綜合生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及實驗驗證探討補腎健脾方改善2型糖尿病的作用機制

蔡少鵬，鄭麗莎，蔡惠連，封杰妮，朱嫻瓊，高曉露，范巧明，楊慶依，季兵

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣東祈福醫(yī)院，廣東廣州 511400）

糖尿?。╠iabetic mellitus，DM）發(fā)病率正逐年提高，一項全國性橫斷面研究結(jié)果表明，45 歲以上人群糖尿病患病率高達13.21%，其中，90%以上為2 型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者，且患病率隨年齡增長而增加[1]。T2DM 與酮癥酸中毒、心血管疾病等急慢性疾病高度相關(guān)，已成為威脅我國居民健康的重大公共衛(wèi)生問題。然而，臨床上口服的降糖藥如雙胍類、促胰島素分泌劑、α-糖苷酶抑制劑多因胃腸道反應(yīng)、營養(yǎng)與代謝障礙、過敏反應(yīng)、肝功能損害等副作用而存在臨床局限性[2-4]。相對而言，中醫(yī)藥具有毒副作用小、綜合治療作用、可延緩并發(fā)癥等優(yōu)點，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進程的加快，對抗T2DM 中藥復(fù)方的研究也愈加受到關(guān)注。有研究報道，中醫(yī)藥在抑制β細胞凋亡、修復(fù)β細胞功能等方面展現(xiàn)出光明前景[5-7]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，補腎健脾方（淫羊藿、鹿角膠、黃精、沙苑子、制首烏、黃芪、山藥、葛根、丹參、制大黃）具有降低T2DM 患者空腹血糖[7]、糖化血紅蛋白[8-9]、穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）[10]等臨床療效，但其具體作用機制尚未明確。因此，本研究旨在通過聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)、分子對接分析潛在的作用機制，并通過動物實驗驗證，以期進一步為臨床應(yīng)用補腎健脾方治療T2DM 提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 補腎健脾方化合物與相關(guān)靶點 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取補腎健脾方中藥成分及對應(yīng)的作用靶點，根據(jù)藥物動力學(xué)參數(shù)，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進行初篩；同時，通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index）補充中藥成分及靶點，以默認參數(shù)進行篩選。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化，轉(zhuǎn)化為gene symbol格式。

1.1.2 基因表達矩陣獲取 通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）獲取基因表達矩陣：數(shù)據(jù)集GSE18732 基于GPL9486 平臺，包括118 個樣本，其中，T2DM 樣本45例，糖耐量異常（IGT）樣本26例，正常樣本47例；數(shù)據(jù)集GSE95849 基于GPL22448 平臺，包括18 個樣本，其中，T2DM 樣本6例，正常樣本6例，糖尿病神經(jīng)病變樣本6例。為保證樣本的可對比性，本研究剔除了糖尿病神經(jīng)病變樣本，僅12 例樣本被納入研究。通過GEOquery 包獲取基因集信息，并進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.1.3 Mfuzz分析 基因通常不是以“開-關(guān)”的方式進行調(diào)控，而是以漸進的方式，這樣可以對基因功能進行更精細的控制[11]。T2DM 是由正常血糖發(fā)展到IGT后再進一步轉(zhuǎn)變而來，因此，存在漸進性進展的改變過程[12]。與傳統(tǒng)硬聚類不同，Mfuzz 提供了一種軟聚類算法，通過區(qū)分一個基因的聚類程度來反映漸進性的變化規(guī)律。本研究以GSE18732 數(shù)據(jù)集樣本臨床信息為依據(jù)，根據(jù)“正常-IGT-T2DM”的轉(zhuǎn)變規(guī)律進行Mfuzz分析，獲取與T2DM 轉(zhuǎn)變過程同步變化的聚類，提取聚類基因用于后續(xù)分析。

1.1.4 差異分析 通過limma 包提取GSE95849 數(shù)據(jù)集，根據(jù)發(fā)病狀態(tài)進行差異分析，以|logFC|≥1且P＜0.05 為條件進行篩選，獲取T2DM 與正常樣本存在差異的基因。

1.1.5 藥物作用靶點獲取 分別提取“1.1.1”“1.1.3”“1.1.4”項中補腎健脾方的作用靶點及T2DM 發(fā)展過程同步變化的差異靶點，獲取交集靶點作為補腎健脾方的作用靶點，通過Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化。

1.1.6 GO富集與KEGG 通路 提取“1.1.5”項中補腎健脾方的作用靶點，通過clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包進行富集分析，分別提取P＜0.05 的分子生物功能（MF）、生物過程（BP）、細胞組分（CC）和KEGG通路，預(yù)測補腎健脾方的作用機制。

1.1.7 核心靶點篩選 提取“1.1.5”項中的作用靶點，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）獲取靶點的交互作用，隨后導(dǎo)入Cytoscape 軟件，通過MCODE 插件進行網(wǎng)絡(luò)分析，計算靶點的Degree、Betweenness、Closeness等信息，分別提取每個指標(biāo)排前10 位的靶點，獲取交集靶點作為核心靶點，該靶點在網(wǎng)絡(luò)中具有優(yōu)秀的核心影響作用。

1.1.8 分子對接 提取度（Degree）值最高的活性成分，與FOS、NOTCH1 進行分子對接。從Protein Data Bank（PDB）（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白FOS（PDB ID：1A02）、NOTCH1（PDB ID：5L0R）的PDB格式（遵循：人源蛋白，分辨率及具有原始配體）。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫、ZINC數(shù)據(jù)庫下載活性成分的mol2 格式。使用PyMOL 2.6.0 對靶點蛋白進行去水、去小分子配體，采用AutoDockTools 1.5.7 對靶點蛋白、活性分子加全氫后進行分子對接，通過PyMOL 對分子對接結(jié)果進行可視化處理。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 4 周齡、體質(zhì)量約20 g 的雄性db/db陽性小鼠8只，均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。本動物實驗通過廣州銳格生物科技有限公司倫理委員會批準(zhǔn)，倫理號：20220301-121。

1.2.2 藥物、試劑與儀器 補腎健脾方由淫羊藿12 g、鹿角膠15 g、黃精12 g、沙苑子15 g、制首烏15 g、黃芪30 g、山藥30 g、葛根30 g、丹參30 g、制大黃10 g組成，以上中藥飲片均購自廣東祈福醫(yī)院中藥房，加工成凍干粉。胰島素酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；線粒體超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒（廣州博輝生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（上海酶研生物科技有限公司）；Bax抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-3 抗體、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋公司）；FOS 抗體、NOTCH1抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）。酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；RM2016 切片機（上海徠卡儀器有限公司）；DM500 光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司）；電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司）。

1.2.3 分組與給藥 將db/db 陽性小鼠隨機分為治療組和對照組，每組4只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。治療組給予補腎健脾方凍干粉溶液9.95 g/kg 灌胃，對照組給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)給藥4 周。小鼠灌胃劑量計算方法：中藥按20%出粉率計算，補腎健脾方凍干粉人體用量為0.796 g·kg-1·d-1，按小鼠用藥量為人體用藥量25倍計算小鼠用藥量為19.9 g·kg-1·d-1。

1.2.4 觀察指標(biāo)與方法

1.2.4.1 胰島功能及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 灌胃4 周后，禁食不禁水6 h，斷頸處死小鼠。腹主動脈取血，血糖試紙檢測空腹血糖水平，按試劑盒說明書采用ELISA 法檢測空腹胰島素，并計算穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=空腹胰島素×空腹血糖/22.5[13]。按試劑盒說明書采用ELISA法檢測SOD、MDA含量。

1.2.4.2 Western Blot法檢測小鼠胰腺組織內(nèi)蛋白表達 取胰腺組織，裂解、離心，收集上清液。取10 μg 蛋白添加到聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上后封閉，分別加入一抗FOS 和NOTCH1 4 ℃孵育過夜，用TBST 洗滌3 次后加入二抗孵育，用ImageJ 軟件定量分析蛋白條帶的光密度洗膜，顯影。

1.2.4.3 免疫組織化學(xué)法觀察小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達 取胰腺組織石蠟切片，脫蠟和水化，抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，封閉。分別與一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3 于37 ℃孵育1～ 2 h，與二抗37 ℃孵育0.5～ 2 h，顯色后拍照。用ImageJ 軟件分析Bax、Bcl-2、Caspase-3 陽性面積百分比。Bax、Bcl-2 在細胞漿表達，Caspase-3在細胞漿和細胞核均有表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒。

1.2.5 統(tǒng)計方法 運用R 4.1.3 軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon 秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mfuzz 分析隨著正常樣本從IGT 轉(zhuǎn)變?yōu)門2DM，聚類2、5 呈同步反向變化，聚類7 呈同步正向變化，見圖1。提取上述3個聚類共3 593個基因，其表達量與T2DM 的進展有同步變化關(guān)系，提示其可能為T2DM的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

圖1 Mfuzz分析Figure 1 Mfuzz analysis

2.2 差異分析以|logFC| ≥1、P＜0.05 為條件進行差異分析，篩選得到差異基因2 997個，其中，上調(diào)基因2 834個、下調(diào)基因163個，見圖2。通過繪制韋恩圖，獲取與Mfuzz 分析結(jié)果的交集基因576個，見圖3。

圖2 火山圖Figure 2 Volcano plot

圖3 韋恩圖Figure 3 Venn diagram

2.3 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)將補腎健脾方活性成分及其靶點與576 個T2DM 靶點取得交集基因77個，包括PROS1、FDXR、PYCR2、FOS等，提取交集基因相關(guān)的中藥成分信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。該網(wǎng)絡(luò)包括253 個節(jié)點和841條邊，根據(jù)Degree值篩選的核心成分主要有黃體酮（Progesterone）、γ-谷甾醇（Gamma-Sitosterol）、2-甲基腰果二酚（2-Methyl Cardol）、十五烷酸（Pentadecanoic Acid）。

2.4 GO 富集與KEGG 通路77 個基因用于GO 富集及KEGG 通路富集分析，提取P＜0.05 的富集結(jié)果。MF 主要富集于氧化還原酶的活性、輔酶結(jié)合等；CC主要富集于細胞-細胞接觸區(qū)、線粒體基質(zhì)等；BP 主要富集于缺氧及其響應(yīng)。KEGG 通路主要富集于T2DM、FoxO 通路、cAMP 通路等?？梢园l(fā)現(xiàn)，77個基因與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。見圖5。

圖5 GO富集與KEGG通路富集Figure 5 GO enrichment versus KEGG pathway enrichment

2.5 核心靶點篩選將77個基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，去除無連接節(jié)點，其余參數(shù)默認，構(gòu)建了一個63 個節(jié)點和117 條邊的網(wǎng)絡(luò)，通過MCODE 模塊分別計算節(jié)點的Degree、Closeness、Betweenness、MNC、MCC、EPC、EcCentricity和DMNC指標(biāo)，分別提取前10個節(jié)點獲取共同交集靶點2個：FOS和NOTCH1。見圖6。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS 和NOTCH1 在T2DM 樣本中表達水平顯著高于正常樣本，見圖7。

圖6 花瓣圖Figure 6 Petal diagram

圖7 云雨圖Figure 7 Cloud and rain map

2.6 分子對接根據(jù)“2.5”項Degree 值排序，篩選了黃體酮（Progesterone）、γ-谷甾醇（Gamma-Sitosterol）、2-甲基腰果二酚（2-Methyl Cardol）、十五烷酸（Pentadecanoic Acid）作為主要活性成分，隨后將活性成分和核心靶點FOS（PDB ID：1A02）、NOTCH1（PDB ID：5L0R）進行分子對接，結(jié)合能見表1。結(jié)合能小于0，表明受體分子與配體分子能自發(fā)結(jié)合；結(jié)合能小于-1.2 kcal·mol-1，表明對接能力較強，對接后分子的穩(wěn)定性較高。本研究對接結(jié)果顯示結(jié)合能均小于-1.2 kcal·mol-1，表明活性成分與核心靶點蛋白均能較穩(wěn)定地結(jié)合。分子對接的可視化結(jié)果見圖8。

表1 結(jié)合能Table 1 Binding energy

圖8 分子對接的可視化結(jié)果Figure 8 Visualisation of molecular docking results

2.7 各組小鼠胰島功能比較干預(yù)后，治療組小鼠的空腹血糖、空腹胰島素水平、HOMA-IR 水平均顯著低于對照組（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose，fasting insulin and HOMA-IR levels among each group of mice （）

表2 各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose，fasting insulin and HOMA-IR levels among each group of mice （）

注：①P＜0.05，與對照組比較

2.8 各組小鼠血清SOD、MDA 比較經(jīng)干預(yù)后，治療組小鼠的SOD水平明顯高于對照組（P＜0.05），而MDA水平則低于對照組（P＜0.01），結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD and MDA levels among each group of mice（）

表3 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD and MDA levels among each group of mice（）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與對照組比較

2.9 各組小鼠胰腺組織FOS、NOTCH1表達比較干預(yù)后，治療組小鼠胰腺中FOS、NOTCH1 表達量低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見圖9。

圖9 各組小鼠胰腺組織FOS、NOTCH1表達比較Figure 9 Comparison of FOS and NOTCH1 expressions in pancreatic tissue among each group of mice

2.10 各組小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達比較干預(yù)后，與對照組比較，治療組小鼠胰腺Bax、Caspase-3 陽性面積百分比降低（P＜0.05），Bcl-2陽性面積百分比升高（P＜0.05），結(jié)果見表4、圖10～圖12。

表4 各組小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達比較Table 4 Comparison of the expressions of apoptosisrelated proteins in the pancreas among each group of mice（，%）

表4 各組小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達比較Table 4 Comparison of the expressions of apoptosisrelated proteins in the pancreas among each group of mice（，%）

注：①P＜0.05，與對照組比較

圖10 Bax 的免疫組織化學(xué)染色圖（×100）Figure 10 Immunohistochemical staining of Bax（×100）

圖11 Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色圖（×100）Figure 11 Immunohistochemical staining of Bcl-2（×100）

圖12 Caspase-3的免疫組織化學(xué)染色圖（×100）Figure 12 Immunohistochemical staining of Caspase-3（×100）

3 討論

2 型糖尿?。═2DM）的發(fā)病機制中，胰島素抵抗和胰島β細胞功能衰竭是兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在確診糖尿病時，糖尿病患者的胰島β細胞功能已下降至正常人的一半，而在糖尿病診斷前10～12年，β細胞數(shù)量已經(jīng)顯著減少，并在此后逐年走向衰竭，正常的胰島β細胞則難以補償胰島素抵抗或不能再發(fā)揮這種補償機制，明顯加速了T2DM 病程[14-15]。有學(xué)者認為，胰島β 細胞衰竭源于凋亡異常增加[16]，抑制β 細胞凋亡對維持β 細胞數(shù)量及功能具有重要意義[17-18]。

胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)與糖尿病前期相關(guān)，糖尿病前期被認為是轉(zhuǎn)化為糖尿病的高風(fēng)險狀態(tài)，在此期間活性氧（ROS）生成增加，增加的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)T2DM 及血管功能障礙等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致肌肉和脂肪細胞的葡萄糖攝取受損，并減少β 細胞的胰島素分泌[20]。Furukawa 等[21]通過使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制劑減少全身氧化應(yīng)激，改善了肥胖小鼠模型中的葡萄糖代謝。Meigs 等[22]研究的數(shù)據(jù)顯示，胰島素抵抗的患病率與氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-epi-PGF2α濃度呈正相關(guān)，這表明胰島素抵抗與非糖尿病患者和糖尿病風(fēng)險升高的亞組如肥胖或空腹血糖受損（IFG）中的氧化應(yīng)激相關(guān)。此外，在IFG 受試者中，與空腹血糖正常受試者相比，這種相關(guān)性更高[23-24]。可見，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)β 細胞功能障礙是誘導(dǎo)胰島素抵抗、促進IGT 與T2DM 的關(guān)鍵過程。然而，目前臨床抗T2DM 的治療藥物發(fā)揮降糖療效的同時，對受損的β細胞進一步刺激受損，缺乏促進β 細胞修復(fù)的功能，難以控制日漸衰退的β 細胞數(shù)量及功能[25-26]。相對而言，中藥“多靶點”治療優(yōu)勢在改善糖尿病癥狀的同時對β細胞的保護展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，并逐漸受到臨床的廣泛關(guān)注。

T2DM 歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”的范疇。“脾腎虛于內(nèi)，標(biāo)實于外”是T2DM 的發(fā)病進展原因。由于久坐、熬夜等不良生活方式及肥胖發(fā)病率的增長，目前臨床上以“三多一少”為典型表現(xiàn)的T2DM 患者越來越少，相反，以疲倦乏力、形體肥胖、脘腹脹滿、腰膝酸軟、舌淡胖有齒痕，苔薄白，脈沉細無力等脾腎虧虛證候居多?！鹅`樞·本臟》言：“腎脆則善病消癉易傷?！薄妒颐劁洝?nèi)傷門》言：“消渴之證，雖分上、中、下而以腎虛致渴，而無不同也?！蹦I為元陰元陽之臟，腎陰虧虛，無以上濟，虛火內(nèi)生，精血化生失源，脈道不充，久病累及腎陽，不能溫養(yǎng)脾陽，加之飲食不節(jié)，脾陽受損，日久脾腎虧虛。《素問·經(jīng)脈別論》言：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺……水津四布，五經(jīng)并行。”氣血依賴于脾胃納運相得，因脾胃功能失常，水谷精微無法轉(zhuǎn)化為氣血輸布，食滯生痰、生熱、生瘀，進一步阻滯陽氣宣通，而病邪蓄積體內(nèi)表現(xiàn)為血糖、血脂等升高。因此，血糖的升高是病邪“標(biāo)實”的體現(xiàn)，脾腎耗竭是發(fā)病的根本，降糖等祛邪手段在短期內(nèi)起效顯著，實則加重了“本虛”，如一線用藥二甲雙胍，其臨床療效受到普遍認可的時候，卻因其藥性寒涼，會出現(xiàn)腹瀉等脾陽受損加重的表現(xiàn)[27-28]；而磺脲類藥物降糖起效快且效果顯著，卻因過度耗損β 細胞，動搖了根本，導(dǎo)致本虛無以抗邪出現(xiàn)繼發(fā)性失效。因此，補腎健脾為治療T2DM的要點。

本研究綜合生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出77 個補腎健脾方的作用靶點，通過富集分析，77 個靶點與氧化應(yīng)激過程關(guān)系密切，并進一步篩選出2 個核心靶點FOS、NOTCH1，通過分子對接證明了補腎健脾方的主要活性成分與核心靶點結(jié)合穩(wěn)定。最后，通過動物實驗證明了補腎健脾方可有效降低胰腺FOS、NOTCH1 表達，并降低脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA，提高抗氧化指標(biāo)SOD 活性，抑制凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達，促進凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達，同時升高HOMA-IR。表明補腎健脾方通過降低胰腺FOS、NOTCH1 表達來緩解氧化應(yīng)激，降低胰島細胞凋亡，改善胰島素抵抗以延緩T2DM的進展。

綜上所述，補腎健脾方可通過胰腺FOS、NOTCH1等發(fā)揮抗氧化應(yīng)激改善胰島細胞凋亡，達到延緩T2DM 進展的目的，為其對T2DM 的防治提供了證據(jù)支持。