VSD聯(lián)合羥基積雪草苷促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合和血管生成的機制研究

李凡 曾黎 劉朝東 唐悅

[摘要]目的：探究負(fù)壓封閉引流（Vacuum sealing drainage，VSD）聯(lián)合羥基積雪草苷促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成的作用及機制。方法：以不同劑量羥基積雪草苷處理慢性創(chuàng)面模型大鼠進(jìn)行預(yù)實驗，通過檢測創(chuàng)面愈合時間篩選羥基積雪草苷最佳作用劑量。將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、羥基積雪草苷組、VSD組、羥基積雪草苷+VSD組、ML385組、羥基積雪草苷+VSD+ML385組，每組10只，除對照組外其余各組大鼠構(gòu)建慢性創(chuàng)面模型，以藥物分組處理后，檢測各組大鼠創(chuàng)面愈合率及微循環(huán)血流灌注值（Microcirculation perfusion value，MPD）；免疫組織化學(xué)染色檢測各組大鼠創(chuàng)面微血管密度（Microvessel density，MVD）；酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、促血管生成素1（Angiopoietin 1，Ang1）及創(chuàng)面組織活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）水平；免疫印跡檢測各組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1與Nrf2/血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）通路蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面MPD及MVD、血清VEGF及Ang1、創(chuàng)面組織VEGF及Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，羥基積雪草苷組、VSD組、羥基積雪草苷+VSD組大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD及MVD、血清VEGF及Ang1、創(chuàng)面組織VEGF及Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平降低（P＜0.05），且羥基積雪草苷和VSD聯(lián)合應(yīng)用作用比單獨應(yīng)用更強；ML385組各指標(biāo)變化與羥基積雪草苷+VSD組相反，且ML385可逆轉(zhuǎn)羥基積雪草苷和VSD聯(lián)合應(yīng)用對模型大鼠各指標(biāo)變化的作用。結(jié)論：VSD和羥基積雪草苷兩者聯(lián)合可協(xié)同上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成。

[關(guān)鍵詞]負(fù)壓封閉引流；羥基積雪草苷；核因子E2相關(guān)因子2；慢性創(chuàng)面；愈合；血管生成

[中圖分類號]R751.05? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）09-0048-06

Mechanism of VSD Combined with Madecassoside in Promoting Chronic Wound Healing and Angiogenesis

LI Fan，ZENG Li，LIU Chaodong，TANG Yue

（Department of Plastic Surgery and Burn Repair Surgery，West China Guang'an Hospital，Sichuan University，Guang’an 638000，Sichuan，China）

Abstract： Objective? To explore the effects and mechanism of vacuum sealing drainage （VSD） combined with madecassoside in promoting slow wound healing and angiogenesis. Methods? Treatment of chronic wound model rats with different doses of madecassoside and screening of the optimal dosage of madecassoside by detecting wound healing time. The rats in each group were constructed with chronic wounds models， and after grouping with drugs， the wound healing time of the rats in each group was detected. SD rats were randomly grouped into control group， model group， madecassoside group， VSD group， madecassoside+VSD group， ML385 group， and madecassoside+VSD+ML385 group， 10 rats in each group. Except for the control group， the rats in the other groups were constructed with chronic wound models， and after grouping with drugs， the wound healing rate and the microcirculation perfusion value （MPD） of the rats in each group were detected， immunohistochemical staining was used to detect wound microvessel density （MVD） of rats in each group， the microplate reader was used to detect the levels of endothelial cell growth factor （VEGF）， angiopoietin 1 （Ang1） in serum， and reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， and interleukin-6 （IL-6） in wound tissue in each group， and Western blot was used to detect the expressions of VEGF， Ang1 and Nrf2/HO-1 pathway proteins in wound tissue of rats in each group. Results? Compared with the control group， the expressions of MPD and MVD in the wound tissue， the levels of VEGF and Ang1 in serum， the protein expressions of VEGF and Ang1， Nrf2， and HO-1 in the wound tissue of the rats in the model group were decreased （P＜0.05）， the levels of ROS， MDA， COX-2 and IL-6 in the wound tissue were obviously increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the wound healing rate， MPD and MVD， the levels of VEGF and Ang1 in serum， the protein expressions of VEGF and Ang1， Nrf2， and HO-1 in the wound tissue in the madecassoside group， VSD group， and madecassoside+VSD group were obviously increased （P＜0.05）， and the effect of combined application of hydroxyasiaticoside and VSD was stronger than that of single application， The change of each index in ML385 group was opposite to that in hydroxyasiaticoside + VSD group， and ML385 could reverse the effect of hydroxyasiaticoside and VSD combined application on the change of each index in model rats. Conclusion? The combination of VSD and madecassoside can synergistically up-regulate the expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway protein， thereby promoting the repair and healing of chronic wounds and angiogenesis.

Key words： vacuum sealing drainage; madecassoside; Nuclear factor erythroid-2 related factor 2; chronic wounds; healing; angiogenesis

慢性創(chuàng)面是慢性難愈合創(chuàng)面的簡稱，作為外科常見疾病，治療難度大、周期長且花費高，給患者造成巨大的負(fù)擔(dān)和痛苦[1-2]。創(chuàng)面愈合涉及感染、炎癥、細(xì)胞運動、氧化應(yīng)激和血管生成等生物學(xué)現(xiàn)象，通過減弱炎癥和氧化應(yīng)激、增強血管新生可促使創(chuàng)面進(jìn)入促愈合的微環(huán)境，加快其修復(fù)愈合[3-4]。核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是重要的抗氧化因子，可增強HO-1表達(dá)，減少ROS的產(chǎn)生，抑制炎癥和氧化應(yīng)激，促進(jìn)血管生成，加快糖尿病傷口愈合[5-6]，過表達(dá)Nrf2能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和血管生成，加速全層切除傷口的動物模型創(chuàng)面收縮及修復(fù)愈合[7]，因而激活Nrf2/HO-1信號是促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成的有潛力的治療手段。VSD是一種廣泛應(yīng)用于各種急慢性復(fù)雜傷口處理的技術(shù)，有助于傷口早期的血管化，促進(jìn)傷口創(chuàng)面愈合[8-9]；羥基積雪草苷是積雪草中含有的一種三萜皂苷成分，具有廣泛的抗炎、抗?jié)?、抗氧化活性，能修?fù)皮膚損傷及瘢痕、促進(jìn)纖維細(xì)胞再生、加速傷口愈合[10]，還可通過激活Nrf2/HO-1信號減輕過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡[11]，但VSD聯(lián)合羥基積雪草苷是否可通過上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成，目前尚未有明確研究，本文通過構(gòu)建慢性創(chuàng)面大鼠模型，對此問題進(jìn)行探究。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠，雄性，購自華中科技大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2021-0009，體質(zhì)量200～230 g，飼養(yǎng)及實驗操作嚴(yán)格遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》的要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑和儀器：羥基積雪草苷（純度：HPLC≥98%，貨號IM0480）、大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號SEKR-0032）、促血管生成素1（Angiopoietin 1，Ang1）ELISA試劑盒（貨號SEKR-0055）、通用SP免疫組織化學(xué)試劑盒（貨號SP0041）、ROS檢測試劑盒（貨號CA1410）、大鼠環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）ELISA試劑盒（貨號SEKR-0075）購自北京索萊寶生物科技有限公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號ab118970）、大鼠白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（貨號ab234570）、兔源抗大鼠Ang1一抗（貨號ab183701）、兔源抗大鼠CD34一抗（貨號ab81289）、HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗（貨號ab6721）、兔源抗大鼠HO-1一抗（貨號ab68477）購自Abcam公司；兔源抗大鼠Nrf2一抗（貨號AF7623）、兔源抗大鼠VEGF一抗（貨號AF8325）、RIPA裂解液（貨號P0013K）、兔源抗大鼠β-actin一抗（貨號AF5003）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。激光多普勒血液灌流成像儀—型號LISCA，購自Perimed公司（瑞典）；旋轉(zhuǎn)石蠟切片機—型號CUT 4050，購自Leica公司（德國）；實驗室光學(xué)顯微鏡—型號Panthera TEC POL，購自Motic公司（加拿大）；全波長酶標(biāo)儀—型號Uquant，購自biotek公司（美國）；垂直電泳槽、電泳儀電源、轉(zhuǎn)膜槽—型號Tetra Systerm、PowerPac Basic 1645050、Power PacBasic，購自Bio-Rad公司（美國）等。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組

1.3.1.1 預(yù)實驗構(gòu)建大鼠慢性創(chuàng)面模型及分組處理：參照文獻(xiàn)[12]構(gòu)建大鼠慢性創(chuàng)面模型，將25只SD大鼠隨機分為模型對照組、羥基積雪草苷低劑量組、羥基積雪草苷中劑量組、羥基積雪草苷高劑量組、羥基積雪草苷高劑量+ML385（Nrf2抑制劑）組，每組5只。于大鼠腹腔內(nèi)注入3 ml/kg的3%戊巴比妥鈉溶液，麻醉后脫去大鼠背部毛發(fā)，消毒備皮，于脊柱兩側(cè)各做一個直徑1.5 cm的圓形標(biāo)記，然后沿標(biāo)記于無菌條件下創(chuàng)建深達(dá)筋膜層的全層皮膚缺損創(chuàng)面，接著立即肌肉注射80 mg/kg的醋酸氫化可的松注射液1次，致使形成慢性難愈合創(chuàng)面。造模后24 h開始給藥，羥基積雪草苷低劑量組、羥基積雪草苷中劑量組、羥基積雪草苷高劑量組大鼠分別腹腔注射25、50、100 mg/kg的羥基積雪草苷（2.5、5、10 mg/ml的羥基積雪草苷溶液各10 ml/kg）[13]；羥基積雪草苷高劑量+ML385組大鼠腹腔注射100 mg/kg的羥基積雪草苷和30 mg/kg的ML385（10 mg/ml的羥基積雪草苷與3 mg/ml的ML385混合溶液10 ml/kg）[14]；模型對照組大鼠腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水，各組大鼠給藥的同時以無菌紗布覆蓋創(chuàng)面（隔1天換1次紗布），每天給藥1次，共給藥7 d，然后繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠直至創(chuàng)面愈合，觀察記錄各組大鼠創(chuàng)面愈合時間。

1.3.1.2 構(gòu)建大鼠慢性創(chuàng)面模型及分組處理：取70只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、羥基積雪草苷組、VSD組、羥基積雪草苷+VSD組、ML385組、羥基積雪草苷+VSD+ML385組，每組10只，除對照組外其余各組大鼠參照上述方法構(gòu)建慢性創(chuàng)面模型，對照組大鼠只脫毛備皮后做圓形標(biāo)記，不做其他處理，造模后24 h開始分組處理。羥基積雪草苷組大鼠腹腔注射100 mg/kg的羥基積雪草苷（10 mg/ml的羥基積雪草苷溶液10 ml/kg）。VSD組大鼠以VSD治療，修剪VSD護(hù)創(chuàng)材料為創(chuàng)面大小覆蓋創(chuàng)面，在護(hù)創(chuàng)材料下置入一個直徑2 mm的輸液器管作引流管，以透明貼膜完全密封護(hù)創(chuàng)材料及創(chuàng)面，然后將引流管連接到負(fù)壓引流裝置，以125 mm Hg的負(fù)壓持續(xù)吸引（8 h/d）[15]，同時腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水；羥基積雪草苷+VSD組大鼠腹腔注射100 mg/kg的羥基積雪草苷，同時進(jìn)行VSD治療；ML385組大鼠腹腔注射30 mg/kg的ML385（3 mg/ml的ML385溶液10 ml/kg）；羥基積雪草苷+VSD+ML385組大鼠腹腔注射100 mg/kg的羥基積雪草苷和30 mg/kg的ML385（10 mg/ml的羥基積雪草苷與3 mg/ml的ML385混合溶液10 ml/kg），同時進(jìn)行VSD治療；對照組和模型組大鼠腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水，另外不進(jìn)行VSD治療的大鼠給藥的同時以無菌紗布覆蓋創(chuàng)面（隔1天換1次紗布），每組大鼠均每天給藥處理1次，共給藥處理7 d。

1.3.2 檢測大鼠創(chuàng)面愈合率及微循環(huán)血流灌注值（Microcirculation perfusion value，MPD）：7組大鼠處理前對創(chuàng)面進(jìn)行拍照，然后于7 d處理結(jié)束后24 h觀察創(chuàng)面愈合情況并再次拍照，采用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)分析圖像，定量各組大鼠創(chuàng)面面積后計算創(chuàng)面愈合率=（1-未愈創(chuàng)面面積/處理前創(chuàng)面面積）×100%。創(chuàng)面MPD運用激光多普勒血液灌流成像儀進(jìn)行測定，打開儀器，設(shè)置參數(shù)為輪廓50像素、掃描寬度64像素、視距12 cm、顯示頻率5 Hz、掃描速度100 ms/Line，每只大鼠各掃描3次取均值。

1.3.3 免疫組織檢測大鼠創(chuàng)面組織微血管密度（Microvessel density，MVD）及標(biāo)本采集：腹腔內(nèi)注射3 ml/kg的3%戊巴比妥鈉溶液麻醉各組大鼠，采集各組大鼠尾靜脈血液，3 000 r/min離心10 min，獲得血清于-80℃保存?zhèn)溆?；斷頭處死大鼠，各處理組大鼠剝下背部創(chuàng)面皮膚組織，對照組大鼠取圓形標(biāo)記處的皮膚，剪下創(chuàng)面皮膚組織各0.8 g于液氮中保存?zhèn)溆茫皇Ｓ鄤?chuàng)面皮膚組織清洗干凈，固定后做常規(guī)脫水、透明處理，置于熱石蠟中包埋，然后將石蠟組織塊固定在旋轉(zhuǎn)切片機中切片，獲得厚約4 μm的切片，每只大鼠選出無損傷的3張切片做常規(guī)脫蠟處理，水化后浸沒入0.3% H2O2處理，漂洗后孵育5%山羊血清進(jìn)行封閉，孵育兔源抗大鼠CD34一抗（稀釋200倍），以通用SP免疫組織化學(xué)試劑盒做免疫組化：孵育二抗（稀釋200倍）、DAB顯色，以實驗室光學(xué)顯微鏡觀察染色情況并采集圖像，通過Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)分析定量任意視野切片面積及血管數(shù)，CD34陽性表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞簇呈現(xiàn)棕色，并將一個CD34陽性表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞簇設(shè)定為1個微血管計數(shù)單位，即可算出MVD，MVD=微血管計數(shù)/切片面積。

1.3.4 檢測大鼠血清VEGF、Ang1及創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平：取出1.3.3中保存在-80℃的血清緩慢解凍后，采用ELISA法測量其中VEGF、Ang1水平，具體步驟參照各自試劑盒說明書中指導(dǎo)進(jìn)行；取出1.2.3中保存在液氮中的創(chuàng)面皮膚組織，加入適量RIPA裂解液研磨勻漿，提取出總蛋白，運用BCA法測出其濃度，然后每組各取出0.4 ml創(chuàng)面組織蛋白樣品液，測量其中ROS、MDA、COX-2、IL-6水平，具體步驟參照各自試劑盒說明書中指導(dǎo)進(jìn)行，剩余創(chuàng)面組織蛋白樣品液保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 免疫印跡檢測大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1與Nrf2/HO-1通路蛋白表達(dá)：取1.3.4中保存在-80℃的創(chuàng)面組織蛋白樣品液緩慢凍融，每組上樣20 μg變性后總蛋白，做SDS-PAGE電泳，通過濕轉(zhuǎn)將分散在SDS-PAGE膠中的蛋白移至硝酸纖維素膜，將其浸沒入脫脂牛奶中，封閉其上總蛋白非特異抗原位點，參照分子量大小將VEGF、Nrf2、Ang1、HO-1、β-actin蛋白裁下，孵育相應(yīng)兔源抗大鼠一抗、HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗，化學(xué)發(fā)光試劑處理顯色后拍照，以Image-Pro plus軟件分析圖像，定量各組蛋白條帶灰度值后，量化其相對表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：本文實驗數(shù)據(jù)運用GraphPad Prism 8.0軟件做統(tǒng)計分析，并使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述，多組間差異比較進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 預(yù)實驗羥基積雪草苷對慢性創(chuàng)面大鼠創(chuàng)面愈合時間的影響：與模型對照組相比，羥基積雪草苷低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合時間降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與羥基積雪草苷高劑量組相比，羥基積雪草苷高劑量+ML385組大鼠創(chuàng)面愈合時間升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組慢性創(chuàng)面大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD及MVD的檢測結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面MPD、MVD降低（P＜0.05）；與模型組相比，羥基積雪草苷組、VSD組、羥基積雪草苷+VSD組大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD、MVD升高（P＜0.05），ML385組大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD、MVD降低（P＜0.05）；與羥基積雪草苷組、VSD組相比，羥基積雪草苷+VSD組大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD、MVD均升高（P＜0.05）；與羥基積雪草苷+VSD組相比，羥基積雪草苷+VSD+ML385組大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD、MVD降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

2.3 各組慢性創(chuàng)面大鼠血清Ang1、VEGF水平及創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平的檢測結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠血清Ang1、VEGF水平明顯降低（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，羥基積雪草苷組、VSD組、羥基積雪草苷+VSD組大鼠血清Ang1、VEGF水平升高（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平降低（P＜0.05）；ML385組大鼠血清Ang1、VEGF水平降低（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平升高（P＜0.05）。與羥基積雪草苷組、VSD組相比，羥基積雪草苷+VSD組大鼠血清Ang1、VEGF水平升高（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平降低（P＜0.05）。與羥基積雪草苷+VSD組相比，羥基積雪草苷+VSD+ML385組大鼠血清Ang1、VEGF水平降低（P＜0.05），創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平升高（P＜0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1與Nrf2/HO-1通路蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，羥基積雪草苷組、VSD組、羥基積雪草苷+VSD組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），ML385組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與羥基積雪草苷組、VSD組相比，羥基積雪草苷+VSD組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與羥基積雪草苷+VSD組相比，羥基積雪草苷+VSD+ML385組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖2、表4。

3? 討論

慢性創(chuàng)面可造成疼痛，不僅嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，還會帶來很大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，長期難以愈合，會有癌變風(fēng)險，根據(jù)目前的醫(yī)療水平，還未找到慢性創(chuàng)面的特效治療藥物，因此探尋新型的治療策略具有積極臨床意義[1-2]。VSD是處理各種急慢性復(fù)雜傷口的一種技術(shù)，使用聚乙烯醇覆蓋傷口，在其上覆一層聚氨酯，兩者之間插入連接負(fù)壓吸引裝置的引流管，并以醫(yī)用貼膜封閉，具有良好的促創(chuàng)面修復(fù)愈合的效果[8-9，16]，可促進(jìn)創(chuàng)面組織肉芽組織再生和再上皮化，提高Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，提升創(chuàng)面的抗拉伸強度，加快創(chuàng)面的修復(fù)愈合[15]。羥基積雪草苷是提取自積雪草的積雪草總苷中的一種，可消炎抗菌、抑氧化，具有修復(fù)皮膚損傷、潰瘍及瘢痕的功能，研究顯示，含有羥基積雪草苷的積雪苷霜軟膏可治療女性外陰硬化萎縮性苔蘚，減輕皮膚損傷，復(fù)方積雪草凝膠貼劑可促進(jìn)瘢痕愈合[17-18]，但VSD聯(lián)合羥基積雪草苷是否可協(xié)調(diào)促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成，目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，以不同劑量羥基積雪草苷處理慢性創(chuàng)面模型大鼠，可降低其創(chuàng)面愈合時間，且呈劑量依賴性，表明羥基積雪草苷可呈劑量依賴性地加速慢性創(chuàng)面愈合。VSD治療或羥基積雪草苷處理慢性創(chuàng)面模型大鼠，均可升高大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD及MVD、血清VEGF及Ang1、創(chuàng)面組織VEGF及Ang1蛋白表達(dá)，降低創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平，兩者聯(lián)合對上述指標(biāo)的作用更強，表明VSD治療和羥基積雪草苷均可減少ROS和炎癥因子，降低脂質(zhì)過氧化水平，減輕炎癥和氧化應(yīng)激，增強促血管生成因子表達(dá)及血管生成，改善創(chuàng)面血流微循環(huán)，加快創(chuàng)面修復(fù)愈合，兩者聯(lián)合具有協(xié)同作用，可增強各自的促慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成的作用。

Nrf2/HO-1是調(diào)控組織細(xì)胞ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化的主要信號，上調(diào)該信號蛋白表達(dá)可顯著降低ROS水平，增加內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，減輕其功能損傷，阻止炎癥與脂質(zhì)過氧化損傷，增強創(chuàng)面血管化及上皮化，促進(jìn)糖尿病傷口愈合[6，19-20]，因而推測激活Nrf2/HO-1信號可能是VSD聯(lián)合羥基積雪草苷促進(jìn)機制。本研究結(jié)果顯示，以Nrf2抑制劑處理慢性創(chuàng)面模型大鼠，可降低大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD及MVD、血清VEGF及Ang1、創(chuàng)面組織VEGF及Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，升高創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平，且VSD治療或羥基積雪草苷處理慢性創(chuàng)面模型大鼠，均可升高大鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，兩者聯(lián)合對Nrf2與HO-1蛋白表達(dá)的上調(diào)作用更強，表明抑制Nrf2信號可加重炎癥和脂質(zhì)過氧化，抑制慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成，Nrf2/HO-1信號參與介導(dǎo)VSD聯(lián)合羥基積雪草苷促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成的過程。VSD治療同時以羥基積雪草苷和ML385聯(lián)合處理慢性創(chuàng)面模型大鼠，相比VSD治療同時以羥基積雪草苷處理，可降低大鼠創(chuàng)面愈合率、MPD及MVD、血清VEGF及Ang1、創(chuàng)面組織VEGF及Ang1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，升高創(chuàng)面組織ROS、MDA、COX-2、IL-6水平，表明ML385可減輕VSD聯(lián)合羥基積雪草苷的抗炎和抗脂質(zhì)過氧化作用，減弱其對慢性創(chuàng)面大鼠創(chuàng)面血管生成的促進(jìn)及微血管血液循環(huán)的改善作用，最終逆轉(zhuǎn)VSD聯(lián)合羥基積雪草苷治療的促慢性創(chuàng)面創(chuàng)面修復(fù)愈合作用，揭示VSD聯(lián)合羥基積雪草苷協(xié)同促進(jìn)慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合和血管生成是通過激活Nrf2信號實現(xiàn)的。

綜上所述，VSD治療和羥基積雪草苷均可上調(diào)Nrf2/HO-1通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥，減少ROS產(chǎn)生，阻止脂質(zhì)過氧化損傷，增強血管生成，改善創(chuàng)面微血管血液循環(huán)，促使創(chuàng)面修復(fù)愈合，兩者聯(lián)合可起到協(xié)同作用，激活Nrf2/HO-1信號可能是其作用機制之一，本研究為慢性創(chuàng)面創(chuàng)面的修復(fù)愈合提供了新型治療手段，對于縮短慢性創(chuàng)面患者創(chuàng)面愈合時間做出了一定貢獻(xiàn)，但關(guān)于其作用機制的研究還不夠詳細(xì)全面，存在一定不足，后續(xù)會進(jìn)一步探究VSD聯(lián)合羥基積雪草苷調(diào)控Nrf2下游更具體清晰的分子機制。

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[收稿日期]2022-07-21

本文引用格式：李凡，曾黎，劉朝東，等.VSD聯(lián)合羥基積雪草苷促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合和血管生成的機制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（9）：48-53.