敲低GALNT2基因?qū)Ω咛桥囵B(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機制

孫天洋 格日勒圖 張玉鳳 李春宇 金琳 包嶺君 王佳樂

1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院,包頭 014060;2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院眼科,呼和浩特 010017;3長春市吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院眼科,長春 130012;4內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古臨床醫(yī)學(xué)院,呼和浩特 010110

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞之間連接緊密,是構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1-3]。長期高糖環(huán)境可誘導(dǎo)線粒體功能障礙,促進視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能障礙[4]。同時血管內(nèi)皮細(xì)胞增生是新生血管形成過程中的重要環(huán)節(jié),可致視網(wǎng)膜脫離和玻璃體積血,加重DR的發(fā)生和發(fā)展,造成視力不同程度下降[5-6]。DR的發(fā)病機制復(fù)雜,其治療常采用眼內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物、糖皮質(zhì)激素及其他抗炎藥物,但存在高眼壓、白內(nèi)障發(fā)病率升高的風(fēng)險[7]。各種抗氧化劑有助于改善DR早期微血管病變,但目前仍無法確定抗氧化治療的時機以及治療劑量與不良反應(yīng)之間的平衡問題[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙被認(rèn)為是DR的主要發(fā)病機制之一,預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可降低糖尿病性血管并發(fā)癥的風(fēng)險[9-10]。因此,迫切需要闡明高糖對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的可能分子機制,以期在一定程度上緩解DR的發(fā)展。多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2,GALNT2)是一種重要的糖基轉(zhuǎn)移酶,可調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)等受體酪氨酸激酶的活性,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[11]。目前針對GALNT2的研究大多與癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān),涉及其在不同組織中的差異表達(dá),影響細(xì)胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移等[12-14]。有研究顯示,在糖尿病模型大鼠的視網(wǎng)膜中GALNT2表達(dá)下調(diào),且促進了EGFR的磷酸化,對視網(wǎng)膜起保護作用[15]。推測GALNT2可能是預(yù)防和治療DR新的關(guān)鍵靶點或預(yù)測分子。本研究擬通過觀察高糖環(huán)境下敲低GALNT2對人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cells,HRCECs)增生及凋亡的影響,為DR的治療提供新的潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 HRCECs購自美國模式菌種收集中心。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司);BR-V108載體、TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司);凋亡試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)(美國eBioscience公司);Trizol(美國Sigma公司);兔抗GALNT2多克隆抗體(Ab262868)、兔抗表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)多克隆抗體(Ab184265)、兔抗EGFR多克隆抗體(Ab52894)、兔抗磷酸化EGFR(p-EGFR)多克隆抗體(Ab40815)(英國Abcam公司);兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體(AP0063,美國Bioworld公司);HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);胎牛血清(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hiscript QRT supermix for qPCR(+gDNA WIPER)試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green master mix試劑盒(南京Vazyme生物科技股份有限公司)。PCR儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);Nanodrop 2000c紫外分光光度計(美國Thermo Fisher科技公司);實時熒光定量PCR儀(7500,美國ABI公司);SDS-Acry/Bis蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司);流式細(xì)胞儀(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組和處理 將HRCECs復(fù)蘇后,置于含有青/鏈霉素雙抗混合液[每毫升含50 U(商品單位)青霉素和100 μg鏈霉素]、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,放入37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)并傳代,每2～3 d換液1次,待細(xì)胞生長至80%～90%融合度,取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的HRCECs用于實驗,用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液。按照1×104個/孔將細(xì)胞接種至96孔板中,待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為空白對照組、模型組、NC-shGALNT2組和shGALNT2組,分別用含5.5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖、shGALNT2陰性對照慢病毒+25 mmol/L葡萄糖和shGALNT2敲低慢病毒+25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2小發(fā)夾RNA慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)靶序列篩選設(shè)計原則,結(jié)合人HRCECs的基因序列和網(wǎng)站分析,以GALNT2基因為模板,設(shè)計多個19-21nt RNA干擾靶點序列,利用NCBI數(shù)據(jù)庫對確定的靶序列進行Blast分析,選取干擾靶點。根據(jù)已選靶點序列設(shè)計shRNA干擾序列,并在兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點以完成載體構(gòu)建。GALNT2 shRNA的正向引物序列為5'-GGAAGGAGGACTGGAATGA-3',反向引物序列為5'-CACCTGGTTGAACTTGTTGC-3'。除此之外,在正鏈3'端添加TTTTT終止信號,而反鏈5'端添加終止信號互補序列。設(shè)計完成后送上海生工生物工程有限公司合成單鏈DNA oligo。將合成的單鏈DNA oligo干粉溶解于退火緩沖液中(終濃度為100 mol/L),90 ℃水浴15 min,自然冷卻至室溫后,形成帶粘性末端的雙鏈。將退火的shRNA序列插入經(jīng)酶切的BR-V108載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,選取單克隆細(xì)胞,進行測序鑒定。

1.2.3細(xì)胞的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將HRCECs使用胰蛋白酶進行消化,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml,6孔板每孔加入500 μl細(xì)胞懸液,次日細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時進行慢病毒轉(zhuǎn)染。從-80 ℃冰箱取出慢病毒,4 ℃融化后根據(jù)細(xì)胞病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)值計算慢病毒用量。預(yù)設(shè)細(xì)胞MOI為100,慢病毒量為MOI×細(xì)胞數(shù)/病毒滴度(100×5×106/1×107=50 μl),在加入慢病毒同時加入5 μl polybrene。于培養(yǎng)后24 h熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率,48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測GALNT2 mRNA相對表達(dá)量 取各組培養(yǎng)48 h的HRCECs,采用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA,Nanodrop 2000c紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。GALNT2正向引物序列:5'-GGAAGGAGGACT GGAATGA-3',反向引物序列:5'-CACCTGGTTGAAC TTGTTGC-3;GAPDH正向引物序列:5'-TGACTTCAAC AGCGACACCCA-3',反向引物序列:5'-CACCCTGTT GCTGTAGCCAAA-3'。PCR反應(yīng)體系:SYBR Green mastermixs 5.00 μl、正向和反向引物各0.25 μl、Dye2 0.20 μl、cDNA 2.00 μl、RNase-Free H2O 2.30 μl,共10.00 μl。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火及延伸30 s,共40個循環(huán)。各組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計算各組細(xì)胞中GALNT2相對表達(dá)量。

1.2.5Western bolt法檢測GALNT2、EGFR、p-EGFR、EGF蛋白相對表達(dá)量 胰蛋白酶消化收集各組培養(yǎng)48 h的HRCECs,PBS洗滌,加入500 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量。取40 μg總蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST洗膜3次后加入GALNT2、EGF、EGFR、p-EGFR一抗(均1∶2 000稀釋)和GAPDH一抗(1∶3 000稀釋),4 ℃下孵育過夜。TBST洗膜后再加入稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3 000稀釋),室溫下孵育2 h,TBST洗膜后,采用電化學(xué)發(fā)光液顯影,轉(zhuǎn)至暗室采集圖像,采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參,計算各組細(xì)胞中目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.6CCK-8法檢測HRCECs細(xì)胞增生值 取各組處于對數(shù)生長期且長勢良好的HRCECs,胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×103個/ml,按照每孔200 μl接種于96孔板,向每孔中加入10 μl CCK-8試劑溶液,置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h,酶標(biāo)儀450 nm波長處測定細(xì)胞吸光度(absorbance,A)值,連續(xù)測定5 d。實驗重復(fù)3次。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測HRCECs細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化慢病毒感染后48 h各組細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次,離心半徑6 cm,1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液,取100 μl細(xì)胞懸液,加入Annexin V-FITC 溶液5 μl,混勻后避光反應(yīng)10 min,再加入PI染液5 μl輕輕混勻,于室溫下避光反應(yīng)20 min,最后加入結(jié)合緩沖液400 μl,流式細(xì)胞儀上樣檢測。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。計算各組HRCECs總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中GALNT2 mRNA相對表達(dá)量比較

空白對照組、模型組、NC-shGALNT2組和shGALNT2組細(xì)胞中GALNT2 mRNA相對表達(dá)量分別為1.01±0.18、2.95±0.53、3.25±0.15和0.61±0.08,總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=61.872,P<0.001),其中與空白對照組比較,模型組和NC-shGALNT2組中GALNT2 mRNA相對表達(dá)量明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與模型組比較,shGALNT2組中GALNT2 mRNA相對表達(dá)量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞中GALNT2 mRNA相對表達(dá)量比較 F=61.872,P<0.001.與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗,n=3) 1:空白對照組;2:模型組;3:NC-shGALNT2組;4:shGALNT2組 GALNT:多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶

2.2 各組HRCECs增生值比較

隨培養(yǎng)時間延長,各組細(xì)胞增生A值均有升高趨勢,其中模型組和NC-shGALNT2組增生A值接近,shGALNT2組增生A值逐漸高于模型組和NC-shGALNT2組(圖2)。培養(yǎng)5 d時,空白對照組、模型組、NC-shGALNT2組和shGALNT2組間細(xì)胞A值總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6 837.899,P<0.05),其中與空白對照組比較,模型組、NC-shGALNT2組和shGALNT2組中細(xì)胞增生A值均減小,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與NC-shGALNT2組比較,shGALNT2組中細(xì)胞增生A值明顯增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組培養(yǎng)5 d時細(xì)胞增生A值比較(x±s)

圖2 各組HRCECs不同時間點增生A值變化 隨著培養(yǎng)時間的延長,各組細(xì)胞增生A值均有升高趨勢,其中模型組和NC-shGALNT2組增生A值接近,shGALNT2組增生A值逐漸高于模型組和NC-shGALNT2組 A:吸光度;GALNT:多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

空白對照組、模型組、NC-shGALNT2組和shGALNT2組細(xì)胞凋亡率分別為(4.73±0.26)%、(8.66±0.25)%、(9.26±1.12)%和(5.47±0.18)%,總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=342.921,P<0.001),其中與空白對照組比較,模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組和NC-shGALNT2組比較,shGALNT2組中HRCECs凋亡率明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

圖3 Aannexin V-FITC/PI雙熒光染色流式細(xì)胞儀檢測各組HRCECs細(xì)胞凋亡情況 A:各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測圖 shGALNT2組細(xì)胞凋亡數(shù)少于模型組和NC-shGALNT2組 B:各組細(xì)胞凋亡率比較 F=324.921,P<0.001.與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗,n=3) 1:空白對照組;2:模型組;3:NC-shGALNT2組;4:shGALNT2組 GALNT:多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶

2.4 各組細(xì)胞中GALNT2、EGFR、EGF、p-EGFR蛋白相對表達(dá)量比較

蛋白電泳結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型組中GALNT2、EGFR蛋白條帶強度增加,EGF、p-EGFR蛋白條帶強度減弱;與模型組比較,shGALNT2組中GALNT2、EGFR蛋白條帶強度減弱,p-EGFR蛋白條帶強度增加(圖4)?？瞻讓φ战M、模型組、NC-shGALNT2組和shGALNT2組細(xì)胞中GALNT2、EGFR和p-EGFR蛋白相對表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.023、7.393、15.005,均P<0.05),其中模型組中GALNT2、EGFR蛋白相對表達(dá)量較空白對照組明顯升高,p-EGFR蛋白相對表達(dá)量較空白對照組明顯減少;shGALNT2組中GALNT2蛋白相對表達(dá)量較模型組明顯降低,p-EGFR蛋白相對表達(dá)量較模型組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。各組間EGF蛋白相對表達(dá)量總體比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.604,P=0.100)(表2)。

表2 各組細(xì)胞中GALNT2、EGF、EGFR和p-EGFR蛋白相對表達(dá)量比較(x±s)

圖4 Western blot法檢測各組HRCECs中EGF、EGFR、p-EGFR蛋白相對表達(dá)量 1:空白對照組;2:模型組;3:NC-shGALNT2組;4:shGALNT2組 GALNT:多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶;EGF:表皮生長因子;EGFR:表皮生長因子受體;p-EGFR:磷酸化表皮生長因子受體;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶

3 討論

DR是導(dǎo)致糖尿病患者盲的主要原因,也是發(fā)達(dá)國家勞動年齡人口可預(yù)防盲的主要原因[16-17]。視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞是高血糖的主要攻擊目標(biāo),闡明高糖誘導(dǎo)HRCECs凋亡的潛在機制并尋找新的治療靶點,對于DR防治具有重要的臨床意義。

GALNT2是介導(dǎo)黏蛋白O-型糖基化起始步驟的酶,黏蛋白O-型糖基化是O-型糖基化的常見類型。GALNT2通過將N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)添加到蛋白質(zhì)的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基上,啟動黏蛋白O-型糖基化[18-19]。White等[20]首次在1995年從人胎盤中鑒定和純化出GALNT2。既往研究證實,GALNT2可能作為新的腫瘤標(biāo)志物發(fā)揮重要作用。在GALNT2基因敲除的肝癌細(xì)胞中,EGFR的磷酸化增加,從而改變EGF、EGFR的表達(dá),增強了EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞生長和遷移[11]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中,GALNT2過表達(dá),EGFR上GalNAc(TN抗原)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,EGFR及其下游信號分子的磷酸化增強,證實抑制GALNT2的表達(dá)可以抑制口腔癌細(xì)胞的侵襲行為[21]。高糖環(huán)境中,下調(diào)GALNT2可促進人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生[14]。本研究結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞中GALNT2表達(dá)較空白對照組增加,提示GALNT2可能參與DR的發(fā)生和發(fā)展,而shGALNT2組細(xì)胞中GALNT2 mRNA和蛋白表達(dá)均減少,視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增生值明顯升高,且明顯抑制了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,提示敲低GALNT2具有抑制DR進展的作用。

EGFR是一種黏蛋白,其與配體結(jié)合后可形成同源或異源的二聚體,導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化和激活,隨后刺激下游信號通路絲裂原活化蛋白激酶等通路,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲以及增生[22]。EGFR在眼發(fā)育和光感受器分化中起關(guān)鍵作用[23-24]。有研究表明,在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變中,EGF與EGFR促進視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)生遷移、增生,而EGFR抑制劑可以減輕胰島素治療后視網(wǎng)膜血管滲漏的增加[25]。Maugeri等[25]在注射鏈脲佐菌素的大鼠視網(wǎng)膜模型中檢測出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的p-EGFR表達(dá)水平極低。Patel等[26]研究發(fā)現(xiàn),增生性DR患者視網(wǎng)膜中EGFR表達(dá)增加。本研究結(jié)果亦顯示,模型組HRCECs中EGFR相對表達(dá)量顯著升高,p-EGFR相對表達(dá)量顯著降低,而敲低GALNT2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)EGFR和p-EGFR的表達(dá)。已有研究顯示,下調(diào)GALNT2可通過促進RTKs的磷酸化來促進胃癌細(xì)胞增生[13],結(jié)合本研究結(jié)果推測,p-EGFR表達(dá)升高是敲低GALNT2發(fā)揮保護效應(yīng)的一種可能機制。本研究中,shGALNT2組較模型組EGF蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但shGALNT2組EGFR表達(dá)較模型組顯著降低。Hu等[12]關(guān)于胃腺癌的研究顯示,當(dāng)EGFR的糖基化調(diào)節(jié)時,其與配體EGF的結(jié)合親和力會發(fā)生改變,并提出敲低GALNT2激活EGFR可能與其配體表達(dá)量無關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果,推測在高糖條件下培養(yǎng)的HRCECs中,敲低GALNT2可能通過調(diào)控EGFR、p-EGFR參與DR的發(fā)生和發(fā)展進程,其激活EGFR可能也與EGF配體無關(guān),但仍需進一步證實。

本研究尚存在一些不足,僅從細(xì)胞實驗層面對敲低GALNT2在高糖培養(yǎng)HRCECs中的作用進行了觀察,后續(xù)實驗將進行血管侵襲實驗等以證明GALNT2-EGFR激活通路對細(xì)胞增生、遷移及侵襲能力的影響。

綜上,本研究結(jié)果表明,在高糖環(huán)境下,敲低GALNT2可以提高HRCECs細(xì)胞增生能力,減少HRCECs細(xì)胞凋亡,該過程可能與EGFR信號通路的激活有關(guān)。敲低GALNT2可能是防治DR的重要靶點,有待進一步經(jīng)在體研究及臨床轉(zhuǎn)化研究進行驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明孫天洋:實驗操作、論文撰寫;張玉鳳、李春宇、金琳、包嶺君、王佳樂:數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析;格日勒圖:實驗操作、論文撰寫、論文智力性內(nèi)容審閱及修改