腐乳酸漿水中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶乳酸菌的研究

張佳萍 夏寧 滕建文 韋保耀 黃麗 張博

摘要：桂林腐乳酸漿水是桂林腐乳制作過(guò)程中的凝固劑，其富含的微生物賦予了腐乳特有的品質(zhì)。而桂林腐乳酸漿水中乳酸菌的種類及其具有的優(yōu)良功能活性尚不清晰。該研究從酸漿水中篩選出10株乳酸菌，其中5株具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力。經(jīng)生理生化和16S rRNA鑒定，a1、a3、a7和b16為利莫西發(fā)酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum），b8為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）。b8展現(xiàn)出最高的β-葡萄糖苷酶活力（發(fā)酵6 h時(shí)為（41.22±0.47） U/105 CFU），生長(zhǎng)活力和產(chǎn)酸能力也顯著高于其余4株產(chǎn)酶乳酸菌（P<0.05）。此外，德氏乳桿菌b8在培養(yǎng)12 h時(shí)的DPPH、ABTS自由基清除率分別為（16.29±2.22）%、（51.02±2.43）%。綜上，德氏乳桿菌b8具有較好的功能活性和生長(zhǎng)活力，該研究既豐富了對(duì)桂林腐乳酸漿水中乳酸菌的認(rèn)識(shí)，又為豆制品行業(yè)提供了潛在的功能性發(fā)酵菌株。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；桂林腐乳；β-葡萄糖苷酶；產(chǎn)酸能力；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS214.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2023）10-0027-06

Study on β-Glucosidase-Producing Lactic Acid Bacteria in Sour Slurry of Sufu

ZHANG Jia-ping， XIA Ning， TENG Jian-wen*， WEI Bao-yao， HUANG Li， ZHANG Bo

（College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China）

Abstract： Sour slurry of Guilin sufu is a coagulant in the production process of Guilin sufu.The microorganisms rich in it give unique quality to sufu. However， the types of lactic acid bacteria in the sour slurry of Guilin sufu and their excellent functional activities are still not clear. In this study， ten strains of lactic acid bacteria are screened out from sour slurry， among which， five strains have the capacity to produce β-glucosidase. After physiological， biochemical and 16S rRNA identification， a1， a3， a7 and b16 are Limosilactobacillus fermentum， and b8 is Lactobacillus delbrueckii. b8 shows the highest β-glucosidase activity （（41.22±0.47） U/105 CFU at 6 hours of fermentation）， and the growth activity and acid-producing capacity are significantly higher than those of the other four strains of lactic acid bacteria （P<0.05）. In addition， at 12 hours' culture， the scavenging rates of Lactobacillus delbrueckii b8 on DPPH and ABTS radicals are （16.29±2.22）%， （51.02±2.43）% respectively. In conclusion， Lactobacillus delbrueckii b8 has good functional activity and growth activity. This study has not only enriched the understanding of lactic acid bacteria in sour slurry of Guilin sufu， but also provided potential functional fermentation strains for the soybean product industry.

Key words： lactic acid bacteria; Guilin sufu; β-glucosidase; acid-producing capacity; antioxidant activity

桂林腐乳作為“桂林三寶”之一，以質(zhì)地細(xì)膩、氣香味鮮、風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn)被消費(fèi)者所喜愛(ài)[1]。豆腐凝固過(guò)程中析出的黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵1～2 d后形成酸漿水[2]，在腐乳后續(xù)生產(chǎn)中作為凝固劑添加。酸漿水中豐富的微生物參與腐乳發(fā)酵的全過(guò)程，并賦予其誘人的香味和細(xì)膩的口感。其中，乳酸菌作為腐乳酸漿水中的主要微生物，對(duì)腐乳的風(fēng)味、功能活性等的形成起到了重大作用[3-5]，故分離鑒定酸漿水中的乳酸菌有利于桂林腐乳的工業(yè)化生產(chǎn)。

此外，發(fā)酵豆制品（如腐乳、豆醬、豆豉）含有與大豆酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化相關(guān)的微生物[6]，有利于結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)從食品基質(zhì)中游離[7]，進(jìn)而提高產(chǎn)品的功能活性。大豆異黃酮是主要的大豆酚類物質(zhì)[8]，但天然大豆中約97%～98%的異黃酮以不易直接被人體吸收的結(jié)合型糖苷形式存在[9]，糖苷需被水解成游離型苷元后才可被人體吸收和利用。β-葡萄糖苷酶是水解大豆異黃酮糖苷的關(guān)鍵酶，已有學(xué)者從柿子醋醪[10]、寧夏漿水[11]和牛初乳[12]中分離出具有β-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌，如植物乳桿菌R3[10]、植物乳桿菌YHG1-155[11]和植物乳桿菌LSP-16[12]等。但腐乳酸漿水中是否存在該種活性乳酸菌及活力大小均尚未可知。

本研究以桂林腐乳酸漿水為材料，利用特定培養(yǎng)基篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，并評(píng)估其生長(zhǎng)活力、產(chǎn)酸和抗氧化能力，為腐乳中乳酸菌的開(kāi)發(fā)和利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 主要培養(yǎng)基及試劑

MRS液體培養(yǎng)基[13]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、七水硫酸鎂0.58 g、四水合硫酸錳0.25 g、乙酸鈉2 g、蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基添加17 g/L瓊脂后滅菌。

碳酸鈣固體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基添加20 g/L碳酸鈣后滅菌。

七葉苷顯色培養(yǎng)基[14]：MRS固體培養(yǎng)基添加0.5%的七葉苷和0.025%的檸檬酸鐵。

主要試劑：4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷（p-NPG）、七葉苷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)硝基苯酚（p-NP），購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑有限公司；生理生化試劑盒，購(gòu)自青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 瑞士Mettler Toledo集團(tuán)；超凈操作工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司；滅菌鍋 上海申安醫(yī)療儀器廠；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超聲波破碎儀 賽飛（中國(guó)）有限公司。

1.3 樣品及其來(lái)源

腐乳酸漿水為2018年4月22日取自廣西桂林市臨桂區(qū)四方井、桂清泉兩家腐乳廠自然發(fā)酵1 d后的黃漿水。樣品使用PET瓶盛裝，將瓶蓋扎孔以透氣，于低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃下保存，并在12 h內(nèi)分離微生物。

1.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶乳酸菌的分離與初篩

取5 mL腐乳酸漿水于裝有45 mL無(wú)菌水的無(wú)菌三角瓶中，混勻后進(jìn)行梯度稀釋，涂布于碳酸鈣固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫下厭氧培養(yǎng)48 h。挑選產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，將純化后的單菌落接種于七葉苷顯色培養(yǎng)基上，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，若菌落周圍出現(xiàn)明顯棕黑色物質(zhì)，則該微生物疑似可產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶；若無(wú)顯色反應(yīng)，則該微生物不產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶。

1.5 無(wú)細(xì)胞提取物的獲得

參考vila等[15]的方法并稍作修改。挑取純化后的乳酸菌單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔3 h取樣測(cè)定。將菌懸液離心（8 000 g，4 ℃，10 min），棄去上清液，用磷酸鈉緩沖液（0.5 mol/L，pH 6.5）洗滌沉淀2次后，重懸于上述緩沖液中。調(diào)節(jié)OD600 nm至0.5（菌落密度約為105 CFU/mL），加入1 mL溶菌酶（3 mg/mL），于37 ℃下孵育30 min，在細(xì)胞破碎儀中低溫（冰浴）超聲破碎（超聲時(shí)間2 s，間歇3 s，45 W，15 min），得到破碎液。于8 000 g、4 ℃下離心10 min，上清液即為無(wú)細(xì)胞提取物（粗酶液），用于β-葡萄糖苷酶活力、抗氧化活性的測(cè)定。

1.6 β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定

參考前人的研究方法[15-17]并稍作改動(dòng)，向100 μL無(wú)細(xì)胞提取物中加入900 μL磷酸鈉緩沖液（0.5 mol/L，pH 6.5），在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入1 mL 5 mmol/L p-NPG（已預(yù)熱），于37 ℃精確反應(yīng)30 min，立即加入1 mL 1 mol/L碳酸鈉（4 ℃）終止反應(yīng)，室溫下放置5 min，在400 nm處測(cè)定吸光度。以100 ℃滅活30 min的粗酶液、磷酸鈉緩沖液作對(duì)照。結(jié)果以1 mL菌落密度約為105 CFU/mL的粗酶液在37 ℃、pH 6.5反應(yīng)條件下每分鐘酶解p-NPG產(chǎn)生1 μmol p-NP的能力表示（U/105 CFU）。

1.7 抗氧化活性的測(cè)定

根據(jù)覃超等[18]的方法測(cè)定無(wú)細(xì)胞提取物的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。

1.8 菌株的生長(zhǎng)曲線及其產(chǎn)酸能力

參考徐佳敏等[19]的方法，將菌株活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，每3 h取樣測(cè)定pH和OD600 nm值。

1.9 生理生化及分子生物學(xué)鑒定

1.9.1 生理生化鑒定

根據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[20]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]對(duì)菌株的種屬進(jìn)行鑒定。

1.9.2 分子生物學(xué)鑒定

參照黃紫衡等[22]的方法對(duì)菌株的DNA進(jìn)行提取與擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel與Origin 2023進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與畫(huà)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶乳酸菌的篩選與鑒定

從桂林腐乳酸漿水中篩選出10株具有溶鈣圈的菌株（見(jiàn)表1），通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察與生理生化實(shí)驗(yàn)判定均為乳酸菌。經(jīng)七葉苷顯色培養(yǎng)基篩選（見(jiàn)圖1），發(fā)現(xiàn)5株菌株疑似產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，分別為a1、a3、a7、b8、b16。結(jié)合5株菌的生理生化結(jié)果（見(jiàn)表2），初步鑒定b8為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii），其余4株為利莫西發(fā)酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）。

圖2分子生物學(xué)結(jié)果顯示，a1、b16與Limosilactobacillus fermentum strain TMPC 46B23的親緣關(guān)系相近（相似性為100%），菌株a3、a7與Limosilactobacillus fermentum strain MSJK0025的親緣關(guān)系相近（相似性為100%），菌株b8與Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain IMAU92033的親緣關(guān)系相近（相似性為100%）。

酸漿水為自然發(fā)酵方式制備的，因此其中乳酸菌的組成極易受到環(huán)境影響。張斌[23]從廣靈縣酸漿水中分離出了27株乳明串珠菌、13株德氏乳桿菌和26株植物乳桿菌。費(fèi)永濤[24]從廣東省開(kāi)平市腐乳廠的酸漿水中篩選得到1株具有α-半乳糖苷酶活性的解淀粉乳桿菌L6。葉青[25]從江蘇如皋搬經(jīng)鎮(zhèn)和山東臨沂采集的酸漿水中分離得到了產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的羅氏乳桿菌045、戊糖乳桿菌127、副干酪乳桿菌228、干酪乳桿菌337和干酪乳桿菌336。劉琳琳等[26]從云南建水豆腐酸漿水中分離出了短乳桿菌、棒狀乳桿菌、彎曲乳桿菌和融合魏斯氏菌。然而，鮮有關(guān)于桂林腐乳酸漿水中乳酸菌情況的報(bào)道，本文以產(chǎn)β-葡萄糖苷酶為篩選條件，篩選得到1株德氏乳桿菌和4株發(fā)酵乳桿菌，為進(jìn)一步研究不同地域酸漿水中乳酸菌的組成提供了參考。

2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力

由圖3可知，0～6 h為菌株的快速生長(zhǎng)期，5株菌在發(fā)酵6 h時(shí)OD600 nm>0.9，之后生長(zhǎng)速度緩慢并伴有衰亡趨勢(shì)。培養(yǎng)液的pH值在0～6 h顯著下降（P<0.05）。其中，b8培養(yǎng)液的pH值下降最快，其培養(yǎng)6 h時(shí)pH為4.33，發(fā)酵后期甚至低于4.0，這可能與其具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)活力（OD600 nm）相關(guān)，其余4株菌培養(yǎng)液的pH值穩(wěn)定在4.5。pH值是培養(yǎng)液中氫離子濃度的表征，在一定程度上能夠反映菌株的產(chǎn)酸情況，故b8的產(chǎn)酸能力最高，b16次之，a1、a3、a7的產(chǎn)酸能力最低。

在之前的報(bào)道中，不乏一些具有高產(chǎn)酸能力的乳酸菌從酸漿水中被分離出來(lái)。Li等[27]從自然發(fā)酵大豆乳清中分離得到植物乳桿菌JMC-1，其黃漿水發(fā)酵16 h后的pH值降至4.0以下。葉青[25]在自然發(fā)酵的酸漿水中篩選得到干酪乳桿菌336，其培養(yǎng)8 h時(shí)的pH值為4.4左右。賀云[5]使用從腐乳酸漿水中分離的植物乳桿菌發(fā)酵黃漿水，其pH值在發(fā)酵6 h時(shí)降至4.4左右。綜上所述，分離自桂林腐乳酸漿水的德氏乳桿菌b8降低培養(yǎng)液pH的能力與大部分分離自酸漿水的乳酸菌類似。

2.3 菌株的β-葡萄糖苷酶活力

5株乳酸菌的β-葡萄糖苷酶活力均呈先增大后減小的趨勢(shì)（見(jiàn)圖4），這可能與培養(yǎng)后期乳酸菌的生長(zhǎng)活力減弱、培養(yǎng)液的pH值降低有關(guān)[12]。德氏乳桿菌b8的β-葡萄糖苷酶活力在培養(yǎng)6 h時(shí)達(dá)到峰值（（41.22±0.47） U/105 CFU），其余4株菌的酶活較低，均低于30 U/105 CFU。對(duì)比已有研究，Jose等[28]篩選出了β-葡萄糖苷酶活力較高的鼠李糖乳桿菌CRL981，其酶活為8.45 UE/mg，同時(shí)證明了β-葡萄糖苷酶在轉(zhuǎn)化大豆異黃酮的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。馮程程等[29]發(fā)現(xiàn)堅(jiān)強(qiáng)腸球菌GW18275在以纖維二糖為碳源時(shí)有最大的β-葡萄糖苷酶活力（16.02 U/mL）。李璞鈺[11]在寧夏漿水中篩選出4株具有較高β-葡萄糖苷酶活力的乳酸菌，包括3株植物乳桿菌和1株發(fā)酵乳桿菌，但酶活力均低于25 U/mL。然而，因酶液提取條件、菌株密度、菌株生長(zhǎng)特性的差異，菌株β-葡萄糖苷酶活力的高低不能通過(guò)酶活的大小進(jìn)行直接對(duì)比。但德氏乳桿菌b8在生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶方面具有較高的優(yōu)勢(shì)，若將其應(yīng)用于發(fā)酵豆制品的加工，有望提高大豆多酚的生物利用率。

2.4 菌株的抗氧化活性

在本研究中，5株具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力的乳酸菌均具有一定的清除DPPH和ABTS陽(yáng)離子自由基的能力（見(jiàn)圖5）。菌株在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12 h后，除a3之外的其余4株乳酸菌對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率均大于40%，其中a7和b8的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最高。5株乳酸菌對(duì)DPPH自由基的清除率均較低（小于20%），但b8對(duì)DPPH自由基的清除能力略優(yōu)于其余4株菌株。

3 結(jié)論

本研究以桂林腐乳酸漿水為原料，從中篩選出5株具有β-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌，并對(duì)比了其生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、抗氧化和生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力。經(jīng)測(cè)定，a1、a3、a7和b16為利莫西發(fā)酵乳桿菌，b8為德氏乳桿菌。其中，德氏乳桿菌b8具有較優(yōu)良的生長(zhǎng)活力和功能特性，其快速生長(zhǎng)期為0～6 h，培養(yǎng)24 h時(shí)的pH值下降到4.0以下，培養(yǎng)12 h時(shí)的DPPH、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率分別為（16.29±2.22）%、（51.02±2.43）%。本研究對(duì)桂林腐乳酸漿水中乳酸菌的種類和功能活性進(jìn)行了初步探索，為發(fā)酵豆制品行業(yè)提供了潛在的功能性菌株。

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