-catenin是一條經(jīng)典信號通路,參與維持成人組織的穩(wěn)態(tài)和促進再生。已有研究證明其通過促進表皮細胞增生以及角朊細胞分化、遷移加速傷口修復(fù)[6]。Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)胰島素通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路促進I型糖尿病小鼠角膜神經(jīng)修復(fù)及上皮創(chuàng)口愈合。通過Targetscan和miRanda等生物信息預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn),miR-497與wnt3a的3'-UTR存在互補結(jié)合位點,推測miR-497可能參與Wnt/β-catenin通路調(diào)控。故本研究選取野生型(wild type,WT)C57BL/J6小鼠、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的miR-497敲除和過表達轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠,通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射誘導(dǎo)I型糖尿病小鼠模型并刮除部分角膜上皮觀察其愈合速率,探討miR-497和wnt3a是否參與糖尿病小鼠角膜上皮修復(fù)過程及其可能的作用機制,希望為臨床診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 選取6～8周齡健康清潔級C57BL/J6雄性小鼠40只,體質(zhì)量18～20 g,由武漢大學(xué)動物實驗中心提供[小鼠生產(chǎn)許可證號:SYXK(鄂)2015-0027]和同周齡健康CRISPR/Cas9介導(dǎo)的miR-497敲除和過表達C57BL/6雄性小鼠各20只,由武漢大學(xué)消化實驗室惠贈[賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司合成,小鼠生產(chǎn)許可證號:SYXK(蘇)2012-0061]。人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cell,HCEC)HTX2326為本實驗凍存。實驗流程遵循視覺與眼科研究協(xié)會相關(guān)規(guī)定,并通過武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號:2019K-K010)。

1.1.2主要試劑及儀器 鹽酸丙美卡因滴眼液(美國Alcon公司);青/鏈霉素雙抗溶液、STZ(美國Sigma公司);兔抗小鼠wnt3a單克隆抗體(英國Abcam公司);鼠抗小鼠β-catenin單克隆抗體(美國Affnity公司);DMEM培養(yǎng)基、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(武漢塞維爾生物有限公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)、CCK8試劑盒、Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);胎牛血清(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)。NanoDrop分光光度計(美國Thermo公司);實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司);化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1糖尿病小鼠角膜上皮損傷模型建立及分組 取40只WT C57BL/J6小鼠,按照隨機數(shù)字表法平均分為空白對照組和模型對照組。取CRISPR/Cas9介導(dǎo)miR-497敲除和過表達C57BL/J6小鼠各20只,分別作為miR-497敲除組和miR-497過表達組。模型對照組、miR-497敲除組和miR-497過表達組小鼠禁食12 h后,根據(jù)體質(zhì)量以50 mg/kg于左下腹腔注射STZ,連續(xù)注射5 d,此后正常飼養(yǎng)小鼠。于末次注射后8周取小鼠尾靜脈血,用血糖儀檢測隨機血糖,將3次血糖濃度平均值≥16.7 mmol/L的小鼠納入糖尿病模型小鼠?？瞻讓φ战M小鼠注射相同濃度、pH值為4.5的枸櫞酸鈉緩沖液。

取模型對照組、miR-497敲除組和miR-497過表達組糖尿病模型建造成功的小鼠,記錄體質(zhì)量和血糖后用10%水合氯醛(5 mg/kg)腹腔注射麻醉,鹽酸丙美卡因滴眼液點右眼行表面麻醉,棉簽蘸去多余水分,用直徑2 mm的角膜環(huán)鉆垂直角膜中央進行按壓標記,用力過程中不傷及角膜基質(zhì)層,隨后用板層刀刮除角膜環(huán)鉆標記范圍內(nèi)的角膜上皮。實驗操作完畢后,小鼠右眼點用左氧氟沙星凝膠預(yù)防感染?？瞻讓φ战M小鼠給予同樣方法建立角膜上皮損傷模型。

1.2.2裂隙燈顯微鏡下觀察小鼠角膜上皮損傷后不同時間點角膜愈合情況 分別于角膜上皮損傷后0、12、24和36 h進行角膜熒光素鈉染色,在裂隙燈顯微鏡鈷藍燈下觀察各組角膜上皮損傷修復(fù)情況,并拍照記錄。采用ImageJ軟件自動測量計算角膜上皮缺損面積,并計算各時間點角膜缺損面積百分比(%)=各時間點角膜缺損面積/造模后0 h角膜缺損面積×100%。

1.2.3Western blot法檢測小鼠角膜組織中wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量 小鼠角膜上皮損傷模型建立后36 h,每組各任取4只小鼠,頸椎脫臼法處死后剖取角膜組織加入裂解液,收集樣本檢測總蛋白濃度,行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜,體積分數(shù)5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h,加入一抗wnt3a(1∶1 000稀釋)、β-catenin(1∶1 000稀釋)和GAPDA(1∶3 000稀釋),4 ℃孵育過夜,TBST漂洗3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體(1∶5 000)室溫下孵育1 h,用TBST漂洗3次并滴加新鮮配制的ECL發(fā)光液,避光靜置5 min,使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀采集圖像信息,并采用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計算各目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次,取平均值。

1.2.4實時熒光定量PCR法檢測小鼠角膜組織中miR-497和細胞增生相關(guān)基因CyclinD1、c-Myc、Ki-67mRNA表達量 小鼠角膜上皮損傷模型建立后36 h,每組各任取3只小鼠,頸椎脫臼法處死后剖取角膜,按Trizol說明書提取角膜組織總RNA,NanoDrop分光光度計測定總RNA濃度和純度,取A260/A280為1.8～2.1的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。wnt3a、β-catenin及細胞增生相關(guān)基因引物序列見表1,由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s、57 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共32個循環(huán);72 ℃再延伸5 min至4 ℃。分別用U6、GAPDH作為miR-497和其余目的基因內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次,取平均值。

表1 PCR引物序列

1.2.5雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-497對wnt3a的靶向性 取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HCEC,分別將WT或突變型(mutant type,MUT)wnt3a載體與miR-497-5p擬似物、miR-497-5p陰性對照或空載體共轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)48 h后,按照熒光素酶檢測試劑盒說明書,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定各組螢火蟲和海腎熒光素酶活性,以海腎熒光素酶為內(nèi)參,測定WT wnt3a和MUT wnt3a細胞熒光素酶活性。

1.2.6HCEC分組及miRNA轉(zhuǎn)染 將HCEC接種至6孔板中,置于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、95%濃度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細胞融合至80%,更換為含2%胎牛血清、無抗生素DMEM培養(yǎng)基,并將細胞分為miR-497 mimics組、mimics陰性對照組、miR-497-inhibitor組、inhibitor陰性對照組,分別使用Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑將附有熒光基團的miR-497 mimics、miR-497-mimics陰性對照、miR-497-inhibitor、miR-497-inhibitor陰性對照轉(zhuǎn)染至HCEC中,24 h后通過熒光顯微鏡觀察細胞,評估轉(zhuǎn)染率并繼續(xù)培養(yǎng)至細胞完全融合。

1.2.7CCK8法檢測各轉(zhuǎn)染組HCEC增生活力 取各組轉(zhuǎn)染成功的細胞按照1×103個/孔接種于96孔板,并使用含25%葡萄糖的高糖DMEM培養(yǎng);另設(shè)置正常對照組和高糖組HCEC,分別使用含5%及25%葡萄糖的DMEM進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK-8 溶液,37 °C避光孵育4 h。使用酶標儀測量每組450 nm處細胞的吸光度(absorbance,A)值。實驗獨立重復(fù)3次,取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型小鼠建立情況

末次腹腔注射STZ后,各糖尿病模型組小鼠出現(xiàn)持續(xù)性多飲、多尿伴血糖升高,體質(zhì)量下降。注射STZ后8周,空白對照組、模型對照組、miR-497敲除組和miR-497過表達組小鼠血糖濃度分別為(4.20±0.17)、(25.30±0.17)、(23.30±0.06)和(24.77±0.18)mmol/L,體質(zhì)量分別為(28.20±0.07)、(15.70±0.11)、(17.31±0.15)和(14.92±0.15)g,總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.46、22.24,均P<0.01),其中模型對照組、miR-497敲除組和miR-497過表達組小鼠血糖濃度明顯高于空白對照組,體質(zhì)量明顯低于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 各模型組小鼠角膜上皮損傷后不同時間點愈合情況比較

角膜上皮損傷后12 h和24 h,空白對照組和miR-497敲除組角膜熒光素鈉著染面積明顯小于模型對照組,miR-497過表達組角膜熒光素鈉著染面積較模型對照組大;角膜上皮損傷后36 h,空白對照組和miR-497敲除組角膜熒光素鈉著染幾乎不可見,模型對照組和miR-497過表達組角膜中央仍有部分染色(圖1)。各組不同時間點皮缺損面積百分比總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F分組=138.53,P<0.01;F時間=22.12,P<0.01);其中角膜上皮損傷后12、24和36 h時模型對照組小鼠角膜上皮缺損面積百分比明顯高于空白對照組和miR-497敲除組,但低于miR-497過表達組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠角膜上皮刮除后不同時間點角膜上皮缺損面積百分比比較(x±s,%)

2.3 各組小鼠上皮損傷后36 h角膜組織中wnt3a、β-catenin表達比較

角膜上皮損傷后36 h,與模型對照組比較,miR-497敲除組wnt3a和β-catenin蛋白條帶灰度增強,miR-497過表達組wnt3a和β-catenin蛋白條帶灰度減弱(圖2)。各組小鼠角膜組織中wnt3a及β-catenin蛋白相對表達量總體比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.98、36.38,均P<0.05);其中與空白對照組比較,模型對照組小鼠角膜組織wnt3a及β-catenin蛋白相對表達量明顯下降;與模型對照組相比,miR-497敲除組小鼠角膜組織wnt3a及β-catenin蛋白相對表達量升高,miR-497過表達組角膜組織各蛋白相對表達量明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表3)

圖2 各組小鼠造模后36 h角膜組織wnt3a及β-catenin 表達電泳圖 與模型對照組比較,miR-497敲除組wnt3a和β-catenin蛋白條帶灰度增強,miR-497過表達組wnt3a和β-catenin蛋白條帶灰度減弱 1:空白對照組;2:模型對照組;3:miR-497敲除組;4:miR-497過表達組 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表3 各組小鼠角膜上皮損傷后36 h角膜組織wnt3a和β-catenin相對表達量比較(x±s)

2.4 各組造模后36 h小鼠角膜組織中細胞增生相關(guān)基因和miR-497表達比較

模型對照組、miR-497敲除組和miR-497過表達組CyclinD1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.14、1.34±0.09和0.79±0.11,c-Myc mRNA相對表達量分別為1.00±0.15、1.53±0.13和0.75±0.04,Ki-67 mRNA相對表達量分別為1.00±0.04、1.13±0.10和0.89±0.12,miR-497相對表達量分別為1.00±0.02、0.63±0.06和1.48±0.03,總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.53、19.62、25.62、19.62,均P<0.01);其中模型對照組CyclinD1、c-Myc和Ki-67 mRNA相對表達量均低于miR-497敲除組,高于miR-497過表達組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);miR-497敲除組miR-497相對表達量明顯低于模型對照組,miR-497過表達組miR-497相對表達量明顯高于模型對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)

圖3 各模型組小鼠造模36 h后角膜組織CyclinD1、c-Myc、Ki-67 mRNA以及miR-497相對表達量比較 (單因素方差分析,LSD-t檢驗,n=3) A:各組CyclinD1 mRNA相對表達量比較 F=22.53,P<0.01 B:各組c-Myc mRNA相對表達量比較 F=19.62,P<0.01 C:各組Ki-67 mRNA相對表達量比較 F=25.62,P<0.01 D:各組miR-497相對表達量比較 F=19.62,P<0.01 與模型對照組比較,aP<0.05 1:模型對照組;2:miR-497敲除組;3:miR-497過表達組

2.5 miR-497靶向結(jié)合wnt3a后各族熒光素酶活性比較

Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-497-5p與wnt3a 3'UTR具有結(jié)合位點(圖4)。通過雙熒光素酶檢測顯示,WT wnt3a共轉(zhuǎn)染細胞中miR-497-5p mimics組熒光素酶活性低于miR-497-5p陰性對照組和空載體組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);MUT wnt3a轉(zhuǎn)染細胞中,各組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.73,P=0.59)(表4)

圖4 Wnt3a與miR-497存在互補的核苷酸序列 miR:微小RNA

表4 各組熒光素酶活性比較(x±s)

2.6 各組HCEC miR-497表達量及增生活性比較

各組細胞miR-497表達量和增生A值總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.87、35.38,均P<0.01),其中miR-497 mimics組miR-497相對表達量明顯高于高糖組和mimics陰性對照組,miR-497 inhibitor組miR-497相對表達量明顯低于高糖組和inhibitor陰性對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表5)。與正常對照組相比,高糖組細胞增生A值明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與高糖組比較,miR-497 inhibitor組細胞增生A值明顯升高,miR-497 mimics組細胞增生A值明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表6)。

表5 各組細胞miR-497相對表達量比較(x±s)

3 討論

目前有46%～64%的糖尿病患者罹患DK[8]。隨著糖尿病患病率的攀升,DK逐漸受到眼科醫(yī)生的重視。目前針對DK的傳統(tǒng)治療主要包括人工淚液、促進角膜修復(fù)的自體血清、繃帶鏡配戴等;病情嚴重的患者多考慮羊膜覆蓋、眼瞼縫合等手術(shù)療法,但治療時間長且預(yù)后較差。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進步,包括基因靶向治療在內(nèi)的新型生物療法有望為DK患者提供更加高效且穩(wěn)定的治療手段。

miR-497已被證明參與多種腫瘤的發(fā)病,并參與包括心肌梗塞、腦梗死、消化道炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[9-15]。Tang等[13]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了miR-497抑制劑的骨髓間充質(zhì)干細胞可促進大鼠心肌損傷修復(fù),且修復(fù)過程伴有wnt3a、β-catenin等Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達水平的升高。

Wnt/β-catenin信號通路被證實在糖尿病以及眼部疾病中發(fā)揮作用[16-23]。Ouyang等[19]證明了Wnt通路參與角膜緣干細胞分化,促進角膜修復(fù)。本實驗成功構(gòu)建糖尿病小鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型對照組小鼠角膜上皮愈合明顯較空白對照組延遲,與DK的臨床癥狀相符;Western blot檢測結(jié)果顯示,模型對照組小鼠角膜中wnt3a、β-catenin Wnt通路相關(guān)蛋白較空白對照組表達明顯下調(diào);且熒光定量PCR結(jié)果提示,模型對照組小鼠角膜中miR-497表達較空白對照組明顯上調(diào)。基于以上結(jié)果推測miR-497和Wnt通路參與調(diào)控糖尿病角膜上皮損傷修復(fù)。

為了進一步驗證miR-497與Wnt通路的調(diào)控關(guān)系,本研究采用轉(zhuǎn)基因小鼠,發(fā)現(xiàn)miR-497敲除組小鼠角膜上皮愈合速度優(yōu)于模型對照組和miR-497過表達組,角膜組織中wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量也明顯高于模型對照組和miR-497過表達組,而miR-497過表達組各蛋白相對表達量明顯低于模型對照組,提示miR-497的下調(diào)可促進wnt3a、β-catenin的表達,激活Wnt通路。同時,熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-497敲除組小鼠角膜組織中細胞增生相關(guān)基因CyclinD1、c-Myc、Ki-67mRNA相對表達量均高于模型對照組,而miR-497過表達組各基因相對表達量均低于模型對照組,進一步提示miR-497可能通過調(diào)控Wnt3a/β-catenin通路影響細胞增生能力進而調(diào)控糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復(fù)。采用體外HCEC轉(zhuǎn)染模型進一步驗證,發(fā)現(xiàn)抑制miR-497表達可有效增加高糖培養(yǎng)HCEC的增生活力。本研究還通過雙熒光素酶基因報告實驗證明wnt3a為miR-497的靶基因之一。

綜上所述,隨著屈光、白內(nèi)障等手術(shù)的日益普及以及糖尿病患者數(shù)量的與日俱增,以糖尿病角膜上皮損傷修復(fù)延遲為代表的DK患者亟需眼科醫(yī)生的密切關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-497可明顯促進糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復(fù),且通過靶向wnt3a激活Wnt/β-catenin通路進而上調(diào)細胞增生相關(guān)基因的表達,可加速上皮缺損愈合。miR-497抑制劑或?qū)⒊蔀樘悄虿〗悄ど掀p傷修復(fù)延遲患者極具潛力的治療策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明黃鈺清:參與選題設(shè)計、收集數(shù)據(jù)、分析和解釋數(shù)據(jù)、論文撰寫及修改;楊燕寧:參與資料的分析和解釋、對文章知識性內(nèi)容作批評性審閱;王楊、潘玉苗、程思敏:參與實驗設(shè)計、論文修改