紅色LED光照下上海青采后硫代葡萄糖苷代謝的變化

孫瑩，郭峰，韓穎，胡花麗，羅淑芬，李鵬霞*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866）（2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇南京 210014）（3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點實驗室，江蘇南京 210014）

上海青（Brassica rapaL subsp.chinensis）屬于十字花科蕓苔蕓薹屬，是普通白菜的一個變種，常見于中國南方地區(qū)，新鮮上海青口感甘甜營養(yǎng)豐富[1]。內(nèi)含維生素、礦物質(zhì)和多酚等營養(yǎng)活性成分，其中硫代葡萄糖苷（硫苷），會被植物本身存在的黑芥子酶和人類的胃腸道微生物菌群轉(zhuǎn)化為異硫氰酸酯（Isothiocyanate，ITC）[2]。大量研究表明異硫氰酸酯為廣譜抗癌天然產(chǎn)物[3]。上海青在采收后，葉片極易產(chǎn)生黃化、萎蔫和腐爛等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，嚴重影響其商品品質(zhì)，縮短其貨架期，上海青在常溫23～25 ℃下貨架期僅為1～2 d[4]。因此，尋求安全有效的上海青營養(yǎng)品質(zhì)提升技術(shù)顯得尤其重要。

有研究表明，微孔包裝可以延緩上海青葉綠素降解，延緩其葉片黃化，并保持較高的多酚含量和抗氧化能力[5]。外源膽固醇處理可以維持上海青中葉綠素和抗壞血酸含量[6]。亞硒酸鈉溶液浸泡結(jié)合氣調(diào)包裝處理能夠保持上海青的感官品質(zhì)并維持抗壞血酸、可溶性固形物及類黃酮等的含量[7]。針對上海青的硫苷代謝，有研究證實，上海青葉柄中的硫苷含量是其葉片的1.54倍[8]。采前向葉片噴灑油菜素內(nèi)酯和多胺可增加上海青脂肪族硫苷和總硫苷的含量，減少其吲哚族硫苷的含量[9]；但乙烯利處理會提高上海青的吲哚族硫苷含量[10]；在采后，用1-MCP處理上海青，其組織中硫苷含量得到了顯著提升[11]。已有研究證實白色LED光照處理可以促進上海青硫苷物質(zhì)的生成[12]。但，有關(guān)上海青葉柄采后硫苷代謝的研究報道仍較少。

LED光照保鮮技術(shù)作為一種新型、高效、安全的物理保鮮手段。具有單色光排放高、壽命長、靈活和機械堅固性等優(yōu)點。因此，LED可用來減少農(nóng)作物的熱損傷和退化，并適用于冷藏應(yīng)用，還可以提農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和營養(yǎng)成分[13]。閆志成[14]證實白色LED光照對上海青進行處理，可以維持其葉綠素含量。Zhou等[15]發(fā)現(xiàn)白色LED光照處理提高了上海青中可溶性蛋白含量，降低了其游離氨基酸含量，延緩了其采后衰老。而其他學(xué)者得出白色LED光照還可維持上海青較高的葉綠素及抗壞血酸含量，減緩其丙二醛的累積[16]。Fan等[17]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段分析出紅藍色LED光照可以減少上海青中亞硝酸鹽的累積。紅色LED光照可以抑制上海青葉綠素降解及相關(guān)基因的表達并促進抗壞血酸合成基因的表達[18]；在此基礎(chǔ)上，結(jié)合氣調(diào)包裝可以減輕丙二醛的積累并維持葉綠素、維生素等物質(zhì)的含量[19]。但紅色LED光照對上海青硫苷代謝的影響機制目前尚不明確。

本實驗以上海青為實驗材料，研究了紅色LED光照處理后的上海青中硫苷代謝合成途徑及降解途徑中關(guān)鍵物質(zhì)、關(guān)鍵酶和關(guān)鍵基因表達的變化，為上海青采后保鮮及營養(yǎng)物質(zhì)的提升提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實驗用上海青于2022年2月18日移栽于江蘇歸來兮生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司蔬菜種植基地大棚，3月21日清晨進行采收，7～8成熟，當天上午運輸至江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院裝備與設(shè)施研究所實驗室內(nèi)。立即挑選出大小、色澤基本一致且無病害及黃化現(xiàn)象的上海青作為實驗材料。

1.1.2 試劑

丙酮、甲醇、無水乙醇、乙酸、活性炭、鄰苯二硫醇、正己烷、葡萄糖、甲酸銨、二氯甲烷、硼酸、鄰苯二硫醇（均為分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘿卜硫苷（Glucoraphanin，GRA）、2-羥基-3-丁烯基硫苷（Progoitrin，PRO）、3-丁烯基硫苷（Gluconapin，GNA）、黑芥子苷（Sinigrin，SIN）、4-甲硫基-丁基硫苷（Glucoerucin，GER）、4-戊烯基硫苷（Glucobrassicanapin，GBN）、蘿卜硫素分析標準品購自美國Sigma-Aldrich公司；3-丁烯基異硫氰酸酯購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；葡萄糖試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 儀器

PL202-L電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1102型紫外可見分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司；雪花制冰機FM40，北京長流科學(xué)技術(shù)公司；A11 Basic型液氮研磨器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；3K15高速冷凍離心機，德國Sigma公司；HH-S系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州萬達升實驗儀器有限公司；Seven Multi pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；QTRAP 6500高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；TSQ 8000 EVO氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，美國Agilent Technologies公司；培清JS-680D全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司。

1.3 實驗設(shè)計與處理

1.3.1 試驗Ⅰ：上海青適宜光照條件篩選

實驗分為9組，具體處理方式如表1所示。挑選18～20顆大小基本一致，無黃化，無病害的上海青放置在LED光照貨架上，并設(shè)置3組平行，模擬超市低溫貨架溫度（15 ℃）下進行光照（黑暗12 h，光照12 h），將對照組進行遮光處理。貯藏至第8天時，通過觀察上海青表型和測定葉片總?cè)~綠素含量，篩選出適宜上海青貯藏的光照條件。

表1 上海青貯藏實驗條件Table 1 Experimental conditions of pakchoi

1.3.2 試驗Ⅱ：紅色光照LED處理對上海青采后硫苷代謝的影響

以實驗Ⅰ篩選的光照條件作為處理組（黑暗12 h，光照12 h），對照組為黑暗處理，置于15 ℃下貯藏。每個處理平行處理15組，每組18～20顆上海青。取樣方式為：各組每2 d隨機選取3個平行進行取樣。取樣部位為：外層5～6層葉片部分，避開主葉脈，葉柄部分去掉根部，并用液氮速凍，速存放于-80 ℃用于指標的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 總?cè)~綠素含量的測定

參考Hu等[20]的方法并稍作修改。取0.2 g上海青粉末，加入10 mL體積分數(shù)為80%丙酮，避光常溫浸提6 h，過濾后取上清液，以體積分數(shù)80%丙酮為空白校零，測定在642和665 nm處提取液的吸光值，重復(fù)測定3次，計算葉綠素含量（mg/g）。

1.4.2 總硫苷含量的測定

根據(jù)韓穎等[21]的方法，并稍做修改。稱取2份上海青粉末樣品各1 g，1份加1.5 mL水，另1份加1.5 mL體積分數(shù)40%酸化甲醇（pH值4.0，HCl調(diào)制），在37 ℃下水浴浸提1 h后，80 ℃水浴浸提5 min，最后均用2 mL 100%甲醇終止反應(yīng)。于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量，硫苷分解生成的葡萄糖的物質(zhì)的量與硫苷的物質(zhì)的量相等，以此計算硫苷物質(zhì)的量。

1.4.3 總異硫氰酸酯含量的測定

根據(jù)Zhang等[22]的方法，并稍做修改。取0.4 g上海青粉末加入0.8 mL蒸餾水混勻，于4 ℃、10 000 r/min下離心15 min，取0.25 mL上清液，加入0.25 mL 100 mmol/L硼酸緩沖溶液（pH值8.5）和0.5 mL 10 mmol/L鄰苯二硫醇溶液，于65 ℃水浴2 h后于365 nm處測定吸光度值。用蘿卜硫素做標曲，根據(jù)標曲計算總異硫氰酸酯的含量。

1.4.4 黑芥子酶活性的測定

根據(jù)趙歡歡等[23]的方法，并稍做修改。取1 g上海青粉末加入2 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.5），于4 ℃、10 000 r/min下離心15 min，上清液即為粗酶液。取0.6 mL粗酶液，加入0.2 mL 2 mmol/L的黑芥子苷溶液，混勻，37 ℃水浴15 min，然后置于沸水浴中反應(yīng)5 min以停止反應(yīng)。采用葡萄糖試劑盒檢測葡萄糖含量，以每分鐘生成1 nmol葡萄糖為1個酶活，比活度以鮮重U/g表示。

1.4.5 硫苷物質(zhì)含量的測定

樣品制備：參照Luo等[24]的方法略有修改，稱取1 g上海青粉末加入2 mL體積分數(shù)75%甲醇，80 ℃水浴20 min，冷卻至4 ℃后于10 000 r/min下離心15 min，取上清液，過0.22 μm有機相濾膜，經(jīng)LC-20液相色譜串聯(lián)TripleTOF? 5600+飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀鑒定。根據(jù)在全掃描模式下確定的m/z值和在MS2模式下觀察到的碎片信息，與相應(yīng)的標準品質(zhì)譜信息或參考文獻質(zhì)譜信息比對進行硫苷鑒定。鑒定后其中GRA、GNA、GBN、GBR采用標準曲線法進行定量，其中4-羧基-吲哚-3-亞甲基硫苷（4-Hydroxy Glucobrassicin，4HGBS）、4-甲氧基-吲哚-3-亞甲基硫苷（4-Methoxy Glucobrassicin，4MGBS）和1-甲氧基-吲哚-3-亞甲基硫苷（Neoglucobrassicin，NGBS）以其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)GBR的標準曲線進行計算，其他以黑芥子苷為內(nèi)標，采取內(nèi)標法校正因子計算。

1.4.6 硫苷水解產(chǎn)物鑒定和測定

樣品提?。簠⒄誎lopsch等[25]的方法，略作修改。取1 g上海青粉末加入2.5 mL去離子水，于37 ℃水浴條件下水解3 h，加入2 mL二氯甲烷萃取2次，4 ℃、10 000 r/min下離心15 min離心后，取下清液，氮吹至300 μL，過0.22 μm有機濾膜，采用GC-MS定性及定量。

1.4.7 上海青葉柄總RNA的提取及cDNA的合成

RNA提取：上海青葉柄總RNA的提取按照Plant Total RNA Isolation Kit Plus（成都福際生物技術(shù)有限公司提供）要求完成。cDNA的合成：上海青葉柄cDNA的合成按照First Strand cDNA Synthesis Kit（由Thermo Scientific Revert Aid提供）操作?？傮w系20 μL，總RNA 500 ng，GoldenstarTMRandomer 1 μL，5×GoldenstarTM Buffer 4 μL，dNTP Mix 1 μL，DTT 1 μL，GoldenstarTM RT6 1 μL，RNase-free water補足至20 μL。之后于25 ℃反應(yīng)10 min，55 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 min后置于-80 ℃冰箱備用。

1.4.8 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，RT-q PCR）分析

RT-qPCR分析：內(nèi)參基因為Actin，目的基因為：MYB28、CYP83A1、UGT74C1、FMOGS-OX5、GGP1、SUR1、AOP2等。引物序列運用Primer 5.0軟件進行設(shè)計，最終由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列詳細信息見表2，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TliRNaseH Plus）要求完成?？偡磻?yīng)體系20 μL，包括2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）10 μL，PCR Forward Primer 0.60 μL，PCR Reverse Primer 0.60 μL，DNA模板1 μL，ddH2O（滅菌蒸餾水）7.8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，30 s，1個循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for real time-qPCR

1.4.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為對同一處理組3個平行中的樣品分別測定后，所得數(shù)據(jù)取平均值±標準差表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行分析，顯著性采用ANOVA進行鄧肯氏多重差異分析，P＜0.05表示差異顯著。用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同顏色和光密度LED光照處理下對上海青表型及總?cè)~綠素含量的影響

如圖1所示，在貯藏8 d時，對照組中上海青葉片已出現(xiàn)明顯黃化；經(jīng)過不同顏色和光密度的LED光照處理的上海青中，除紅光處理組外的其他處理組（藍光、綠光和白光）上海青葉片均已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的黃化現(xiàn)象，紅光處理組僅出現(xiàn)輕微黃化，其中光密度為3.25 μmol/(m2·s)的紅光處理組較6.5 μmol/(m2·s)的紅光處理而言，其葉片黃化更明顯。

圖1 不同光照條件處理對上海青表型的影響Fig.1 Effects of different condition of light emitting diode (LED)irradiation on phenotype of pakchoi

由圖2可知，不同顏色和光密度LED光照處理后的上海青葉片總?cè)~綠素含量的變化不一致，可以看出紅光處理的上海青葉片總?cè)~綠素含量顯著高于其他處理組，其中6.5 μmol/(m2·s)的紅光處理組顯著高于3.25 μmol/(m2·s)的紅光處理（P＜0.05）。與本實驗結(jié)果類似，Song等[18]也發(fā)現(xiàn)紅色LED光照可以有效保持上海青的采后品質(zhì)，并且延緩上海青的葉片中葉綠素的降解。因此，結(jié)合表型分析，本實驗后續(xù)選取光密度6.5 μmol/(m2·s)的紅光對上海青進行處理。

圖2 不同顏色和密度LED光照處理對上海青葉片總?cè)~綠素含量的影響Fig.2 Effects of different condition of LED irradiation on total chlorophyll content in pakchoi leaves

2.2 紅色LED光照對上海青表型的影響

如表3所示，對照組在貯藏第4天葉片已經(jīng)出現(xiàn)輕微黃化現(xiàn)象，在第6天葉片出現(xiàn)了明顯黃化，在貯藏第8天葉片已嚴重黃化，失去商品價值。而紅光處理組上海青在貯藏第6天仍保持較好的色澤，在第8天時葉片僅出現(xiàn)輕微黃化現(xiàn)象。由此可見，紅色LED光照處理可以延緩上海青的黃化進程，保持其品質(zhì)。

表3 紅色LED光照處理對上海青表型的影響Table 3 Effect of red LED irradiation treatment on the phenotype of pakchoi

2.3 紅色LED光照處理對上海青總硫苷、總異硫氰酸酯含量以及黑芥子酶活性的影響

上海青中含有與抗癌相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)硫苷，在正常情況下，硫苷物質(zhì)較為穩(wěn)定，但隨著貯藏時間的延長，植物組織逐漸衰老，細胞受到破壞，硫苷與黑芥子酶接觸，從而造成了硫苷水解，生成活性物質(zhì)異硫氰酸脂等物質(zhì)。在本實驗中，如圖3a所示，在貯藏期間上海青葉柄中紅光處理組總硫苷含量在第2天下降，在第4天顯著上升，隨后逐漸下降，對照組上海青葉柄總硫苷含量在第2天上升，隨后持續(xù)下降。由此，對照組總硫苷含量雖然在第2天顯著高于紅光處理組（P＜0.05），但在貯藏4～8 d期間，顯著低于紅光處理組（P＜0.05），此時，紅光處理組總硫苷含量為對照組的1.62～1.99倍。如圖3b所示，上海青葉片中總硫苷的含量整體呈下降趨勢。并在整個貯藏期間，紅光處理組顯著高于對照組（P＜0.05），是對照組的1.69～4.65倍?？梢姡t色LED光照可以延緩上海青貯藏期間總硫苷含量的流失，類似地，Mao等[26]得出紫外線處理也可以有效延緩上海青中總硫苷的損失。

Wang等[27]發(fā)現(xiàn)紅色LED光照可以顯著提升西蘭花幼苗中總異硫氰酸酯的含量。本實驗中，圖3c結(jié)果顯示，在貯藏期間，對照組上海青葉柄中總異硫氰酸酯含量總體波動不大，但紅光處理組在貯藏2～4 d內(nèi)出現(xiàn)了明顯上升，且在整個貯藏期間顯著高于對照組（P＜0.05）。圖3d顯示，上海青葉片中總異硫氰酸酯波動不大，在貯藏前期對照組總異硫氰酸酯含量高于處理組，但在貯藏4～8 d內(nèi)是紅光處理組的77.43%～91.98%。由此可見，紅色LED光照處理可以顯著提高上海青中總異硫氰酸酯的含量。

如圖3e所示，隨著貯藏時間的延長，上海青葉柄中黑芥子酶活性總體呈下降趨勢，但對照組波動變化較大。在貯藏的第2、6、8天，對照組上海青中黑芥子酶活性分別為紅光處理組的51.11%、43.42%和23.54%。如圖3f所示，上海青葉片中黑芥子酶的活性呈下降趨勢，對照組黑芥子酶活性雖在貯藏第2天顯著高于紅光處理組（P＜0.05），但紅光處理組在貯藏4～8 d下降速度小于對照組，且在此期間顯著高于對照組（P＜0.05），尤其在第6天時，高于對照組459.65%?？梢?，紅色LED光照總體上可以維持上海青中相對較高的黑芥子酶活性，這可能是造成紅色LED光照處理的上海青在中異硫氰酸酯含量較高的主要原因[18]。

綜上，上海青葉柄中硫苷及異硫氰酸酯含量分別為葉片的2.72倍和1.32倍，與本實驗結(jié)果類似，Zhu等[8]也發(fā)現(xiàn)上海青葉柄中硫苷含量較葉片中更高。因此，本文后期主要關(guān)注上海青葉柄中硫苷代謝的變化。

2.4 上海青葉柄中的硫苷單體的鑒定

表4顯示，上海青中主要含有11種硫苷，分別為脂肪族6種：GRA、GIB、PRO、GNA、GBN、GAL。芳香族1種：GNS。吲哚族4種：4MGBS、4HGBS、NGBS、GBR；其中，含量最高為GNA，占上海青葉柄的72.45%，其次為GBN占上海青葉柄的11.22%。類似地，Wiesner等[28]也得出上海青中的主要硫苷物質(zhì)為GNA，但其含量占總硫苷的66.69%，這可能是品種差異造成。本研究后期主要關(guān)注上海青葉柄中含量大于0.01 μmol/g的硫苷單體含量變化情況，如GNA、GBN、4MGBS、4HGBS、PRO、NGBS等。

表4 上海青葉柄中硫苷物質(zhì)鑒定信息Table 4 Identification of glucosinolate profiles in pakchoi petiole

2.5 紅色LED光照處理對上海青葉柄硫苷單體含量的影響

上海青中主要的硫苷組分為脂肪族硫苷，而吲哚族硫苷與芳香族硫苷含量都較少，大部分上海青中脂肪族硫苷占硫苷總含量80%以上[29]。與本實驗中硫苷單體鑒定結(jié)果一致，上海青中脂肪族硫苷含量占總硫苷含量的86.73%。如表5所示，在貯藏期間上海青中各種硫苷均呈下降趨勢。上海青葉柄中的主要硫苷GNA和GBN經(jīng)紅色LED光照處理后呈先降低后升高然后緩慢降低的趨勢，且在貯藏的第4、6、8天紅光處理組顯著高于對照組（P＜0.05）。對照組中另一個含量較高的單體PRO含量波動不大，紅光處理組呈先快速升高后緩慢下降的趨勢，且在貯藏的第2～6天顯著高于對照組（P＜0.05）。但紅色LED光照處理對NGBS、4MGBS、4HGBS和GBR含量的影響并不顯著。有相似研究[27]指出，光照處理可顯著提升果蔬中硫苷物質(zhì)的含量，如紅色LED光照處理可以提高西蘭花中蘿卜硫苷等主要硫苷物質(zhì)的含量；Demir等[30]發(fā)現(xiàn)紅色LED光照能促進蘿卜中蘿卜硫苷等主要硫苷物質(zhì)的積累。本實驗中，紅色LED光照能有效維持上海青葉柄中主要硫苷物質(zhì)的含量。

表5 紅色光照LED處理對上海青葉柄中硫苷物質(zhì)含量的影響(μmol/g)Table 5 Effect of red LED irradiation on the content of glucosinolate substances in pakchoi petiole (μmol/g)

2.6 紅色LED光照處理對上海青葉柄硫苷水解產(chǎn)物含量的影響

Zeng等[31]已發(fā)現(xiàn)，上海青中的異硫氰酸酯主要為3-丁烯基異硫氰酸酯（GNA的水解產(chǎn)物）。與其結(jié)果一致，本文得出上海青葉柄和葉片中主要的硫苷水解產(chǎn)物為3-丁烯基異硫氰酸酯，其母離子為113.00，子離子為113.02、85.94、72.01、62.98、45.11、30.11，含量約為0.12 μmol/g。經(jīng)紅光處理后（圖4），上海青葉柄中該物質(zhì)含量呈先升高后下降的趨勢，且總體維持在較高水平，但對照組3-丁烯基異硫氰酸酯含量在貯藏期間呈逐漸下降趨勢。其原因可能是紅色LED光照處理維持了上海青中較高的黑芥子酶活性，從而促進了硫苷物質(zhì)的水解，由此造成了3-丁烯基異硫氰酸酯的積累。

圖4 紅色LED光照處理對上海青葉柄中3-丁烯基異硫氰酸酯含量的影響Fig.4 Effect of red LED irradiation on content of 3-butenyl isothiocyanate in pakchoi petiole

2.7 紅色LED光照處理對上海青葉柄硫苷合成相關(guān)基因表達的影響

硫苷在合成過程中一系列反應(yīng)都由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，MYB家族是植物轉(zhuǎn)錄因子最大家族之一，MYB28作為脂肪族硫苷合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[9]。CYP家族可以將細胞色素P450催化為乙醛肟，為硫苷合成的第一步，其中基因CYP83A1可以催化脂肪族的乙醛肟[32]。圖5為上海青在貯藏期間脂肪族硫苷合成相關(guān)基因表達水平的變化，結(jié)果得出，MYB28的表達水平在貯藏時間呈總體下降趨勢，且紅光處理組在貯藏期間顯著高于對照組（P＜0.05），尤其在貯藏的第4天和第6天，紅光處理組MYB28的表達水平分別是對照組的28.97和11.71倍?；駽YP83A1（圖5b）和GSTF11（圖5c）的表達水平在經(jīng)過紅光處理后呈先上升后下降的趨勢，而對照組中其表達量整體下降，由此在整個貯藏期間，對照組CYP83A1和GSTF11的表達水平皆顯著低于紅光處理組（P＜0.05）。基因UGT74C1（圖5d）的表達水平在貯藏期間呈逐漸下降趨勢，但紅光處理組下降幅度小于對照組，且在整個貯藏期間顯著高于對照組UGT74C1的表達水平（P＜0.05）。作為硫苷合成的最后一步，不同的基因位點參與硫苷合成的側(cè)鏈修飾，決定了硫苷結(jié)構(gòu)的多樣性[33]。而FMO家族在脂肪族硫苷合成中起關(guān)鍵作用，參與了脂肪族硫苷的合成，本研究中FMOGS-OX5（圖5e）的表達水平呈先下降后逐漸上升的趨勢，且紅光處理顯著上調(diào)了上海青中FMOGS-OX5的表達量（P＜0.05）。有相似研究表明，藍色LED光照處理通過上調(diào)上海青中基因CYP83A1、UGT74C1、GSTF11的表達量來維持上海青中GNA和GBN的含量[34]。因此我們推測，在本實驗中，紅色LED光照處理可能主要通過上調(diào)CYP83A1、UGT74C1、GSTF11和FMOGS-OX5等基因的表達水平來促進上海青中脂肪族硫苷物質(zhì)合成，進而維持上海青葉柄中總硫苷物質(zhì)的含量。

圖5 紅色LED光照處理對上海青葉柄中硫苷合成相關(guān)基因表達水平的影響Fig.5 Effect of red LED light treatment on the expression level of aliphatic glucosinolate synthesis genes in pakchoi petiole

圖5f和圖5g結(jié)果顯示，除貯藏第2天外，紅光處理顯著下調(diào)了上海青脂肪族合成通路中的關(guān)鍵基因GGP1和SUR1的表達水平（P＜0.05）。其原因可能是，基因CYP83A1的過量表達限制了基因SUR1的表達[35]，而基因GGP1不僅參與硫苷代謝還參與降解谷胱甘肽[36]，因此，我們推測GGP1的表達主要受上海青中谷胱甘肽降解的影響。同樣地，GNA和PRO合成關(guān)鍵基因AOP2（圖5h）的表達量雖在貯藏前6天被紅光處理顯著上調(diào)（P＜0.05），但在第8天，對照組高出紅光處理組143.40%?？赡苁怯捎谏虾Ｇ嘟M織中生成的異硫氰酸酯抑制了AOP2的表達[37]。

因此，紅色LED光照處理可能主要通過上調(diào)上海青硫苷合成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MYB28的表達水平來誘導(dǎo)其脂肪族合成關(guān)鍵基因CYP83A1、UGT74C1、GSTF11和FMOGS-OX5等的上調(diào)來促進GNA、GBN和PRO的合成，但對AOP2的表達水平的影響不穩(wěn)定。

3 結(jié)論

綜上，紅色LED光照處理提高了硫苷合成相關(guān)基因MYB28、CYP83A1、GSTF11、UGT74C1等的表達水平，促進了其主要硫苷物質(zhì)GNA、PRO和GBN等的合成，由此維持了上海青中總硫苷的含量；此外，紅色LED光照處理還維持了上海青中較高的黑芥子酶活性，促進了硫苷的水解，由此保持了上海青中主要異硫氰酸酯3-丁烯基異硫氰酸酯的含量。因此，紅色LED光照處理可通過調(diào)控上海青中硫苷合成關(guān)鍵基因和黑芥子酶活性來保持其較高的硫苷和異硫氰酸酯含量，使其在采后仍能保持較高的營養(yǎng)和商業(yè)價值，并為上海青的采后保鮮提供理論及技術(shù)支持。