GⅡ.4型諾如病毒VP2蛋白生物信息學(xué)分析

林鵬，黃玉雯，李學(xué)鵬，勵建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，渤海大學(xué)海洋研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013）

諾如病毒（Norovirus，NoV）曾稱諾瓦克病毒（Norwalk Viruses），隸屬于杯狀病毒科（Caliciviridae），諾如病毒屬（Norovirus）成員，是一種單股正鏈RNA病毒。1968年美國俄亥俄州諾沃克市暴發(fā)了NoV感染，隨后世界各地相繼發(fā)現(xiàn)該病毒的其它亞型[1]。NoV基因組包含三個開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs），其中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白（VP1），ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白（VP2）[2]。近年來由于新的流行毒株出現(xiàn)，根據(jù)VP1蛋白的氨基酸序列和ORF1的RNA依賴RNA聚合酶（RdRp）區(qū)的核苷酸多樣性，分為不同的基因群和P群，進一步將NoV分為10個基因群（GI-GX）和不同的P型，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ、GVIII和GIX基因群主要感染人類，被通稱為人源諾如病毒（Human Norovirus，HuNoV）[3]。根據(jù)流行病學(xué)研究表示，HuNoV是引起流行性、自限性急性胃腸炎的主要病原體之一，約占所有急性胃腸炎病例的五分之一[4]。對健康的成人來說，NoV引起一種急性自限性的胃腸道感染；但在老年人、兒童和免疫功能低下的患者中NoV則會造成較高的發(fā)病率和死亡率[5]。NoV感染的主要傳播為糞便-口途徑，主要由于食用含有NoV的食品，以生食貝類或者食用加熱不徹底的貝類最為常見[6]。全年均可發(fā)生，但多發(fā)生在秋冬季節(jié)[7]。自2013年以來，我國每年因NoV引起的急性胃腸炎病例逐年遞增，其主要臨床表現(xiàn)為腹瀉和嘔吐等[8]。NoV具有較強的感染性，且目前暫無特效藥物。因此，由NoV引起的食品安全問題亟待關(guān)注。

NoV目前主要的流行毒株包括GⅠ.3、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.13和GⅡ.17型，這些基因型很容易產(chǎn)生新的突變，且新的突變型通常具有更強的傳染性和變異性[9]。在過去的30年中，GⅡ.4型占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致了大約70% NoV的暴發(fā)[10]。有證據(jù)表明，每2~3年GⅡ.4型都會出現(xiàn)一種新的變異株[11]。目前GⅡ.4型主要有六種流行變異株，分別為Grimsby 1995、Farmington Hills 2002、Hunter 2004、Den Haag 2006b、New Orleans 2009和Sydney 2012[12]。

VP2蛋白作為NoV次要結(jié)構(gòu)蛋白，可以和VP1蛋白組成NoVs病毒顆粒[13]；然而，VP2蛋白對于病毒顆粒不是必需的，主要對病毒的穩(wěn)定性和衣殼化起到非常重要的作用[14,15]。有研究表明，VP2蛋白和VP1蛋白相互作用可促進衣殼蛋白的表達，進而影響NoV的復(fù)制[16,17]。NoV VP2蛋白具有較高的突變性，在不同毒株的NoV可能起到不同的生物學(xué)作用[18]。

NoV已被公認為是最主要的病毒性胃腸病原體之一，影響著全世界各個年齡段的數(shù)億人，造成每年全球直接經(jīng)濟損失為42億美元，社會經(jīng)濟損失603億美元[19,20]。因此，研究NoV具有非常重要的現(xiàn)實意義。但目前關(guān)于NoV流行毒株VP2蛋白研究相對較少，對其生物學(xué)作用了解不夠全面，不能對NoV VP2蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等提供有效的參考[21]。本研究采用生物信息學(xué)對NoV流行毒株VP2蛋白結(jié)構(gòu)與功能進行預(yù)測，為進一步研究VP2蛋白功能及開發(fā)亞單位疫苗提供理論支持，以此為解決由NoV引起的食品安全問題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 毒株序列

GⅡ.4 LN-2021-18毒株VP2基因序列由本實驗室分離病毒測序。

1.2 參考毒株序列

綜上所述根據(jù)目前主要的NoV流行毒株，選取以下12株進行分析[9-12]。NoV GI.3 Nashville 2016毒株（GenBank：MK073893.1）；NoV GⅡ.2 Japan 2020毒株（GenBank：LC646332.1）；NoV GⅡ.3 AnnArbor 2016毒株（GenBank：MK073886.1）；NoV GⅡ.4 Tokyo 2021毒株（GenBank：LC699541.1），NoV GⅡ.4 Sydney 2016毒株（GenBank：MK073885.1），NoV GⅡ.4 Sydney 2012毒株（GenBank：KU678201.1），NoV GⅡ.4 Johannesburg 2009毒株（GenBank：KP784691.1），NoV GⅡ.4 Den Haag 2006b毒株（GenBank：KM245071.1），NoV GⅡ.4 Hong Kong 2004毒株（GenBank：HM802551.1），NoV GⅡ.4 Houston 2002毒株（GenBank：EU310927.1）；NoV GⅡ.13 USA 2010毒株（GenBank：JN899242.1）；NoV GⅡ.17 CN 2014毒株（GenBank：KU757047.1）。

1.3 實驗方法

1.3.1 VP2蛋白序列分析

使用MEGA 6.05軟件對VP2蛋白的氨基酸序列進行分析比對，采用Neighbor-joining法構(gòu)建VP2蛋白進化樹。

1.3.2 VP2蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測

使用在線軟件ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測VP2蛋白的帶電荷氨基酸數(shù)量、不穩(wěn)定系數(shù)、平均吸水系數(shù)、相對分子質(zhì)量、氨基酸組成及等電點；進一步使用ProtScale在線軟件（https://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測VP2蛋白的親疏水性。

1.3.3 VP2蛋白磷酸化位點和糖基化位點的預(yù)測

在線軟件NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測VP2蛋白的潛在磷酸化位點；在線軟件NetOGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測VP2蛋白的潛在糖基化位點。

1.3.4 VP2蛋白跨膜區(qū)及信號肽的預(yù)測

在線軟件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測VP2蛋白的跨膜區(qū)；在線軟件SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）預(yù)測VP2蛋白的信號肽。

1.3.5 VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

在線軟件PSIRED Workbench（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測VP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.6 VP2蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用在線軟件Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi? id=index）建立VP2蛋白的空間構(gòu)象，并進行高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

1.3.7 VP2蛋白潛在抗原表位的預(yù)測

在線軟件Predicting Anti-genic Peptides（http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl#:~:text=Ant igenic%20peptides%20are%20determined%20using%20 the%20method%20of,The%20reported%20accuracy%20 of%20 method%20is%20about%2075% 25.）預(yù)測VP2蛋白的抗原決定簇；使用在線軟件ABCpred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）預(yù)測VP2蛋白的潛在B細胞抗原表位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0軟件進行分析，結(jié)果以平均值表示。

3 結(jié)果分析

3.1 VP2蛋白進化樹構(gòu)建

進化樹構(gòu)建結(jié)果顯示GⅡ.4 LN-2021-18與GⅡ.4 Sydney 2016毒株位于同一個小分支，親緣關(guān)系最近；GⅠ.3 Nashville 2016、GⅡ.2 Japan 2020、GⅡ.3 AnnArbor 2016、GⅡ.13 USA 2010和GⅡ.17 CN 2014同屬于一個大分支（圖1）。

圖1 NoV VP2蛋白的進化樹分析結(jié)果Fig.1 Evolutionary tree analysis result of NoV VP2 protein

3.2 VP2蛋白的理化性質(zhì)

使用ProtScale在線軟件預(yù)測NoV流行毒株VP2蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示NoV VP2蛋白均為親水蛋白（圖2）；NoV VP2蛋白的平均等電點為10.47，平均吸水系數(shù)為-0.47，平均不穩(wěn)定系數(shù)為47.91，堿性氨基酸平均含量為11.60%；其中GI.3 Nashville 2016毒株VP2蛋白的平均吸水系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)和堿性氨基酸含量較低，分別為-0.27、42.13和9.30%；GⅡ.17 CN 2014毒株VP2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)較高為56.74。NoV流行毒株VP2蛋白具體理化性質(zhì)（表1）。

表1 NoV流行毒株VP2蛋白的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of VP2 protein of NoV epidemic strains

圖2 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的親疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.2 Hydrophobicity prediction results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

3.3 VP2蛋白磷酸化位點和糖基化位點

NetPhos 3.1 Server和NetOGlyc 1.0 Server分別預(yù)測VP2蛋白潛在的磷酸化位點和糖基化位點。結(jié)果顯示，NoV VP2蛋白含有多個磷酸化位點（圖3）和糖基化位點（圖4）。NoV VP2蛋白潛在的磷酸化位點平均為43個和糖基化位點平均存在2個（表2）；8種GⅡ.4亞型毒株在第20、92、132、160、163、167、175、180、184、190、193、199、209、219、225、226、228、229、230、235、244和266位存在共同絲氨酸位點，第71、94、114、124、176、194、222、236和251位存在共同蘇氨酸位點，第116位存在共同酪氨酸位點；GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.13、GⅡ.17型毒株在第20、81、168和171位存在共同絲氨酸位點，第103和121位存在共同蘇氨酸位點；GⅠ.3、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.13、GⅡ.17型毒株在第81位有共同絲氨酸位點。除GⅡ.4 Hong Kong 2004，其余7種GⅡ.4型毒株均在第171位存在糖基化位點。

表2 NoV流行毒株VP2蛋白的磷酸化位點和糖基化位點Table 2 Phosphorylation sites and glycosylation sites of VP2 protein of NoV epidemic strains

圖3 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction results of phosphorylation sites of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

圖4 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白糖基化位點預(yù)測結(jié)果Fig.4 Prediction results of glycosylation sites of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

3.4 VP2蛋白跨膜區(qū)及信號肽的預(yù)測

TMHMM Server v.2.0和SignalP5.0 Server在線軟件分別預(yù)測VP2蛋白是否存在跨膜區(qū)和信號肽。結(jié)果顯示，大多數(shù)NoV流行毒株VP2蛋白無跨膜區(qū)和信號肽（圖5a和圖6a）；然而GⅠ.3毒株VP2蛋白有跨膜區(qū)和信號肽（圖5b和圖6b）。

圖5 VP2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果Fig.5 Prediction results of transmembrane domain of VP2 protein

圖6 VP2蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.6 Prediction results of signal peptide of VP2 protein

3.5 VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

采用PSIPRED軟件預(yù)測NoV流行毒株VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)主要形式，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)所有VP2蛋白結(jié)構(gòu)相似（圖7）；同時利用SOPMA預(yù)測VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)主要形式的含量，預(yù)測結(jié)果顯示NoV流行毒株VP2蛋白中α-螺旋（藍色）平均占比38.17%、延伸鏈（紅色）平均占比7.45%、β轉(zhuǎn)角（綠色）平均占比6.25%、無規(guī)則卷曲（紫色）平均占比48.13%（圖8和表3）；進一步分析發(fā)現(xiàn)GⅠ.3 Nashville 2016毒株VP2蛋白以α-螺旋為主，其余12種蛋白均以無規(guī)則卷曲為主。無規(guī)則卷曲較為松散且易發(fā)生扭曲盤旋并暴露在蛋白質(zhì)表面，較易成為抗原表位。

表3 NoV流行毒株VP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)Table 3 Secondary structure results of VP2 protein of NoV epidemic strains

圖7 PSIPRED軟件預(yù)測的GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.7 Secondary structure results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein measured on PSIPRED software

圖8 SOPMA軟件預(yù)測的GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein measured on SOPMA software

3.6 VP2蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過在線網(wǎng)站Phyre2對NoV流行毒株VP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析。預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP2蛋白最高的置信度為56.70%，蛋白質(zhì)的覆蓋率為10%。其中GⅡ.3毒株、GⅡ.4 Tokyo 2021毒株、GⅡ.4 Hong Kong 2004毒株、GⅡ.4 Sydney 2016毒株和GⅡ.4 LN-2021-18毒株相似（圖9a）；GⅠ.3毒株、GⅡ.13毒株和GⅡ.17毒株相似（圖9b）；GⅡ.2毒株（圖9c）；GⅡ.4 Houston 2002毒株和GⅡ.4 Johannesburg 2009毒株相似（圖9d）；GⅡ.4 Den Haag 2006b毒株和GⅡ.4 Sydney 2012毒株相似（圖9e）。

圖9 VP2蛋白三級結(jié)構(gòu)空間模型預(yù)測結(jié)果Fig.9 Prediction results of tertiary structure spatial model of VP2 protein

3.7 VP2蛋白潛在抗原表位的預(yù)測

抗原決定簇是蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域，一般由6~12個氨基酸或碳水基團組成。采用Predicting Anti-genic Peptides軟件預(yù)測NoV VP2蛋白的抗原表位，結(jié)果顯示VP2蛋白平均存在8個抗原決定簇；其中GⅡ.4 LN-2021-18毒株VP2蛋白存在9個抗原決定簇，即第4~23位、第41~57位、第81~88位、第146~152位、第161~171位、第184~193位、第216~223位、第230~240位和第253~259位，見表4。

表4 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白抗原決定簇的預(yù)測結(jié)果Table 4 Prediction results of antigen determinants of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

進一步采用ABCpred預(yù)測結(jié)果顯示，NoV流行毒株VP2蛋白平均存在25個B細胞抗原表位；其中GⅡ.4 LN-2021-18存在26個B細胞抗原表位，分別為第110~125位、第171~186位、第240~255位等，具體表位及序列，見表5。

表5 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白潛在B細胞抗原表位的預(yù)測結(jié)果Table 5 Prediction results of potential B cell epitopes of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

4 討論

本研究通過生物信息學(xué)方法對NoV GⅡ.4型流行毒株VP2蛋白的等電點進行預(yù)測，結(jié)果顯示：VP2蛋白的平均等電點為10.47。等電點可以用來分離沉淀蛋白，相比于傳統(tǒng)的等電點測定方法，生物信息學(xué)方法更加簡便、快速[22]。VP2蛋白中含量最高的氨基酸是絲氨酸，其次是丙氨酸；預(yù)測所獲得的VP2蛋白分子質(zhì)量可用于VP2蛋白的分離和提純。

蛋白質(zhì)磷酸化可以將外源刺激轉(zhuǎn)化為內(nèi)源的信號，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制[23]。隨著蛋白質(zhì)磷酸化研究的深入，生物信息學(xué)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)已經(jīng)成為磷酸化蛋白質(zhì)組研究中重要的基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的磷酸化位點測定方法相比，生物信息學(xué)可以更快更方便的對蛋白磷酸化位點預(yù)測。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)NoV流行毒株VP2蛋白平均存在43個磷酸化位點（表2）。根據(jù)預(yù)測獲得的VP2蛋白磷酸化位點可用于更深入的研究VP2蛋白對NoV的作用。此外有研究表明，病毒蛋白的磷酸化位點可能與其核定位信號和/或出核信號有關(guān)，這為研究NoV VP2蛋白的入核和出核提供了理論基礎(chǔ)[24]。

之前的研究表明α-螺旋和β-折疊位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，較難形成抗原決定簇[25]。其中α-螺旋還可以與刺突蛋白結(jié)合，從而進行病毒檢測、中和抗體分析和治療[26]。無規(guī)則卷曲多位于蛋白質(zhì)外側(cè)，可以折疊和扭轉(zhuǎn)，因此無規(guī)則卷曲區(qū)域產(chǎn)生抗原決定簇的概率更高[27]。NoV流行毒株VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，α-螺旋占比38.17%、延伸鏈占比7.45%、β轉(zhuǎn)角占比6.25%、無規(guī)則卷曲占比48.13%。VP2蛋白無規(guī)則卷曲所占比例最高，這表示其產(chǎn)生抗原決定簇區(qū)域的概率也比較高。根據(jù)預(yù)測獲得的VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)可為NoV疫苗的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

B細胞主要介導(dǎo)體液免疫和細胞免疫，可以識別多種抗原和抗原裂解后的空間構(gòu)象[28]。研究表明NoV疫苗可以誘導(dǎo)B細胞免疫反應(yīng)，因此B細胞抗原表位的預(yù)測顯得尤為重要[29]。使用ABCpred在線軟件進行預(yù)測，得出NoV流行毒株VP2蛋白最優(yōu)潛在B細胞抗原表位平均為25個。在目前的研究中，從NoV結(jié)構(gòu)蛋白預(yù)測到與B細胞結(jié)合的抗原表位，發(fā)現(xiàn)可能與B細胞相互作用并啟動免疫反應(yīng)的潛在表位，以此誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫[30]。根據(jù)預(yù)測獲得的B細胞抗原表位可為開發(fā)基于NoV VP2蛋白的疫苗提供依據(jù)。

NoV VP2蛋白的基本性質(zhì)和其在病毒顆粒內(nèi)部的位置決定了它能夠與VP1蛋白相互作用而穩(wěn)定病毒樣顆粒，同時發(fā)現(xiàn)GⅡ.4 VP2蛋白會對病毒RdRp活性造成影響[31,32]。早期研究發(fā)現(xiàn)，VP2蛋白可以提高VP1蛋白的穩(wěn)定性及其表達水平，并且通過免疫共沉淀等技術(shù)驗證了VP2蛋白上第108~152個氨基酸可能是與VP1蛋白相互作用的位點[33,34]。利用酵母雙雜交技術(shù)等實驗表明了GⅡ.4 VP2蛋白與VP1蛋白在病毒進化中共存，且VP2蛋白序列的可變性可能是功能驅(qū)動的[35]。這些研究表明VP2蛋白在NoV中發(fā)揮著重要作用，對其進行生物信息學(xué)分析可以對NoV的預(yù)防提供一種新思路。

5 結(jié)論

本研究基于軟件分析預(yù)測，當(dāng)前NoV流行毒株GⅡ.4 VP2蛋白有如下特征：（1）為穩(wěn)定的親水性蛋白，平均等電點10.47、吸水系數(shù)-0.47、不穩(wěn)定系數(shù)47.91、堿性氨基酸含量11.60%。（2）平均存在43個蛋白質(zhì)磷酸化位點和2個糖基化位點；除GⅠ.3型NoV外，大多數(shù)毒株不存在跨膜蛋白和信號肽。（3）VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)主要形式平均含量分別為α-螺旋38.17%、延伸鏈7.45%、β轉(zhuǎn)角6.25%、無規(guī)則卷曲48.13%；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型的蛋白覆蓋率為56.70%；平均存在8個潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇和25個B細胞抗原表位。本文預(yù)測的NoV流行毒株GII.4 VP2蛋白的理化性質(zhì)為深入研究VP2蛋白功能提供理論參考，同時二級、三級結(jié)構(gòu)和抗原表位的預(yù)測也為研制基于VP2蛋白的NoV疫苗提供理論基礎(chǔ)。這為解決由NoV引起的食品安全問題提供了新的思路。