脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對卵巢早衰小鼠卵巢內(nèi)分泌功能及顆粒細(xì)胞凋亡的影響

趙 達(dá) 包利利 王曉黎 李 波

卵巢早衰是指女性在40歲前喪失卵巢功能的現(xiàn)象,患者表現(xiàn)為血促性腺激素水平異常升高以及雌激素水平異常降低等卵巢內(nèi)分泌功能異常情況[1]。卵巢早衰后卵巢顆粒細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致,其具體原因還有待于研究[2]。目前對于癥狀明顯者多采取雌激素補(bǔ)充治療,但長期大量雌激素治療存在乳腺癌或心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[3～7]。

來源于脂肪的干細(xì)胞除具有自我更新、高增殖率和多分化能力外,還具有來源豐富且無論理學(xué)爭議的特點(diǎn)[8～10]。既往研究顯示,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能對模型動(dòng)物心臟病、腦梗死、肝硬化、骨關(guān)節(jié)炎等治療效果明顯[11～14]。還有研究認(rèn)為干細(xì)胞對長期不孕和卵巢損傷有治療作用[15,16]。因而本實(shí)驗(yàn)通過2020年1～12月在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn),擬探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對卵巢早衰模型小鼠卵巢內(nèi)分泌功能及顆粒細(xì)胞凋亡的影響。

材料與方法

1.材料:實(shí)驗(yàn)于2020年1～12月在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)昆明種小鼠1只,鼠齡2周; SPF級(jí)雌性昆明種小鼠36只,鼠齡6周,由海南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(瓊)2017-0014。給予全價(jià)營養(yǎng)飼料,保持室溫為21℃～25℃,在相對濕度50%～ 70%的條件下,每天光照12h,自由飲食水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為HNLL20190501DL03。

2.主要試劑及儀器:DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、蛋白酶K購自美國Sigma公司;環(huán)磷酰胺購自美國Hyclone公司;茜素紅、油紅O、環(huán)磷酰胺、白消安、血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢驗(yàn)試劑盒、TUNEL染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司。

3.隨機(jī)對照動(dòng)物實(shí)驗(yàn):36只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片,將動(dòng)情周期正常小鼠全部納入實(shí)驗(yàn)。(1)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及鑒定:取2周齡小鼠,斷頸處死,體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡10min,提取兩側(cè)腹股溝處脂肪組織,磷酸緩沖液(phosphate buffer;PBS)洗3次,剪碎脂肪組織,0.25%的Ⅰ型膠原酶37℃消化40min,離心5min,去上清,以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM重懸,以4×104/cm2重新接種,37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)3天,全量換液,以后每3或4天換液1次,細(xì)胞融合70%～80%時(shí),以0.25%胰酶消化,按1∶3傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。取第3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。取第3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,以0.25%胰酶消化,PBS洗滌,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L時(shí),加入熒光抗體4℃避光孵育30～45min;PBS洗,離心,PBS重懸,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物。取第3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,以0.25%胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L,以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,茜素紅染色,倒置顯微鏡觀察。取第3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,以0.25%胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L,以成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,油紅O染色,倒置顯微鏡觀察[17]。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將昆明種小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、卵巢早衰組以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組,各12只。(3)卵巢早衰模型的建立:卵巢早衰組以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組昆明種小鼠腹腔注射1次環(huán)磷酰胺120mg/kg以及白消安12mg/kg,每天以棉簽輕取陰道分泌物涂片,巴氏染色,觀察陰道脫落細(xì)胞變化。當(dāng)持續(xù)10天或10天以上動(dòng)情間期,認(rèn)為成功建立卵巢早衰模型[18～20]。假手術(shù)組注射0.9%氯化鈉溶液。假手術(shù)組動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)是保持原來的動(dòng)情周期不變,即動(dòng)情周期為4～6天。(4)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療:造模成功后第1天起每7天,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組經(jīng)尾靜脈注射1ml濃度為1×109/L脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液,共注射4次。假手術(shù)組和卵巢早衰組注射1ml0.9%氯化鈉溶液。(5)卵巢內(nèi)分泌功能鑒定:造模前1天以及造模成功后14、28天,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠,取腹主動(dòng)脈血1ml,靜置后以2000r/min離心,取血清,-80℃低溫保存,以ELISA法檢測血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B濃度。酶標(biāo)儀檢測450nm處吸光度值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本濃度。(6)取材:造模成功后28天,頸椎脫臼法處死小鼠,取雙側(cè)卵巢,40g/L多聚甲醛固定,石蠟包埋,行5μm厚切片。(7)蘇木精-伊紅染色檢測卵巢病理變化:取小鼠卵巢石蠟切片,二甲苯孵育,梯度乙醇復(fù)水,蘇木精染色,鹽酸乙醇洗,伊紅復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,光鏡觀察。(8)Tunel染色檢測卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡:二甲苯孵育,梯度乙醇復(fù)水,蛋白酶K室溫水解,過氧化氫室溫孵育, 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)37℃染色1h,終止劑終止反應(yīng),37℃孵育30min,過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體濕盒室溫染色30min,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)顯色,甲基綠復(fù)染,光鏡觀察卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡情況。每張切片隨機(jī)取3個(gè)400視野,記錄凋亡細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量,凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%。(9)主要觀察指標(biāo):卵巢病理變化、內(nèi)分泌功能以及卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況。

圖1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)果A.培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)(×200),細(xì)胞呈梭型;B.成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色的結(jié)果(×200),箭頭指示鈣結(jié)節(jié);C.成脂誘導(dǎo)后油紅O染色的結(jié)果(×200),箭頭指示橘紅色脂滴。結(jié)果證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞符合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的特性;D.流式細(xì)胞儀的結(jié)果

圖2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢病理損傷的影響(蘇木精-伊紅染色,×200)A.假手術(shù)組,卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;B.卵巢早衰組,卵巢卵泡數(shù)量減少,淋巴細(xì)胞浸潤;C.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組,卵巢萎縮、卵泡數(shù)量異常、透明帶形態(tài)以及淋巴細(xì)胞浸潤明顯減輕

圖3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞凋亡的影響(Tunel染色)A.假手術(shù)組;B.卵巢早衰組;C.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞(×200)。其中卵巢早衰模型小鼠可見較多的顆粒細(xì)胞,而假手術(shù)組以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組顆粒細(xì)胞數(shù)量較少;D.卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞的數(shù)量。與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與卵巢早衰組比較,#P<0.05

結(jié) 果

1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定結(jié)果:所有培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在接種后24h貼壁,細(xì)胞呈梭形。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29陽性率為99.9%,CD34陽性率為2.1%,CD45陽性率為2.8%,且經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后,茜素紅染色可見細(xì)胞中存在深紅色鈣結(jié)節(jié);而經(jīng)成脂誘導(dǎo)3周,油紅O染色可見細(xì)胞中存在橘紅色脂滴,說明培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,詳見圖1。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析:卵巢早衰組及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組動(dòng)物均造模成功,所有36只小鼠均完成全部實(shí)驗(yàn),所有數(shù)據(jù)均進(jìn)入結(jié)果分析,無脫失。

3.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療改善卵巢早衰模型小鼠卵巢的內(nèi)分泌功能:造模前1天,各組小鼠血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B濃度接近(P>0.05)。造模成功后14天時(shí),與假手術(shù)組比較,卵巢早衰組以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組血清雌二醇、孕酮以及抑制素B濃度明顯減少(P<0.05),而促卵泡生成素和黃體生成素濃度顯著增加(P<0.05),且卵巢早衰組以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模成功后28天時(shí),與卵巢早衰組比較,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組血清雌二醇、孕酮以及抑制素B濃度明顯增加(P<0.05),而促卵泡生成素和黃體生成素濃度減少(P<0.05),詳見表1。

表1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢內(nèi)分泌功能的影響

4.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療改善卵巢早衰模型小鼠卵巢病理損傷:蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組小鼠卵巢明顯變相異常變化;卵巢早衰模型小鼠卵巢明顯萎縮,卵泡數(shù)量減少,透明帶形態(tài)異常,可見淋巴細(xì)胞浸潤;而經(jīng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后,上述病理變化明顯減輕,詳見圖2。

5.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療減少卵巢早衰模型小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的凋亡:Tunel染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組小鼠卵巢中未見凋亡的顆粒細(xì)胞,而卵巢早衰模型小鼠卵巢中可見大量凋亡的顆粒細(xì)胞,而經(jīng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后,模型小鼠卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05),詳見圖3。

討 論

卵巢早衰是一種婦科常見病,會(huì)出現(xiàn)多種生殖激素表達(dá)異常的現(xiàn)象,同時(shí)病理學(xué)研究也證實(shí)患者的卵巢結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯改變[21]。卵泡是卵母細(xì)胞發(fā)生與發(fā)育的基本單位,是卵巢結(jié)構(gòu)和功能的核心,而顆粒細(xì)胞是組成卵泡的重要細(xì)胞之一,對卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。卵巢早衰患者除卵母細(xì)胞往往呈現(xiàn)發(fā)育不良,甚至退化,且其顆粒細(xì)胞數(shù)量也比正常人群明顯減少[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)誘導(dǎo)的卵巢早衰模型小鼠的卵巢發(fā)生明顯病理損傷,其卵巢明顯萎縮,卵泡數(shù)量減少,透明帶形態(tài)異常,可見淋巴細(xì)胞浸潤以及大量凋亡的顆粒細(xì)胞,同時(shí)小鼠血清中的雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B均發(fā)生明顯變化,與既往研究結(jié)果一致。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有增殖力強(qiáng)以及多向分化潛力,同時(shí)還能夠分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[8～10]。本實(shí)驗(yàn)獲得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物以及分化能力均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。且卵巢早衰模型小鼠經(jīng)過4次脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后,其病理損傷明顯減輕,同時(shí)顆粒細(xì)胞數(shù)量有所恢復(fù),且小鼠血清雌二醇、孕酮以及抑制素B濃度明顯增加,促卵泡生成素和黃體生成素濃度減少,但上述指標(biāo)與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞通過改善卵巢早衰模型小鼠卵巢內(nèi)分泌功能,減少顆粒細(xì)胞凋亡,對卵巢早衰具有治療作用。實(shí)驗(yàn)僅對卵巢早衰模型小鼠進(jìn)行了28天的觀察,尚不清楚脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對卵巢早衰的遠(yuǎn)期影響。同時(shí)由于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的影響可能由于其分泌的細(xì)胞因子所導(dǎo)致。