妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)現(xiàn)狀分析

賈曉云 弓培慧 朱 鐳 李秀輝 張岳琴 白麗霞

陰道微生物菌群、陰道局部解剖結(jié)構(gòu)、機體的免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌共同構(gòu)成了女性陰道動態(tài)平衡的微生態(tài)體系[1]。女性陰道微生物菌群包含200多種細菌,其中乳酸桿菌占優(yōu)勢。這些微生物菌群是陰道微生態(tài)體系的一個重要組成部分,對于維持健康的陰道環(huán)境和防止機會致病菌的定植至關重要,乳酸桿菌產(chǎn)生乳酸作為其主要發(fā)酵產(chǎn)物,導致陰道pH值降低,有助于維持健康的陰道環(huán)境[2～5]。在妊娠晚期,由于孕婦體內(nèi)雌激素、孕激素水平過高,導致糖原積聚及自身免疫功能下降,進一步引發(fā)陰道微生態(tài)失調(diào),導致生殖道感染,甚至引起一系列包括胎膜早破、早產(chǎn)、新生兒黃疸及產(chǎn)褥期感染等不良妊娠結(jié)局在內(nèi)的并發(fā)癥[6,7]。因此了解孕婦陰道微生態(tài)是非常有必要的。本研究采用細菌16S rDNA基因測序分析妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)現(xiàn)狀,比較陰道微生態(tài)正常組(AN組)與陰道微生態(tài)失調(diào)組(BU組)之間孕婦陰道菌群的結(jié)構(gòu)變化,為準確揭示BU組陰道菌群特征提供依據(jù)。

對象與方法

1.研究對象:按照納入排除標準選取2021年7～8月山西省兒童醫(yī)院(山西省婦幼保健院)產(chǎn)科門診產(chǎn)檢的妊娠晚期孕婦60例,年齡為24～40歲,平均年齡為30.10±3.48歲;孕周為34～39周,平均孕周為36.23±0.91周。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審查批準[倫理學審批號:(2019)YX第(255)號] 。

2.納入排除標準:納入標準:①孕周≥28周;②自然妊娠;③健康單胎妊娠;④規(guī)律產(chǎn)檢,可跟蹤隨訪;⑤對研究內(nèi)容知情同意。排除標準:①有妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病及妊娠期甲狀腺功能異常等妊娠合并癥;②有心臟、肝臟及腎臟等內(nèi)科疾病;③有陰道炎癥狀的患者;④檢查前3天有性生活史;⑤近兩周有激素、抗生素(包括外陰陰道所用藥物)及免疫抑制劑使用史。

3.分組:依據(jù)肖冰冰等[8]陰道微生態(tài)診斷標準:①陰道微生態(tài)正常:菌群密集度為Ⅱ～Ⅲ級、多樣性為Ⅱ～Ⅲ級、優(yōu)勢菌為革蘭陽性大桿菌G+b(L)膿細胞或白細胞、炎性反應為0～5/高倍鏡;②陰道微生態(tài)異常:密集度、多樣性、優(yōu)勢菌、炎性反應等任何一項異常。收集陰道分泌物常規(guī)資料,分為AN組(n=54例)和BU組(n=6例)。

4.樣品收集和保存:對妊娠晚期的孕婦外陰進行消毒,使用無菌窺陰器暴露陰道和宮頸,采用一次性無菌拭子(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)蘸取孕婦陰道后穹隆分泌物于試管,并于-80℃冰箱保存并送檢。

5.16S rDNA基因擴增和測序:使用CTAB法提取各組樣品中的基因組DNA,并將DNA樣本儲存在-80℃。以稀釋的基因組DNA為模板,使用帶Barcode的特異性引物和高效高保真酶進行PCR擴增,以確保擴增效率和準確性。PCR引物為上游引物(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和下游引物(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。該文庫使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit構(gòu)建,并通過Qubit 定量和文庫檢測后。文庫合格后,使用NovaSeq 6000進行測序。

圖1 陰道微生態(tài)正常(AN組)與失調(diào)組(BU組)細菌分布A.韋恩圖顯示了AN和BU組之間的共有和特有的OTU;B.AN和BU組中門水平的細菌相對豐度;C.AN和BU組中屬水平的細菌相對豐度;D.AN和BU組中每個屬的相對豐度

圖3 Beta多樣性分析A.基于Weighted Unifrac 距離PCoA分析;B. 基于Weighted Unifrac Beta多樣性箱型圖

結(jié) 果

1.陰道微生態(tài)正常組與失調(diào)組細菌分布:60例孕婦分為陰道微生態(tài)正常對照組(AN組,n=54)和陰道微生態(tài)失調(diào)組(BU組,n=6)。60個拭子樣本總共產(chǎn)生了4960201個reads,每個樣本平均有82670±6119個reads,平均讀取長度為423bp。對于所有樣本的有效數(shù)據(jù),以97%的一致性進行OTU聚類,共獲得7036個OTU。韋恩圖顯示了AN組和BU組之間的共有和特有的OTU。在AN組和BU組中分別檢測到6651和685個OTU, AN組和BU組中共有320個OUT,AN組檢出6331個特有 OTU,BU組檢出365個特有OTU(圖1A)。說明BU組的物種種數(shù)(物種豐度)低于AN組。分析各組的細菌分布,并顯示了在門和屬水平上的結(jié)果。在門水平上,陰道微生態(tài)正常組菌群主要包括Firmicutes(厚壁菌門)、Actinobacteriota(放線菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和擬桿菌門(Bacteroidota)。與AN組比較,BU組放線菌門(Actinobacteriota)和擬桿菌門(Bacteroidota)和梭桿菌門(Fusobacteriota)的豐度較高,而Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、未分類細菌門(unidentified-bacteria)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、藍藻門(Cyanobacteria)和黏球菌門(Myxococcota)的豐度較低(P<0.05,圖1B)。在屬水平上,AN組的樣本以乳桿菌屬(Lactobacillus)為主。與AN組比較,BU組前30種細菌中巨型球菌屬(Megasphaera)、加德納菌屬(Gardnerella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、小桿菌屬(Dialister)、纖毛菌屬(Sneathia)、瘤胃球菌屬(Shuttleworthia)和阿托波菌屬(Atopobium)富集(P<0.05);而其他乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)則減少(P<0.05)(圖1中C、D)。結(jié)果表明,妊娠晚期陰道微生態(tài)正常組以乳酸桿菌為主,陰道微生態(tài)失調(diào)組相關菌屬有巨型球菌屬、加德納菌屬、普雷沃菌、小桿菌屬、纖毛菌屬、瘤胃球菌屬和阿托波菌屬。

2.陰道微生物Alpha多樣性分析:Shannon指數(shù)和Simperson指數(shù)通常用來描述群落物種分布的多樣性。它們既表明了物種的豐富度,也表明了物種的均勻性。BU組的Shannon指數(shù)和Simperson指數(shù)均高于AN組(表1),說明BU組的多樣性高與AN組(P<0.01,圖2中A和B)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于估計不同樣本中OTU(群落豐富度)的數(shù)量。Chao1和ACE指數(shù)越大,群落的豐富度越高。BU組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均較低(表1),可知BU組群落豐富度比AN組低,但兩組這些指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖2中C和D)。Alpha多樣性測量表明,陰道微生態(tài)失調(diào)組群多樣性較高。

表1 兩組Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

3.陰道微生物Beta多樣性分析:(1) PCoA分析:基于Weighted Unifrac距離的PCoA分析(主成分分析),由圖3A可知第一主成分的貢獻率為51.08%、第二主成分的貢獻率為16.73%;同一組內(nèi)有一些樣本散在這個群體之外,說明這個樣本可能組間相似性不高;反之樣本組間相似性高的樣本往往聚集在一起。BU組陰道菌群分離較AN組顯著(P<0.01,圖3B)。(2)MRPP分析:用于分析組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異是否顯著,其統(tǒng)計量為A值,A=0.05942說明組間差異大于組內(nèi)差異;P=0.003表示AN組和BU組陰道菌群差異有統(tǒng)計學意義。(3)ANOSIM分析:R值介于(-1,1)之間,R>0,說明組間差異很明顯,R<0,說明組內(nèi)差異大于組間差異(P<0.05)。計算得到R=0.3561,說明組間差異顯著,即AN組和BU組陰道菌群差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。

討 論

陰道微生物菌群是妊娠晚期孕婦抗菌防御系統(tǒng)的關鍵部分,其組成和功能可以影響孕婦的免疫力、對細菌的易感性和妊娠結(jié)局[9,10]。妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)更容易出現(xiàn)紊亂,如果妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)受到干擾,可能會導致相關疾病,造成不好的妊娠結(jié)果,嚴重可威脅胎兒和母親的生命[11～14]。然而,人們對妊娠晚期陰道微生物菌群的組成知之甚少。

1.陰道微生態(tài)正常組和失調(diào)組菌群不同:本研究通過比較6例陰道微生態(tài)失調(diào)孕婦和54例陰道微生態(tài)正常孕婦的陰道微生物菌群結(jié)構(gòu)及其豐度多樣性,發(fā)現(xiàn)AN組和BU組的陰道微生物菌群組成存在著明顯差異。這說明妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)失調(diào),會導致陰道微生物菌群的組成發(fā)生一定程度的改變。本研究發(fā)現(xiàn),陰道微生態(tài)正常組主要以乳酸桿菌為主,這與文獻研究結(jié)果一致[15]。陰道微生態(tài)失調(diào)組主要以巨型球菌屬、加德納菌屬、普雷沃菌屬、小桿菌屬、纖毛菌屬、瘤胃球菌屬和阿托波菌屬為主。近年來研究發(fā)現(xiàn),一些菌屬如巨型球菌屬、加德納菌屬、普雷沃菌屬和阿托波菌屬與細菌性陰道病有關[16,17]。說明BU組孕婦患細菌性陰道病的概率更大,這可能與孕婦不良衛(wèi)生習慣、長期使用抗生素及不潔性生活有關[18]。提示醫(yī)護人員應積極對妊娠期孕婦進行陰道微生態(tài)健康知識的普及,使孕婦養(yǎng)成良好的個人衛(wèi)生及行為習慣,從而更好地維護妊娠期陰道微生態(tài)健康環(huán)境。

2.陰道微生態(tài)失調(diào)組菌群多樣性增高:基于OTU分析、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析代表每個樣本內(nèi)微生物的Alpha多樣性,發(fā)現(xiàn)陰道微生態(tài)失調(diào)組多樣性高于微生態(tài)正常組,這可能與BU組加德納菌增加有關。潘穎等[19]研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌發(fā)生過程中,陰道乳酸桿菌屬含量降低,而加德納菌屬含量及陰道內(nèi)菌種多樣性會增加。這提示加德納菌增加可以使陰道的pH值由弱酸性變?yōu)橹行?從而抑制乳酸桿菌屬的生長。這可能是由于加德納菌的產(chǎn)物會破環(huán)陰道上皮細胞的保護因子,導致細菌在陰道表面大量黏附與定植,最終導致陰道內(nèi)總物種多樣性的增加。

3.Sneathia 感染與不良圍生結(jié)局有關:Sneathia 是一種重要但未被充分認識的微生物菌群,在影響女性生殖健康及新生兒結(jié)局中的作用通常被低估。Sneathia 雖然稀少,但新出現(xiàn)的證據(jù)表明其在懷孕期間可上行侵入上生殖道變得致病[20]。總的來說,Sneathia 與幾種不良圍生結(jié)局有關,自發(fā)性早產(chǎn)、臨床絨毛膜羊膜炎、新生兒敗血癥、宮內(nèi)胎兒死亡以及產(chǎn)婦敗血癥等[21～24]。近年來一項研究進一步表明,Sneathia 具有與早產(chǎn)相關的陰道細菌的最大相對豐度,可能有助于細菌性陰道病的發(fā)生和進展。本研究發(fā)現(xiàn),與AN組比較,BU組的孕婦陰道樣本中更常出現(xiàn)Sneathia,提示臨床醫(yī)生在臨床實踐中要重視Sneathia 感染的篩查,從而采取針對性的預防和治療措施;同時需要進一步開發(fā)快速和特異性的診斷試劑,以快速識別和量化臨床標本中的Sneathia。

本研究具有一定的局限性:本研究為隨機抽樣,得到的兩組樣本量懸殊較大,結(jié)果存在一定偏倚,未來還需要更多大樣本量、多中心的前瞻性研究進行探索。

綜上所述,16S rDNA高通量測序能更精確地反映妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)菌群的結(jié)構(gòu)組成及其豐度多樣性,為進一步研究妊娠晚期孕婦陰道微生態(tài)失調(diào)機制奠定基礎。同時,為醫(yī)護工作者對陰道微生態(tài)環(huán)境的了解提供非常有價值的信息,進一步為有效預防不良圍生結(jié)局提供新思路。