松果菊苷對db/db糖尿病心肌病小鼠心肌細胞凋亡的改善作用

張 祥 郝亞榮

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由于糖尿病引起的廣泛的心肌血管疾病和心肌代謝紊亂引起的心肌壞死性疾病[1, 2]。糖尿病心肌病早期只表現(xiàn)為心肌細胞代謝紊亂和簡單的心臟組織結(jié)構(gòu)變化,后期由于左心室心肌細胞體積、心室壁厚和重量增加,舒張功能降低,逐漸發(fā)展為心肌細胞凋亡、壞死和肥大、纖維化,導致明顯的舒張和收縮功能障礙,最終可能發(fā)展成缺血性心臟病和心力衰竭,因此,現(xiàn)階段對其尚未研究出療效較好的治療手段[3]。

松果菊苷(echinacoside,ECH)是從管花肉蓯蓉莖中分離出來的天然化合物,其主要化學成分是苯乙醇苷[4]。通過體內(nèi)外研究其已被證明其具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、提高記憶力與神經(jīng)保護、抗腫瘤、保護肝臟及免疫調(diào)節(jié)等作用[5～7]。既往研究顯示,ECH可以調(diào)節(jié)TGF-β及其下游基因的表達水平,改善db/db小鼠糖尿病腎病的腎纖維化進程[8～11]。本研究使用db/db小鼠作為DCM動物疾病模型,探究松果菊苷如何改善糖尿病心肌病心肌細胞損傷及內(nèi)在機制,以期為糖尿病心肌病的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物:本實驗采用從南京大學南京生物醫(yī)學研究所(中國南京)購買的成年雄性C57BLKS/J db/db小鼠和db/m小鼠(SPF級),編號:SCXK(蘇)2015-0001。動物分籠飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心標準飼養(yǎng)間,室溫20℃,相對濕度50%～60%, 24h光照晝夜循環(huán),適應性喂養(yǎng)1周,不給予任何降糖藥物。實驗程序經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院實驗動物倫理學委員會批準(倫理學審批號:20190517)。

2.儀器與試劑:ECH(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,批號:150623)、RT-PCR轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司,批號:11141ES10);SH-520型成像系統(tǒng)(Q-IMAGING公司);RT-q PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司);DYY7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠);電子天平(METTER TOLEDO公司);二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司,批號:10023418);DAPI染液(武漢阿斯本生物技術有限公司,批號:AS1075);全自動顯微鏡BX63(日本Olympus公司);TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司,批號:15596-026);抗熒光淬滅封片劑(武漢阿斯本生物技術有限公司,批號:AS1089);實時熒光定量PCR檢測儀(7500序列檢測系統(tǒng))(美國ABI公司);TUNEL試劑盒(美國Roche公司,批號:11684817910);Biomek 4000 Automated Workstation基因擴增儀(美國ABI公司)。

3.分組及給藥:將29只SPF級6周齡雄性db/db小鼠和db/m小鼠適應性飼養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表法將db/db小鼠分為糖尿病心肌病組(db/db組,n=10)與松果菊苷干預組(db/db+ECH組,n=10),取9只db/m小鼠作為正常對照組(db/m組,n=9)。其中db/db組和db/m組每日按照0.05ml/10g標準行0.9%氯化鈉溶液灌胃10周。db/db+ECH組小鼠按松果菊苷300mg/(kg·d)灌胃10周。每周監(jiān)測3組小鼠體質(zhì)量和血糖,觀察小鼠攝食、飲水及活動情況。于第10周末用2%戊巴比妥鈉0.1ml/10g腹腔注射麻醉小鼠并處死。毛細血管針眶后采血,分離血清后全自動生化檢測儀檢測血脂水平。心臟灌注后進行組織分離,稱取心臟濕重。取少量左心室心肌組織采用4%多聚甲醛固定后,用于心肌組織切片染色觀察病理形態(tài)。其余心臟組織置于液氮中1h后,-80℃冰箱保存,用于RT-PCR和Western blot法檢測p53/p38MAPK信號通路相關因子的mRNA和蛋白的表達水平。

4.心臟組織切片TUNEL染色心肌細胞凋亡水平:通過TUNEL試劑盒能夠測試心肌細胞凋亡水平。當細胞進入凋亡晚期階段時,細胞核DNA出現(xiàn)斷裂,受末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化影響,3′-OH暴露部分在熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)作用下,以此達到借助熒光顯微鏡來檢測細胞凋亡水平的目的。將心肌組織切片放入二甲苯洗兩次,每次5min;用無水乙醇洗兩次,每次3min;用95%和75%乙醇各洗1次,每次3min;PBS沖洗5min后加入蛋白酶K溶液(20μg/ml),室溫下水解15min;蒸餾水洗4次,每次2min;色缸中加入含2%過氧化氫的PBS,于室溫下反應5min;然后用PBS洗兩次,每次5min;濾紙吸去多余液體后,于切片上滴加TdT酶緩沖液,置于室溫下5min;濾紙吸去多余液體后,于切片上滴加54μl TdT酶反應液,置于濕盒中于37℃反應1h;切片置于染色缸中,加入預熱的37℃的洗滌與終止反應緩沖液,保溫30min,每10min輕輕晃動切片1次;組織切片用PBS沖洗3次,每次5min,直接在切片上滴入抗熒光淬滅封片劑后封片,觀察并拍照統(tǒng)計凋亡率。

5.HE染色觀察心肌組織病理改變:取適量心臟組織塊,用PBS沖洗后,放入4%多聚甲醛緩沖液固定12～24h。將心臟組織依次放入石蠟Ⅰ 1h,石蠟Ⅱ 2h包埋;包埋后適當修剪,用切片機切成4μm的石蠟帶,將組織石蠟塊放入石蠟切片置于烘箱中60℃烤1～2h;石蠟切片常規(guī)二甲苯,乙醇脫蠟至水;之后用蘇木精染10min,流水沖洗,去余色。以0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘,流水沖洗,切片變藍約15min;乙醇梯度(70%、80%、95%到無水乙醇)脫水,二甲苯透明;最后中性樹脂封片,晾干后置于顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

6.Western blot法測定小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達水平:每組小鼠取50mg的心臟組織,組織剪取細小心肌組織碎片,并添入蛋白裂解液混勻,在此基礎上注加與之相符的1mmol/L的PMSF抑制組織蛋白降解20min;1200r/min進行離心10min,吸取上清液,并采取BCA法獲取蛋白濃度。在1∶1的配平標準下,混合蛋白樣品和SDS-PAGE上樣緩沖液(2×),沸水浴變性10min,取50μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,并濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上,之后取5%脫脂牛奶搖床封閉1h,在注入(1∶800)的一抗稀釋液后,4℃搖床過夜。洗膜后,注入(1∶5000)的兔抗兔二抗稀釋液,在室溫狀態(tài)下孵化1h,完成洗膜后掃膜顯色,對各組條帶蛋白進行灰度值分析。

7.RT-qPCR檢測小鼠心臟組織中p53、p38MAPK mRNA和caspase-3mRNA、Bcl-2/Bax mRNA的表達水平:從各組小鼠內(nèi)取出100mg的心臟組織,采取Trizol法提出總RNA,采用基因擴增儀經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA后,在所有樣本中添加3個復孔。在95℃的基礎上,維持30s的預變性,并采取以下40個循環(huán)的擴增:PCR反應中,在95℃維持5s,在60℃維持40s;溶解過程中,在95℃維持15s,在60℃維持60s,在95℃維持15s。選擇管家基因GAPDH進行參照比對,利用ABI7500軟件2-ΔΔct法完成處理過程,引物序列參照表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

結(jié) 果

1.小鼠的一般情況及ECH對小鼠體質(zhì)量、心臟濕重、血糖的影響:db/m組小鼠攝食與飲水正常,較活躍,皮毛光滑。db/db組小鼠在實驗過程中出現(xiàn)多飲、多尿、多食,少動等現(xiàn)象。db/db+ECH組小鼠的上訴癥狀有所緩解。實驗過程中,db/db組小鼠和db/db+ECH組小鼠空腹血糖持續(xù)升高,而db/m組血糖水平保持穩(wěn)定。相較于db/db組小鼠,db/db+ECH組小鼠空腹血糖水平顯著下降(P<0.01)。這表明, ECH對db/db小鼠高血糖狀態(tài)具有改善作用。db/db組心臟濕重較db/m組明顯減輕(1.627±0.063g vs 1.982±0.076g,P<0.01);而與db/db組小鼠比較,db/db+ECH組小鼠心臟濕重顯著增加(1.749±0.070g vs 1.627±0.063g,P<0.05)。相較于db/m組小鼠,db/db組小鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01),且表現(xiàn)出明顯的肥胖癥狀;而經(jīng)過10周的ECH干預治療后,db/db小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05),證明ECH對db/db小鼠心臟功能和肥胖癥狀具有改善作用(表2)。

表2 松果菊苷對各組小鼠血糖水平、心臟濕重、體質(zhì)量的影響

2.ECH對小鼠血脂水平及心臟功能的影響:db/db組和db/m組進行比較,小鼠血清甘油三酯(triglyceride,TG),天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)水平都顯著增加(P<0.01);db/db+ECH組與db/m組進行比較,上述指標都顯著降低(P<0.01,表3)。

表3 菊苷對db/db小鼠血清ALT、AST、TG水平的影響

3.ECH對小鼠心臟形態(tài)學的影響:HE染色顯示,db/m組心臟正常,心肌細胞排列清晰致密,結(jié)構(gòu)清晰,細胞外基質(zhì)及纖維組織少。而db/db組心肌細胞明顯肥大壞死,心肌細胞排列紊亂,細胞外基質(zhì)沉積較少。與db/db組比較,db/db+ECH組心肌細胞形態(tài)顯著改善,細胞間隙縮小,排列規(guī)則,細胞外基質(zhì)沉積改善(圖1)。

圖1 各組小鼠心肌細胞HE、TUNEL染色圖(×200)

4.ECH對小鼠心肌細胞凋亡率的影響:采用TUNEL染色檢測各組細胞凋亡率。結(jié)果表明,與db/m組比較,db/db組心肌細胞總凋亡率明顯升高(1.861%±0.494% vs 31.661%±2.889%,P<0.01)。與db/db組比較,db/db+ECH組心肌細胞的凋亡率明顯降低(31.661%±2.889% vs 8.351%±1.133%,P<0.01),說明ECH可以顯著降低db/db心肌細胞的凋亡率(圖1)。

5.ECH對小鼠心臟組織p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達的影響:實驗結(jié)果顯示,較db/m組,db/db組小鼠心肌細胞p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達水平明顯升高(P<0.01);與db/db組比較,db/db+ECH組蛋白表達水平顯著降低(P<0.01,表4)。

表4 各組細胞caspase-8、p53、caspase-3、p38MAPK和內(nèi)參β-actin的灰度比

6.ECH對小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表達水平的影響:實驗結(jié)果顯示,較db/m組,db/db組小鼠心肌細胞p53、p38MAPK、caspase-3mRNA水平明顯升高,Bcl-2/Bax水平降低(P<0.01);經(jīng)ECH干預后,db/db+ECH組相關mRNA水平較db/db組顯著改善(P<0.01,表5)。

表5 各組caspase-3、p38MAPK、p53、Bcl-2/Bax mRNA相對量

討 論

糖尿病作為一種常見的慢性代謝紊亂癥,被認為是一種心血管疾病而非碳水化合物的代謝紊亂[12, 13]。不斷有實驗研究和臨床證據(jù)表明,糖尿病心肌病心肌功能不全與心肌細胞凋亡引起的心肌損傷密切相關[14]。本研究中實驗動物db/db小鼠是由于瘦素受體基因異常剪接產(chǎn)生突變而具有明顯的高血糖、高血脂、高胰島素血癥等2型糖尿病特征,并且可以維持較為穩(wěn)定的高血糖狀態(tài),是糖尿病心肌病的常用造模對象[15]。

本實驗通過對db/db小鼠進行ECH灌胃治療,觀察ECH對糖尿病小鼠心臟損傷的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)ECH治療后,db/db組小鼠體質(zhì)量、血清葡萄糖水平亦有所降低(表2),證明ECH對db/db糖尿病小鼠糖尿病癥狀有改善作用。能量代謝紊亂作為糖尿病心肌病的重要發(fā)病機制之一,參與了糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展[16, 17]。ALT、AST和TG雖常用來檢測肝臟代謝指標,但研究發(fā)現(xiàn),其在心肌細胞損傷過程中,上述物質(zhì)釋放入血,血清水平會有所增高,并且血清TG水平增高的病理改變能夠加重糖尿病心肌病心肌脂質(zhì)沉積,進一步加速DCM的惡化[18, 19]。通過檢測血清中ALT、AST和TG水平,筆者發(fā)現(xiàn)與db/m組比較,db/db組上述指標均明顯升高,而ECH能夠抑制血清ALT、AST和TG水平的升高趨勢(表3)。

研究證實,高糖培養(yǎng)24h的H9c2心肌細胞,p-p38MAPK表達增加,凋亡細胞增加,活性氧增加,以及線粒體膜電位下降[20]。高糖、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、氧化應激等因素可通過p38MAPK通路引起細胞凋亡,機制可能與p53、Bax、Bcl-2、氧化應激等有關[21]。本研究中db/db小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3蛋白表達水平較db/m組明顯升高(表5)。在db/db+ECH組小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3水平較db/db組顯著升高,Bcl-2/Bax mRNA水平顯著降低(表6),說明在糖尿病小鼠中p53/p38MAPK通路的激活,促進p38MAPK磷酸化從而激活下游相關凋亡蛋白caspase家族,上調(diào)caspase-3和caspase-8表達水平,啟動細胞凋亡級聯(lián)反應,抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達,上調(diào)促凋亡基因Bax的表達,最終導致心肌細胞凋亡;而經(jīng)ECH灌胃處理后,db/db小鼠能夠明顯抑制p53/p38MAPK通路的激活,影響db/db小鼠的心肌細胞凋亡進程,并通過調(diào)節(jié)細胞凋亡通路關鍵蛋白的表達來保護心臟功能,這一點與HE染色及TUNEL染色觀察到的心臟組織形態(tài)學改變一致。

綜上所述,本研究表明在db/db小鼠心臟組織中心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展的重要病理機制,ECH能夠保護db/db小鼠的心臟功能,其機制可能與抑制p53/p38MAPK/caspase信號通路,調(diào)節(jié)相關蛋白的表達從而改善心肌凋亡有關。