根結(jié)線蟲生防細(xì)菌物種多樣性及生防潛力研究

劉劍金，莫明和，曹 毅

（1. 云南省煙草公司普洱市公司，云南 思茅 665000；2. 云南大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091；3. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550081）

植物寄生線蟲種類5000 余種，可寄生糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、林木及觀賞植物等3000 多種植物[1]。全世界每年因植物寄生線蟲病害造成的農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到1570 億美元。其中，以根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne spp.）對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害最為嚴(yán)重[2]。應(yīng)用化學(xué)殺線蟲劑是控制農(nóng)作物根結(jié)線蟲病害的主要手段，但多數(shù)化學(xué)殺線蟲劑毒性大、污染環(huán)境，應(yīng)用受到限制[3]。利用線蟲生防微生物研發(fā)生物菌劑并應(yīng)用于線蟲防控是安全、環(huán)保的有效措施[7-9]。近年來(lái)，利用生防細(xì)菌開發(fā)的殺線劑已在不同國(guó)家登記和應(yīng)用[4]，但生防菌劑相對(duì)較低和不穩(wěn)定的防效阻礙了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。趨化性在線蟲中廣泛存在，其參與線蟲尋找寄主植物和選擇適宜的棲息環(huán)境[5]。在土壤中，病原線蟲二齡幼蟲（J2）通過復(fù)雜的化感神經(jīng)元識(shí)別來(lái)自寄主植物的信號(hào)，趨近和侵染根系并建立永久性取食位點(diǎn)[6]。根系生長(zhǎng)過程中所營(yíng)造的低pH 環(huán)境及產(chǎn)生的CO2對(duì)根結(jié)線蟲J2 都具有趨化誘吸作用[7]。根系分泌物的特定組分（丹寧酸、黃酮類、糖苷類、脂肪酸、月桂酸等）可通過調(diào)節(jié)J2 的趨化性來(lái)吸引或趨離線蟲[8]。同樣，線蟲生防菌也可釋放化學(xué)信號(hào)吸引線蟲自動(dòng)靠近生防菌。例如殺線蟲芽孢桿菌產(chǎn)生二庚酮等信號(hào)分子吸引線蟲靠近生防菌，進(jìn)而分泌絲氨酸蛋白酶等毒力因子致死線蟲，展現(xiàn)了生防菌誘殺線蟲的精細(xì)機(jī)制[9]。郝玉娥等系統(tǒng)報(bào)道了通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)吸引線蟲的細(xì)菌種類[10]，但目前為止，利用吸引線蟲的生防菌及其趨化底物防控根結(jié)線蟲病的研究少有報(bào)道。文章首先篩選吸引根結(jié)線蟲J2 的生防菌，測(cè)定其趨化性，通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定吸引線蟲的趨化性細(xì)菌在與其趨化底物配合施用時(shí)的防效，為這類生防菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生防細(xì)菌篩選

從云南大學(xué)“西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)微生物庫(kù)”獲得分離自各種基質(zhì)的細(xì)菌共1471 株，菌株用LB 培養(yǎng)基活化并用LB 液體培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)48 h。取2 mL 培養(yǎng)液于直徑3.5 cm 的塑料皿中，加入南方根結(jié)線蟲J2 懸液（含J2 約200 條）10 μL，以LB 液體培養(yǎng)基替代菌液為對(duì)照，每處理3 個(gè)重復(fù)，室內(nèi)放置24 h 時(shí)鏡檢，計(jì)算殺線率，公式如下：

殺線率（%）=（處理J2 死亡數(shù)-對(duì)照J(rèn)2 死亡數(shù)）/線蟲總數(shù)×100。

1.2 生防細(xì)菌誘吸活性分析

制備趨化平板：取瓊脂糖15 g 溶解于1 L 無(wú)菌水中，滅菌后待冷卻至40 ℃時(shí)依次加入5 mL 磷酸鹽緩沖液（K2HPO421.5 g，KH2PO4119 g，定容至1 L，0.22 μm 濾膜過濾除菌）、1M MgSO4溶液1 mL 、1M CaCl2溶液1 mL ，混勻后倒平板。在平板背面用記號(hào)筆劃線分割區(qū)域，沿著直徑劃線，并在直線兩邊距離邊緣2.0 cm 處分別標(biāo)記“+”和“-”；以直徑中心為起點(diǎn)，左右各0.5 cm 處作標(biāo)記點(diǎn)，過這2 個(gè)標(biāo)記點(diǎn)作垂直于直徑到平板邊緣的直線，將整個(gè)平板分為A、B、C 3 個(gè)區(qū)域（圖1）。取J2 懸液10 μL（約200 條）點(diǎn)接于平板的中心點(diǎn)（C 區(qū)），在A 區(qū)上點(diǎn)接生防細(xì)菌的LB 新鮮培養(yǎng)液10 μL，在B 區(qū)點(diǎn)接液體培養(yǎng)基10 μL 作為對(duì)照，每處理3 個(gè)重復(fù)；用封口膜將平板密封于28 ℃下避光放置2 h，然后統(tǒng)計(jì)各區(qū)域的J2 數(shù)量。A 區(qū)、B 區(qū)和C 區(qū)的J2 數(shù)量分別用A、B、C 表示。生防細(xì)菌吸引J2 的能力用趨化指數(shù)值（Chemotaxis index，CI）表示：CI=（A-B）/（A+B+C），CI 值越高，表示對(duì)線蟲的吸引能力越強(qiáng)；CI＞0 視為吸引；CI≤0視為無(wú)吸引活性[11]。

圖1 細(xì)菌吸引J2 的平板篩選示意圖

1.3 生防細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

用細(xì)菌DNA 提取試劑盒（Cat#DP2001，BioTeke）按說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA。以基因組DNA 為模板，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’） 和 492R （5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增16S rRNA 基因。獲得PCR 產(chǎn)物由北京華大基因生物有限責(zé)任公司用ABI PRISM 3730 DNA 自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定基因序列。將16S rRNA 基因序列分別在EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較，確定菌株的分類地位。

1.4 2 個(gè)菌株對(duì)尼古丁的趨化測(cè)定

尼古丁是煙草根系分泌物的主要成分之一[12]，趨化尼古丁的生防細(xì)菌在根際定殖和防效方面具有優(yōu)勢(shì)。P.corrugate YMF3.02205 和P.rhodesiae YMF3.02254對(duì)J2 的殺線活性和吸引活性最高；為此，參照文獻(xiàn)描述的滴定試驗(yàn)法和軟瓊脂平板群集法[12]測(cè)定2 個(gè)菌株對(duì)尼古丁是否具有趨化性，并以不具有趨化性的Alcaligenes faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 菌株為對(duì)照。試驗(yàn)平板中所用的尼古丁終濃度為0.2 mM。

1.5 2 個(gè)菌株GFP 標(biāo)記

按文獻(xiàn)描述的方法制備感受態(tài)細(xì)胞[13]。向感受態(tài)細(xì)胞中加入pDSK-GFPuv 質(zhì)粒0.5 μL，混勻后置于冰上，將待轉(zhuǎn)化的混合液加入提前置于冰上預(yù)冷的1 mm 電轉(zhuǎn)杯中，選擇適宜的電轉(zhuǎn)模式后進(jìn)行電擊，電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入LB 液體培養(yǎng)基1 mL ，37 ℃，180 rpm 振蕩復(fù)蘇3～5 h，取均勻細(xì)胞懸液100 μL 涂布于含40 μg·mL-1卡那霉素的LB 平板上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落轉(zhuǎn)接在LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rpm 過夜培養(yǎng)，最后取菌液10 μL在熒光顯微鏡40 倍物鏡下觀察是否有熒光并拍照，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子編號(hào)分別為P.corrugate YMF 3.02205-gfp 和P.rhodesiae YMF3.02254-gfp。

1.6 趨化性生防細(xì)菌防治煙草根結(jié)線蟲的盆栽試驗(yàn)

供試煙草品種為云煙87，3～5 片葉的煙苗從云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院獲得。盆栽土壤取自云南省峨山縣煙田，土壤在121 ℃下滅菌1 h 后分裝于花盆中（2 kg·盆-1），移栽煙苗，每盆1 株，移栽3 d 時(shí)灌根各處理藥劑100 mL·株-1，灌藥2 d 時(shí)接種南方根結(jié)線蟲J2，1000 條·株-1。處理1：5 億CFU·mL-1P.corrugate YMF3.02205-gfp 菌懸液；處理2：5 億CFU·mL-1P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 菌懸液；處理3：5 億CFU·mL-1P.corrugate YMF3.02205-gfp 菌懸液+尼古丁40 μmol·L-1；處理4：5 億CFU·mL-1P.rhodesiae YMF3.02254-gfp+尼古丁40 μmol·L-1；處理5：10%噻唑膦顆粒劑（山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司生產(chǎn)），0.5 g·株-1、混土；處理6（CK）：以等量的LB 液體培養(yǎng)基替代菌液作為空白對(duì)照。每處理10 盆，在溫室里隨機(jī)排列。移栽60 d 時(shí)拔出植株，收集根際土用于測(cè)定生防菌生物量，按以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行根瘤分級(jí)并按公式計(jì)算病情指數(shù)和防效：2 級(jí)：21%～40%的根系有根瘤；3 級(jí)：41%～60%的根系有根瘤；4 級(jí)：61%～80%的根系有根瘤；5級(jí)：81%～100%的根系有根瘤。并按以下公式計(jì)算病情指數(shù)和防效：病情指數(shù)=（n1×1+ n2×2+ n3×3+ n4×4+n5×5）/（S×5）×100，n1-n5分別代表根瘤病級(jí)指數(shù)；防效（%）=100（1-x/y），x、y 分別代表處理和空白對(duì)照的病情指數(shù)。

生防菌根際生物量測(cè)定：每煙株取根際土1 g 用無(wú)菌水梯度稀釋后涂布于含40 μg·mL-1卡那霉素的LB 抗性平板上，3 個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)平板上的CFU，以平均每克根際土的菌落數(shù)表示生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲生防細(xì)菌篩選

由圖2 可知，以南方根結(jié)線蟲J2 為靶標(biāo)，測(cè)定了1471 株細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)J2 殺線活性，結(jié)果顯示99 株細(xì)菌對(duì)J2 的殺線率≥30%。其中，殺線率在30.00%～39.99%的有46 株，40.00%～49.99%的有27 株，50.00%～59.99%的有10 株，60.00%～69.99%的有12 株，70.00%以上的有4 株。

圖2 在不同殺線率區(qū)間南方根結(jié)線蟲J2 的菌株數(shù)

2.2 根結(jié)線蟲生防細(xì)菌誘吸活性及種群組成分析

由圖3 可知，在上一實(shí)驗(yàn)中獲得的99 株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌中，58 株對(duì)J2 顯示出不同程度的誘吸活性（CI＞0），占58.58%。其中，11 株的CI＞0.2，顯示出較強(qiáng)的活性，占根結(jié)線蟲生防細(xì)菌總數(shù)的18.97%；20 株顯示出中等誘吸活性（0.1＜CI≤0.2），占34.48%；27 株顯示出弱誘吸活性（0＜CI≤0.1），占46.55%；41 株無(wú)誘吸活性（CI≤0），占41.41%。

圖3 生防細(xì)菌對(duì)南方根結(jié)線蟲J2 誘吸活性評(píng)估（A）及種群組成分析（B）

基于16S rRNA 序列分析，這58 株具有誘吸活性的生防細(xì)菌歸屬于放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4 個(gè)大類。其中，厚壁菌門種類最多，共30 株，占具有吸引根結(jié)線蟲活性菌株總數(shù)的51.72%。在厚壁菌門中，芽孢桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢(shì)屬，共6種16 株菌。變形菌門（Proteobacteria）共有21 株，占總數(shù)的36.21%，假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢(shì)屬，共4 種10 株菌。放線菌門有4 個(gè)屬6 株。在所有菌株中，P.corrugate YMF3.02205 和P.rhodesiae YMF3.02254 對(duì)J2 的活性最高（死亡率分別為71.25%和74.63%）、吸引活性也最高（CI 值分別為2.17 和2.46），被選擇用于后續(xù)的GFP 標(biāo)記和盆栽試驗(yàn)。

2.3 2 個(gè)菌株的尼古丁趨化性測(cè)定及GPF 標(biāo)記

如圖4 所示，在滴定測(cè)定法中，P.corrugate YMF3.02205（圖4-A2）、P.rhodesiae YMF3.02254（圖4-A3）向平板中央的化合物趨向性運(yùn)動(dòng)，在添加的尼古丁附近形成明顯的趨化圈；而對(duì)照菌株A.faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 并未形成趨化圈（圖4-A1）。在軟瓊脂法平板法中，P.corrugate YMF3.02205（圖4-B2）、P.rhodesiae YMF3.02254（圖4-B3）從平板中央的接種點(diǎn)向外趨向性運(yùn)動(dòng)而形成明顯的趨化圈；而對(duì)照菌株A.faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 并未形成趨化圈（圖4-B1）。2 種方法的測(cè)定結(jié)果表明P.corrugate YMF3.02205（圖4-A2）、P.rhodesiae YMF 3.02254 對(duì)尼古丁具有趨化性。

圖4 尼古丁趨化性測(cè)定

預(yù)實(shí)驗(yàn)中P.corrugate YMF3.02205、P.rhodesiae YMF3.02254 在含40 μg·mL-1卡那霉素的抗性平板上不能生長(zhǎng)。通過電轉(zhuǎn)化法將攜帶綠色熒光蛋白基因的重組載體pDSK-GFPuv 導(dǎo)入生防菌株中，通過40 μg·mL-1卡那霉素的單抗平板以及熒光顯微鏡下觀察熒光的雙重驗(yàn)證（圖5），成功獲得GFP 基因標(biāo)記的2 株生防菌：P.corrugate YMF3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp。

圖5 2 個(gè)菌株的顯微形態(tài)

2.4 2 個(gè)菌株對(duì)煙草根結(jié)線蟲病的防效

表1 顯示了2 株趨化性生防菌對(duì)煙草根結(jié)線蟲病的防效及其根際定殖能力。從防效上看，P.corrugate YMF3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 對(duì)根結(jié)線蟲病的防效分別為65.5%和67.3%；添加尼古丁40 μmol·L-1時(shí)，2 株生防菌的防效顯著提高，分別為75%和76.9%，但低于化學(xué)藥劑噻唑膦的防效85.1% 。 從根際定殖量上看，P.corrugate YMF 3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 在每克根際土中的生物量分別為0.47×103CFU 和0.54×103CFU；添加尼古丁40 μmol·L-1時(shí)，2 株生防菌的根際定殖量顯著提高，分別為12.17×103CFU 和10.62×103CFU。

表1 2 個(gè)菌株對(duì)煙草根結(jié)線蟲病的防效及其根際生物量

3 討論

生防菌控制病原線蟲的機(jī)制主要包括寄生、捕食、毒殺、拮抗、誘導(dǎo)植物抗性。相對(duì)于線蟲在土壤中的快速和遠(yuǎn)距離移動(dòng)，細(xì)菌的移動(dòng)非常緩慢、距離有限。在長(zhǎng)期進(jìn)化中一些土壤細(xì)菌會(huì)通過產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物吸引線蟲靠近菌體，進(jìn)而毒殺線蟲而獲得營(yíng)養(yǎng)[9，14]；因此能吸引線蟲的生防細(xì)菌作為生防資源更具有開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。然而目前對(duì)線蟲具誘吸活性的生防菌資源發(fā)掘有限。文章報(bào)道了58 株能吸引線蟲的生防細(xì)菌，其分類地位分屬多種分類單元，充分體現(xiàn)了這類資源的物種多樣性。生防菌在根際有效定殖并建立相應(yīng)種群是發(fā)揮其生防功能的先決條件。生防菌在土壤中的萌發(fā)、生長(zhǎng)和定殖嚴(yán)重受到“土壤抑生作用（Soil biostasis）”的影響，進(jìn)而負(fù)面影響其防效和穩(wěn)定性[15]。根結(jié)線蟲病為土傳病害，“生防菌-植物根系-靶標(biāo)線蟲”的互作關(guān)系直接影響生物殺線劑的防效；在這三角互作關(guān)系中，生物趨化性介導(dǎo)的互作不可或缺。趨化性（chemotaxis）泛指生物（如生防細(xì)菌、根結(jié)線蟲J2）感受化學(xué)效應(yīng)子信號(hào)（如誘吸物、趨避物），調(diào)控其運(yùn)動(dòng)行為，進(jìn)而趨近有利環(huán)境或趨離不利環(huán)境的過程[16]。趨化性生防菌對(duì)根系分泌物的趨化對(duì)其根際定殖和發(fā)揮防效至關(guān)重要。植物促生菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在根際定殖時(shí)，首先通過趨化系統(tǒng)感受擬南芥根系分泌物而趨近根系，在接觸根系幾小時(shí)后才產(chǎn)生生物膜分泌細(xì)胞并開始定殖過程[17]。目前，有關(guān)趨化性生防菌趨化根系分泌物的機(jī)制及對(duì)生防菌根際定殖能力和防效的影響認(rèn)識(shí)不足；具有吸引線蟲并趨化根系分泌物的生防菌的生防潛力未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，既能吸引根結(jié)線蟲又能趨化煙草根系分泌物的生防菌Pseudomonas corrugate YMF3.02205 和 P.rhodesiae YMF3.02254 對(duì)煙草根結(jié)線蟲有良好防效（65.5%和67.3%），特別是生防菌與根系分泌物尼古丁配合使用時(shí)能顯著提高其防效和根際定殖力。Ma 等[18]報(bào)道了類似的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)煙草根系分泌物尼古丁作為趨化底物能提高生防菌Pseudomonas aeruginosa NXHG29 的趨化性、根際定殖力和對(duì)煙草黑脛病的防效。韋玉倩等[12]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在菌液中添加40 μmol·L-1尼古丁時(shí)，生防菌Brevibacillus brevis Hs8-19，Br.brevis Hs8-13 和P.tremae Ht3-25 對(duì)煙草黑脛病的防效分別增加了6.11%、4.79%和4.72%。以上研究充分表明，趨化性生防菌是一類重要的生防資源，是研究生防菌與宿主互作的理想材料，也是開發(fā)生防菌劑理想資源，值得加大研發(fā)力度，充分發(fā)揮這類資源在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值。