復方當歸注射液對牛蛙坐骨神經- 腓腸肌活動的影響研究

張云博，劉雨娟

（河西學院醫(yī)學院，甘肅 張掖 734000）

肌肉和運動神經纖維，通過研究電流刺激參數和骨骼肌收縮反應的關系，為臨床治療肌萎縮及運動神經纖維損傷提供實驗理論依據[3-4]。制備牛蛙離體腓腸肌標本的手術操作步驟簡單，室溫條件下用任氏液防止組織干燥就能保持其興奮性。因此，本文以牛蛙離體坐骨神經- 腓腸肌標本為研究對象，觀察在不同強度、頻率的電流刺激下，復方當歸注射液對牛蛙離體腓腸肌收縮活動和興奮性的影響，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年牛蛙12 只，雌雄不限，體重（500+50）g，由張掖市譽誠醫(yī)藥生物科技有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

復方當歸注射液（規(guī)格為2 mL），由福建古田藥業(yè)有限公司提供；新鮮任氏液，由河西學院醫(yī)學院生理實驗室配制；BL- 420F 生物信息采集分析系統(tǒng)、張力傳感器、神經屏蔽盒等，均由成都泰盟科技有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙毀髓法[1]制備坐骨神經- 腓腸肌標本 將牛蛙固定于蛙板上，殺蛙針通過枕骨大孔垂直進針，斜向上水平搗毀腦組織，再向下垂直搗毀脊髓。通過檢查四肢肌張力是否消失判斷腦和脊髓的破壞程度，當牛蛙處于腦死亡狀態(tài)后，用粗剪刀剪除頭部、軀干上肢和內臟組織，剝除皮膚組織。將蛙從脊髓中央分離成兩半，一半浸泡在任氏液中備用，另一半用蛙足釘將兩端固定在木質蛙板上繼續(xù)分離。向上保留與坐骨神經相連的一段脊柱，向下沿坐骨神經干走向用玻璃分針分離周圍組織，剪去其側肢保留主干結構完整，在膝關節(jié)上部留取約3 cm 的股骨，剪去膝關節(jié)以下的后肢，以玻璃分針游離腓腸肌，用絲線結扎跟腱處后將其剪斷。實驗過程中不斷將任氏液滴在坐骨神經干和腓腸肌上，防止組織干燥。

1.3.2 坐骨神經- 腓腸肌標本興奮性檢查 標本制備好后，用鋅銅弓檢查其反應，保證興奮性良好。

1.3.3 數據采集與記錄 將坐骨神經- 腓腸肌標本的股骨端固定在神經屏蔽盒中，另一端用細線連接在張力傳感器上；將脊柱段放入神經屏蔽盒，坐骨神經干搭在刺激電極上。連接BL- 420F 生物信息采集分析系統(tǒng)，選擇生理學實驗—神經肌肉實驗—刺激強度與骨骼肌收縮張力的關系、刺激頻率與骨骼肌收縮形式的關系。用直流電刺激坐骨神經干，在CH1 通道，波寬0.1 ms，分別記錄不同刺激強度（刺激頻率為1 Hz、初始刺激強度為0.040 V、增益為0.002 V）和不同刺激頻率下（刺激強度為1 V，初始刺激頻率為1 Hz、增益為1 Hz），腓腸肌發(fā)生收縮活動時的波形。

1.3.4 給藥方法 待波形穩(wěn)定后，先滴加5%復方當歸注射液0.1 mL，記錄給藥前后波形的變化；給標本滴加任氏液0.2 mL，靜置20min，待波形恢復正常后，滴加0.2 mL維拉帕米（10-5mol·L-1），5 min 后再滴加0.2 mL 復方當歸注射液，記錄波形的變化。

1.4 數據分析

采用SPSS 23.0 軟件對數據進行處理，采用t 檢驗分析給藥前后骨骼肌收縮張力的變化，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 滴加復方當歸注射液后，腓腸肌發(fā)生單收縮活動時刺激強度的變化

與給藥前相比，在刺激頻率保持1 Hz 不變的情況下，逐漸增加電流刺激強度（增益為0.002 V），復方當歸注射液可降低使腓腸肌單收縮時的閾強度、半高刺激強度、最適刺激強度，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），使腓腸肌單收縮時的最大收縮張力、最小收縮張力、平均收縮張力升高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。由此可見，復方當歸注射液可降低腓腸肌發(fā)生反應的閾強度，提高其發(fā)生單收縮反應的興奮性，也能增強其單收縮時的最大、最小收縮張力（見表1、圖1、表2、圖2）。

圖2 給藥10 min 后刺激強度與腓腸肌單收縮張力的變化曲線Figure 2 Change curve of stimulation intensity and single contraction tension of gastrocnemius muscle 10 minutes after administration

表1 復方當歸注射液對刺激強度與腓腸肌單收縮關系的影響（±s） 單位：VTable 1 Effect of compound angelica sinensis injection on the relationship between stimulation intensity and single contraction of gastrocnemius muscle（±s） Unit：V

表1 復方當歸注射液對刺激強度與腓腸肌單收縮關系的影響（±s） 單位：VTable 1 Effect of compound angelica sinensis injection on the relationship between stimulation intensity and single contraction of gastrocnemius muscle（±s） Unit：V

注：與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

最適刺激強度0.076±0.030 0.068±0.020*時間 閾強度0.060±0.004 0.044±0.002**給藥前給藥10 min 后半高刺激強度0.068±0.040 0.054±0.030**

表2 復方當歸注射液對腓腸肌單收縮張力的影響（±s） 單位：gTable 2 Effect of Compound angelica sinensis injection on single contraction tension of gastrocnemius muscle（±s）Unit：g

表2 復方當歸注射液對腓腸肌單收縮張力的影響（±s） 單位：gTable 2 Effect of Compound angelica sinensis injection on single contraction tension of gastrocnemius muscle（±s）Unit：g

注：與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

平均收縮張力7.98±0.56 12.98±0.74**時間 最大收縮張力45.18±1.56 50.36±1.03*給藥前給藥10 min 后最小收縮張力6.65±0.32 11.10±0.49**

2.2 復方當歸注射液對腓腸肌強直收縮的影響

與給藥前相比，在刺激強度為1 V、逐漸增加電流刺激頻率（增益為1 Hz）的情況下，復方當歸注射液能降低腓腸肌發(fā)生不完全強直收縮和完全強直收縮時所需的刺激頻率（P＜0.05），增加腓腸肌完全強直收縮過程中的最大收縮張力和最小收縮張力（P＜0.01），見圖3、圖4、表3。

圖3 給藥前刺激頻率與腓腸肌收縮形式的變化曲線Figure 3 Curve of change of stimulation frequency and contraction form of gastrocnemius muscle before administration

圖4 復方當歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響Figure 4 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle

表3 復方當歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 3 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

表3 復方當歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 3 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

完全強直收縮時最小收縮張力/g 9.45±0.48 20.99±0.98**時間 完全強直收縮時的刺激頻率/Hz 20.00±1.89 16.00±0.68*給藥前給藥10 min 后不完全強直收縮時的刺激頻率/Hz 6.00±0.49 3.00±0.16*完全強直收縮時最大收縮張力/g 130.23±2.89 189.26±3.16**

2.3 維拉帕米+復方當歸注射液對腓腸肌單收縮活動的影響

腓腸肌發(fā)生單收縮時，維拉帕米可阻斷復方當歸注射液增強腓腸肌完全強直收縮時最大、最小和平均收縮張力的效應（P＜0.05），但對復方當歸注射液下調腓腸肌發(fā)生完全強直收縮時所需的刺激頻率的效應無阻斷作用，見圖5、表4。

圖5 維拉帕米+復方當歸注射液對腓腸肌完全強直收縮時張力的影響Figure 5 The effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on the tension of gastrocnemius muscle during complete tetanic contraction

表4 維拉帕米+復方當歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 4 Effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

表4 維拉帕米+復方當歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 4 Effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

注：與滴加復方當歸注射液10 min 后比較，*P＜0.05。

滴加復方當歸注射液10 min 后維拉帕米+ 復方當歸注射液不完全強直收縮時的刺激頻率/Hz 3.00±0.16 4.00±0.16完全強直收縮時的刺激頻率/Hz 16.00±0.68 15.00±0.56完全強直收縮時最大收縮張力/g 189.26±3.16 145.18±3.76*完全強直收縮時最小收縮張力/g 20.99±0.98 15.92±0.89*

2.4 琥珀膽堿+復方當歸注射液對腓腸肌單收縮活動的影響

在腓腸肌單收縮反應良好的情況下，加入琥珀膽堿3 min后，收縮反應波形消失變?yōu)橹本€，肉眼觀察腓腸肌無收縮活動。此時，加入復方當歸注射液，10 min 后，刺激反應波形依然是平直狀態(tài)，說明琥珀膽堿可阻斷復方當歸注射液對離體坐骨神經-腓腸肌收縮活動的作用，見圖6。

圖6 琥珀膽堿+復方當歸注射液對腓腸肌收縮張力的影響Figure 6 The effect of suxamethonium chloride+compound angelica sinensis injection on the contractile tension of gastrocnemius muscle

2.5 乙酰膽堿（Ach）+復方當歸注射液對腓腸肌單收縮活動的影響

與單純給Ach 相比，Ach+復方當歸注射液可下調腓腸肌收縮反應的閾值，降低最適刺激強度（P＜0.05）。由此可見，Ach 與復方當歸注射液對腓腸肌發(fā)生收縮反應的閾強度和最適刺激強度的影響有協(xié)同效應，見表5、圖7、圖8。

圖7 Ach 對腓腸肌收縮活動的影響Figure 7 Effect of Ach on contractile activity of gastrocnemius muscle

圖8 Ach+復方當歸注射液對腓腸肌收縮的影響Figure 8 Effect of Ach+compound angelica sinensis injection on contraction of gastrocnemius muscle

表5 Ach 和復方當歸注射液對刺激強度的影響 單位：mVTable 5 Ach and the effect of compound angelica sinensis injection on stimulation intensityUnit：mV

2.6 復方當歸注射液對坐骨神經干產生動作電位的閾強度的影響

與給藥前相比，在波寬1 ms、延時21 ms 的情況下，給予坐骨神經起始為0.1 mV 的電流刺激（增益為0.1 mV），與給藥前相比，復方當歸注射液可下調坐骨神經干產生動作電位的閾強度，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。閾值是衡量興奮性的指標，其大小與興奮性呈反比。由此可見，復方當歸注射液能提高坐骨神經干產生動作電位的興奮性，見表6、圖9、圖10。

圖9 給藥前坐骨神經干產生動作電位的閾強度Figure 9 Threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk before administration

圖10 復方當歸注射液對坐骨神經干產生動作電位閾強度的影響變化曲線Figure 10 Change curve of influence of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk

表6 復方當歸注射液對坐骨神經干產生動作電位閾強度的影響（±s）Table 6 Effect of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk（±s）

表6 復方當歸注射液對坐骨神經干產生動作電位閾強度的影響（±s）Table 6 Effect of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

時間閾強度/ mV 1.10±0.08 0.80±0.05*給藥前給藥10 min 后

3 討論

中醫(yī)將肌無力歸于“萎癥”“虛勞”等范疇，認為其與脾、胃、肝、腎等臟腑功能失調有關，治療主張滋補肝腎、強健筋骨、祛風通絡、養(yǎng)心益氣。臨床常用復方當歸注射液治療椎間盤損傷、腰肌勞損、急性腰扭傷、增生性和強直性脊柱炎等，且取得較好效果。

3.1 復方當歸注射液增強腓腸肌收縮的離子通道機制

毛啟遠等[5]研究發(fā)現，當歸補血湯對小鼠心功能，尤其是處在收縮期的心肌組織有明顯的保護作用。骨骼肌收縮過程中，會出現一個完整的收縮波曲線，包括潛伏期、收縮期和舒張期，細胞內Ca2+濃度開始下降時，進入舒張期[6]。目前公認的肌肉收縮機制為肌絲滑動原理，肌肉收縮主要與細胞內液Ca2+濃度升高有關，骨骼肌收縮時，大部分細胞內Ca2+來自肌細胞內質網，少部分Ca2+源于細胞外Ca2+內流[7]。骨骼肌收縮的形式與肌肉組織中收縮蛋白的數量和肌肉內部的生理狀態(tài)變化密切相關，肌肉收縮舒張的速度、張力等也會隨之改變[8]。研究表明，當歸含有人體所需的17 種氨基酸和Na+、K+、Ca2+、Mg2+等20 余種無機物，這些離子物質與體內多種代謝活動及細胞興奮性有關。本研究發(fā)現，復方當歸注射液可以升高坐骨神經干興奮性，腓腸肌發(fā)生單收縮、不完全強直收縮和完全強直收縮時的最大收縮張力、最小收縮張力；維拉帕米可以阻斷復方當歸注射液增強腓腸肌收縮張力的效應，可能與當歸促進Ca2+內流，升高腓腸肌細胞內Ca2+濃度有關。

3.2 復方當歸注射液可促進Ach 釋放并促進其與N2 受體結合

坐骨神經支配腓腸肌收縮時，其接頭處興奮的傳遞過程需要電信號觸發(fā)突觸前膜的Ca2+通道，突觸小泡前移釋放Ach，Ach 與終板膜中N2 型Ach 受體結合產生終板電位，從而完成興奮傳遞，隨后Ach 被終板膜中膽堿酯酶水解[9]。琥珀膽堿屬于去極化型非選擇性N2 受體阻斷劑，作用于運動神經終板膜以阻斷神經- 骨骼肌接頭處Ach 向骨骼肌傳遞信息的過程，使肌肉松弛。研究結果顯示，琥珀膽堿可阻斷復方當歸注射液對腓腸肌單收縮活動的興奮作用，而乙酰膽堿卻能增強其對腓腸肌單收縮時閾值和最適刺激強度的影響效應，提高其興奮性。由此可見，復方當歸注射液可能通過觸發(fā)突觸前膜Ca2+通道開放，進而促進Ach 釋放，促進Ach 與N2 受體結合，從而增強腓腸肌在電流刺激下發(fā)生單收縮反應的興奮性和收縮張力。

3.3 復方當歸注射液可增強大小運動單位的興奮性

腓腸肌屬于可興奮組織。閾強度是指能夠引起其發(fā)生收縮反應（腓腸肌細胞膜上產生動作電位）的最小刺激強度；最大刺激強度是指腓腸肌的收縮張力不會隨著刺激強度的增加而逐漸升高的臨界值；半高刺激強度是腓腸肌收縮張力達到最大收縮張力的1/2 時的刺激強度[10-11]。衡量可興奮細胞、組織興奮性的指標是閾強度，其與興奮性呈反比[12]。骨骼肌發(fā)生收縮活動時遵循大小原則，即運動單位的動員是由小到大逐步逐級動員。這是因為小運動單位興奮性高，首先被動員；大運動單位興奮性低，只有當刺激強度足夠大時，才能被動員[13]。腓腸肌組織內的運動單位為1 934 個，肌纖維為3 868 000 個。許培宏等[14]研究發(fā)現，間接刺激和直接刺激都可以引起腓腸肌收縮，但通過刺激神經間接引起肌肉收縮的效率更高（閾強度和最適刺激強度更小，而最大單收縮幅度更大），可能是因為間接刺激通過神經纖維末梢、以運動單位的形式可更方便地動員更多肌肉纖維參與收縮，因而更敏感，收縮力也更大。本研究結果顯示，復方當歸注射液可下調腓腸肌單收縮時的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度。由此可見，復方當歸注射液可以通過降低電流刺激腓腸肌時發(fā)生收縮反應的閾值，增強其興奮性，其機制可能與復方當歸注射液能促進Ach 與骨骼肌細胞膜上N2 受體結合，促進神經- 骨骼肌接頭結構處信息的傳遞，從而增強大小運動單位的興奮性有關。

綜上所述，復方當歸注射液既可以通過增強坐骨神經干傳導動作電位的能力，又可以提高腓腸肌興奮性，使腓腸肌發(fā)生單收縮、不完全強直收縮和完全強直收縮的最大、最小收縮張力、平均收縮張力增加。但是，正常生理狀態(tài)下，軀體的運動幾乎都是以完全強直收縮的形式進行。由此可見，復方當歸注射液在一定程度上可以有效緩解肌無力，其具體作用機制還需進一步研究。