柚皮素緩解干眼病引起的角膜疼痛綜合征的機(jī)制研究

印健，顧宇亮

（江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院眼科，江蘇昆山 215300）

干眼?。╠ry eye disease，DED）是眼科常見的眼表和淚液疾病，伴有神經(jīng)感覺異常[1-2]，以眼部干澀、異物感、燒灼感、瘙癢和疼痛等癥狀為主要臨床表現(xiàn)[3]。角膜為透明的無血管組織，是機(jī)體神經(jīng)分布最密集的組織[4]。角膜傷害性神經(jīng)支配為睫狀神經(jīng)，其中，神經(jīng)元位于三叉神經(jīng)節(jié)（TG）的眼支中[5-6]。三叉神經(jīng)節(jié)是口腔頜面部從外周到中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳遞和疼痛調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位[7]。不同類型的受體（機(jī)械傷害感受器、多模態(tài)傷害感受器和溫度感受器）共存于單個(gè)角膜神經(jīng)末梢上[8]，大約40%是多模態(tài)傷害性感受器，對熱、酸和化學(xué)試劑敏感，50%是冷的溫度感受器，10%是機(jī)械傷害感受器[9]。有害的（包括熱、機(jī)械、化學(xué)）刺激和炎癥可以誘導(dǎo)干眼病角膜感覺神經(jīng)元終端激活，導(dǎo)致痛覺增強(qiáng)[8]。

目前，人工滴眼液和環(huán)孢霉素是干眼病的主要治療方法[10-11]。雖然這些干預(yù)措施已被廣泛應(yīng)用于緩解眼部癥狀，但通常只對輕度干眼病癥狀提供短期緩解，對中度至重度干眼病癥狀無效。因此，有必要探尋更優(yōu)的干預(yù)措施和藥物。近年來，一些植物化學(xué)物質(zhì)因具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎功能有助于減輕干眼病癥狀，且副作用和毒性小，因此受到特別的關(guān)注?；偌t為蕓香科植物化州柚Citrus grandis“Tomentosa”或柚Citrus grandis（L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，有散寒、燥濕、消痰、利氣等功效，用于風(fēng)寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等癥。柚皮素（naringenin，NAR）是來源于化橘紅的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)咳以及抗癌等多種藥理活性，其目前已成為眼病治療的熱點(diǎn)之一[12-13]。

趨化因子13（CXCL13），也被稱為B 淋巴細(xì)胞螯合劑，最初在B 細(xì)胞濾泡的基質(zhì)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，可調(diào)節(jié)B 細(xì)胞和T 細(xì)胞亞群的歸屬[14]。既往研究表明，CXCL13 在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不表達(dá)，但在某些病理?xiàng)l件下在大腦和脊髓中呈高表達(dá)[15-16]。另外，Colafrancesco 等[17]發(fā)現(xiàn)，CXCL13能夠作為干燥綜合征（Sj?gren’s syndrome）組織學(xué)病變的生物標(biāo)志物。因此，本研究以CXCL13為切入點(diǎn)，旨在探討柚皮素對干眼病引起的角膜疼痛綜合征的緩解作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只清潔級8 周齡成年雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（23.48±0.04）g，購自無錫恒泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2023-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2023-0006。小鼠被隨機(jī)分配到籠子里（6 只/籠），并在受控條件下維持溫度（22 ± 1）℃，相對濕度（60 ± 10）%，12 h/12 h 光/暗周期，自由進(jìn)食和飲水。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序都嚴(yán)格按照江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行，動(dòng)物倫理審批號(hào)（院科倫審：AEWC-2010293）。

1.2 藥物、試劑與儀器

柚皮素（NAR，分子式：C15H12O5，分子量：272.25，分子式見圖1）購自北京索萊寶科技有限公司，CAS 號(hào)：480-41-1，純度≥98%。淚腺凝膠（英國Dechra 公司）；MinuteTM總蛋白提取試劑盒（美國Invent Biotechnologies 公司）；SYBR Green PCR Master Mix（日本TaKaRa公司）；CXCL13 抗體、GAPDH 抗體、IgG 二抗（美國Abcam 公司）；c-FOS抗體（美國Santa Cruz公司）。Alcon Ⅱ電子顯微鏡（德國Leica公司）；BX51顯微鏡（日本Olympus公司）；NanoZoomer2.0-HT 數(shù)字切片掃描設(shè)備（日本Hamamatsu Photonics 公司）；Rotor-Gene 6000 熒光定量PCR儀（德國Hamburg 公司）；ScanLater Western Blot檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

圖1 柚皮素分子結(jié)構(gòu)Figure 1 Molecular structure of naringenin

1.3 分組與造模

將24 只小鼠隨機(jī)分為4 組：sham 組（假手術(shù)對照組）、DED 組（干眼病模型組）、DED+DMSO 組（治療對照組）、DED+NAR 組（柚皮素治療組）。每組6 只。

DED 組小鼠處理方法如下：腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和賽拉嗪（8 mg/kg）麻醉小鼠，進(jìn)行單側(cè)（右側(cè)）眶外淚腺（ELG）和哈德氏腺（HG）切除。手術(shù)前，在兩只眼睛上均滴一滴淚腺凝膠。在手術(shù)顯微鏡下，在顳側(cè)做一個(gè)8 mm 的皮膚切口，暴露并切除眶外淚腺。在分離眼眶上方靠近內(nèi)眥的結(jié)膜組織后，小心地取出哈德氏腺。通過檢查手術(shù)區(qū)是否有任何殘留的腺體組織來驗(yàn)證是否完全切除。然后使用6.0 編織絲線縫合皮膚切口。在切口處滴上一滴碘酒溶液，以避免細(xì)菌感染。根據(jù)眼瞼閉合時(shí)間及角膜機(jī)械閾值判斷造模是否成功。對于sham 組小鼠：在同一區(qū)域做一個(gè)切口，但不接觸腺體。小鼠被放置在溫暖（30 ℃）的籠子里，以便從手術(shù)中恢復(fù)。

DED+DMSO 組及DED+NAR 組小鼠處理步驟如下：在手術(shù)前，使用柚皮素進(jìn)行眼局部治療。從手術(shù)后第7 天開始，只在右眼進(jìn)行DMSO 溶劑（DED+DMSO 組）或1%柚皮素（DED+NAR組，柚皮素溶于DMSO，滴入劑量為50 μL）眼部局部滴注，持續(xù)到第21 天。DED 小鼠每天在籠子里接受2 次治療（上午10 點(diǎn)和下午5 點(diǎn)）。此外隨機(jī)排列籠子順序，以進(jìn)行眼部局部滴注。所有測試都在第21 天進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 行為測試

首先進(jìn)行行為測試。對于行為測試，實(shí)驗(yàn)開始前30～60 min，將小鼠放置在測試室。

1.4.1.1 角膜對化學(xué)和機(jī)械刺激敏感性的測量

將1%柚皮素應(yīng)用于右眼后，立即將動(dòng)物放入單獨(dú)的籠子中，通過測量5 min 內(nèi)右眼眼瞼的閉合時(shí)間長度檢測角膜的化學(xué)敏感性。使用Von Frey纖維絲測痛儀檢測機(jī)械角膜敏感度[18]。將經(jīng)過校準(zhǔn)的Von Frey 細(xì)絲（0.008～0.04 g）的力施加到被固定小鼠的角膜中心。機(jī)械閾值與眨眼反應(yīng)相對應(yīng)。

1.4.1.2 高架十字迷宮試驗(yàn)

將動(dòng)物置于高架十字迷宮的中心區(qū)域，使其頭部朝向閉合臂，開啟攝像監(jiān)控器記錄5 min 內(nèi)小鼠在開放臂中花費(fèi)的時(shí)間。使用Smart 3.0 軟件（Harvard Apparatus）分析行為參數(shù)。

1.4.1.3 黑白箱試驗(yàn)測試焦慮

測試裝置由一個(gè)盒子組成，盒子分為一個(gè)?。ㄈ种唬┌凳液鸵粋€(gè)大（三分之二）明亮的照明室。將小鼠放入照明的隔間中，并允許在兩個(gè)室之間自由移動(dòng)。進(jìn)入暗室的第1個(gè)潛伏期和在亮室中花費(fèi)的總時(shí)間是小鼠明亮空間焦慮的指標(biāo)。測試前，小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室至少60 min。使用視頻跟蹤系統(tǒng)，并用Smart 3.0 軟件（Harvard Apparatus）分析行為參數(shù)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間，用70%乙醇清潔試驗(yàn)箱的地板和墻壁，以避免任何干擾。

1.4.2 c-FOS檢測

小鼠被安樂死后，解剖取腦，采集杏仁核，固定，脫水、石蠟包埋和制片。脫蠟和水化，抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，用5%正常山羊血清孵育30 min。然后加入c-FOS 抗體（1∶200）4～ 8 ℃孵育48 h，PBS 洗滌后，加入生物素化山羊抗兔二抗（1∶200）中孵育2 h，再次PBS 洗滌，放入親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物溶液中60 min。最后，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）用于可視化c-FOS 免疫反應(yīng)性，PBS 洗滌終止顯色，脫水，封片。使用Olympus BX51 顯微鏡對切片進(jìn)行掃描，借助圖像分析系統(tǒng)，對c-FOS陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.3 睫狀神經(jīng)纖維自發(fā)和受激活動(dòng)的多單位細(xì)胞外記錄

自發(fā)性睫狀神經(jīng)纖維活性在第21 天測定。小鼠被安樂死后，迅速摘下右眼（手術(shù)側(cè)）。在（33 ±1）℃和pH 7.4 的條件下，用超灌注生理鹽水對角膜進(jìn)行基線記錄。本研究對睫狀神經(jīng)的誘發(fā)活動(dòng)是在熱刺激下測量的，在pH 7.4 下將超融合鹽水的溫度從（33±1）℃降至（20±1）℃（冷刺激）或高達(dá)（40±1）℃（熱刺激）。使用吸引電極（Ag/AgCl）記錄睫狀神經(jīng)的多單位細(xì)胞外電活動(dòng)。信號(hào)被濾波（300～5 000 Hz）放大（×10 000），并通過Spike 2數(shù)據(jù)分析軟件（CED Micro1401，Cambridge Electronic Design）以10 000 Hz 的采樣頻率數(shù)字化。在進(jìn)行電生理記錄之前，將角膜與超融合生理鹽水溶液超融合30 min 以穩(wěn)定準(zhǔn)備。自發(fā)性細(xì)胞外睫狀神經(jīng)纖維活動(dòng)定義為每秒脈沖（imp/s）。

1.4.4 RT-qPCR分析

使用TRIzol 試劑提取三叉神經(jīng)節(jié)（TG）的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix 在熒光定量PCR 儀中進(jìn)行qPCR 分析。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，引物序列如下：CXCL13 Forward：5’-GGCCACGGTATTCTGG AAGC-3’，Reverse：5’-ACCGACAACAGTTGAA ATCACTC-3’。IL-1β Forward：5’-ACTCATTGT GGCTGTGGAGA-3’，Reverse：5’-TTGTTCATCTC GGAGCCTGT-3’。IL-6 Forward：5’-CTGCAAGAG ACTTCCATCCAG-3’，Reverse：5’-AGTGGTATAG ACAGGTCTGTTGG-3’。IL-10 Forward：5’-GCTCT TACTGACTGGCATGAG-3’，Reverse：5’-CGCAGC TCTAGGAGCATGTG-3’。GAPDH Forward：5’-GC TTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3’，Reverse：5’-AG AAGCCAGCGTTCACCAGAC-3’。擴(kuò)增長度均為200 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.4.5 Western Blot 法檢測三叉神經(jīng)節(jié)CXCL13表達(dá)水平

使用MinuteTM總蛋白提取試劑盒提取三叉神經(jīng)節(jié)總蛋白。用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。然后，將等量的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將膜與一抗CXCL13（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）孵育過夜。洗膜后在室溫下與IgG 二抗（1∶5 000）孵育1 h。洗膜后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）試劑盒顯色，以Western Blot 檢測系統(tǒng)檢測，用ImageJ 軟件對灰度圖進(jìn)行半定量分析。GAPDH 為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），事后檢驗(yàn)采用Tukey’s 多重比較法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干眼病誘導(dǎo)小鼠化學(xué)和機(jī)械性角膜過敏和焦慮樣行為

模型組小鼠的眼瞼閉合時(shí)間較sham 組顯著增加（P＜0.01），見圖2-A。與sham 組比較，模型組小鼠的角膜機(jī)械閾值顯著降低（P＜0.01），見圖2-B。本研究使用2 種行為測試來檢驗(yàn)小鼠焦慮狀態(tài)，高架十字迷宮結(jié)果顯示：模型組小鼠開臂停留時(shí)間較sham 組顯著降低（P＜0.01），見圖2-C；黑白測試結(jié)果顯示，模型組小鼠在白色區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間同樣顯著低于sham組（P＜0.01），見圖2-D。杏仁核在慢性焦慮和疼痛的發(fā)展中起著重要作用。本研究觀察了干眼病小鼠大腦杏仁核中c-FOS免疫反應(yīng)性（神經(jīng)元激活的標(biāo)志）的變化，結(jié)果顯示，模型組小鼠杏仁核中cFOS 陽性細(xì)胞數(shù)量高于sham組（P＜0.05），見圖2-E。

圖2 干眼病誘導(dǎo)小鼠化學(xué)和機(jī)械性角膜過敏和焦慮樣行為Figure 2 DED induces chemical and mechanical corneal allergy and anxiety-like behaviour in mice

2.2 柚皮素減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征

評估柚皮素對干眼病的治療效果，結(jié)果顯示，DED+NAR 組干眼病小鼠眼瞼閉合時(shí)間顯著降低，角膜機(jī)械閾值增加，與DED+DMSO 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見圖3-A～B。同時(shí)，使用柚皮素治療減少干眼病小鼠角膜傷害感受器敏化，具體表現(xiàn)在對熱和冷觸發(fā)的角膜神經(jīng)活動(dòng)的作用。結(jié)果顯示，于20、31、40 ℃，DED+NAR 組小鼠睫狀神經(jīng)的誘發(fā)活動(dòng)較DED+DMSO 組顯著下降（P＜0.01），見圖3-C。以上結(jié)果表明，柚皮素可減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征。

圖3 柚皮素減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征Figure 3 Naringenin alleviates corneal pain syndrome caused by dry eye disease

2.3 柚皮素減少干眼病小鼠角結(jié)膜促炎細(xì)胞因子

本研究通過RT-qPCR 法檢測不同處理組小鼠角結(jié)膜炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示：與sham 組比較，DED 組小鼠角結(jié)膜中促炎癥因子IL-1β mRNA、IL-6 mRNA水平顯著上升，抗炎癥因子IL-10 mRNA 水平顯著下降（均P＜0.001）；與DED+DMSO 組比較，DED+NAR 組角結(jié)膜上述炎癥因子mRNA 表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著逆轉(zhuǎn)（均P＜0.01）。

圖4 柚皮素減少干眼病小鼠角結(jié)膜促炎細(xì)胞因子Figure 4 Naringin reduces pro-inflammatory cytokines in the cornea of mice with dry eye disease

2.4 柚皮素降低干眼病小鼠三叉神經(jīng)節(jié)CXCL13 mRNA及蛋白表達(dá)水平

為探討柚皮素是否通過調(diào)節(jié)CXCL13 表達(dá)緩解干眼病小鼠角膜疼痛，本研究通過RT-qPCR 法檢測CXCL13 mRNA 表達(dá)水平，Western Blot 法檢測CXCL13 蛋白表達(dá)水平。圖5 結(jié)果顯示，DED 組小鼠CXCL13 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均較sham 組顯著上升（P＜0.001），而DED+NAR 組CXCL13 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均低于DED+DMSO 組（P＜0.01或P＜0.001）。

圖5 柚皮素降低干眼病小鼠三叉神經(jīng)節(jié)CXCL13 mRNA及蛋白表達(dá)水平Figure 5 Naringin reduces mRNA and protein expression levels of CXCL13 in the trigeminal ganglion of mice with dry eye disease

3 討論

干眼病是一種常見的眼部疾病，包括由于眼表炎癥引起的不適、視力障礙和淚膜滲透壓增加等多種癥狀[19]。目前，干眼病機(jī)制尚不完全明確。在干眼病中，淚腺和眼表面的穩(wěn)態(tài)維持喪失，使穩(wěn)定淚膜和保護(hù)眼表面的淚膜成分失衡[20-21]。淚液高滲是干眼惡性循環(huán)的中心事件之一，導(dǎo)致淚液減少，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和生成[20]。本研究中，柚皮素降低了干眼癥小鼠促炎因子IL-1β、IL-6 mRNA 水平，升高了干眼癥小鼠抗炎癥因子IL-10 mRNA 水平，表明干眼癥小鼠經(jīng)柚皮素治療后炎癥反應(yīng)下降。

角膜超敏性、炎癥和自發(fā)角膜神經(jīng)纖維活動(dòng)之間存在一定的聯(lián)系[22]，角膜炎癥參與角膜神經(jīng)感受器的激活[23]。趨化因子被認(rèn)為在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用[23]，包括CCL2、CCL7、CXCL1 和CXCL13 在內(nèi)的幾種趨化因子[24-25]。有研究報(bào)道，10種趨化因子（包括CCL2、CCL7、CXCL1和CXCL13）在脊神經(jīng)結(jié)扎后的脊髓中表達(dá)增加了3 倍以上，其中，CXCL13 是上調(diào)最多的基因，增加了47 倍[25]。本研究結(jié)果顯示，干眼病小鼠三叉神經(jīng)節(jié)CXCL13 mRNA 及蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)，而柚皮素對CXCL13 mRNA 及蛋白表達(dá)水平有一定的抑制作用。

臨床前研究和臨床研究報(bào)告了干眼病角膜疼痛與焦慮共病[26]。本研究使用高架十字迷宮和黑白箱試驗(yàn)對DED 小鼠進(jìn)行焦慮測試，結(jié)果顯示，DED 小鼠出現(xiàn)焦慮行為。這種行為與杏仁核中觀察到的神經(jīng)元激活有關(guān)，使痛覺反應(yīng)與疼痛的情緒方面之間建立聯(lián)系。該發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了干眼病對動(dòng)物神經(jīng)精神的影響，將會(huì)導(dǎo)致疼痛和焦慮。而柚皮素可減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征。

綜上所述，本研究初步探究了柚皮素對干眼病小鼠化學(xué)和機(jī)械性角膜過敏、焦慮樣行為以及三叉神經(jīng)節(jié)CXCL13 mRNA 及蛋白表達(dá)水平的影響。柚皮素可抑制三叉神經(jīng)節(jié)CXCL13表達(dá)，從而緩解干眼病引起的角膜疼痛綜合征。