附子中內(nèi)源性組分新烏頭堿的毒性作用

陳錦萍,徐夢(mèng)佳,郭 嫻,萬(wàn)益群,郭 嵐

(南昌大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江西 南昌 330031)

烏頭的側(cè)根,在中國(guó)被稱為“附子”[1],為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx)的子根加工品[2],主要分布于四川、陜西、甘肅等地[3-5]。附子味辛、甘,性大熱,具有回陽(yáng)救逆,補(bǔ)火助陽(yáng),散寒止痛等功效[6],在我國(guó)已有幾千年的醫(yī)用實(shí)踐?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載:附子主治風(fēng)寒咳逆,邪氣,溫中,金創(chuàng),破徵堅(jiān)積聚,血瘕,寒濕,痿躄,拘攣,膝痛不能步行?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,附子具有強(qiáng)心、抗心律失常等作用[7]。附子中含有烏頭類生物堿、黃酮以及多糖等多種組分,其中,烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等烏頭生物堿是其重要的內(nèi)源性組分[8],具有鎮(zhèn)痛[9-10]、抗炎[11-13]、抗癲癇、抗抑郁、抗癡呆[14]抗腫瘤[15-16]、抗病毒[17]、提高免疫功能[18]等多種生理活性。

附子也具有一定的毒性,且安全系數(shù)窄,其治療劑量接近于中毒劑量。有報(bào)道稱,全球范圍內(nèi)由附子引起的中毒病例已超過(guò)5000例,因此附子的安全性也受到了高度關(guān)注。有研究表明,烏頭堿、次烏頭堿以及新烏頭堿等雙酯型烏頭生物堿是其主要的毒性成分[19]。Ye qiang等[20]研究了3種雙酯型烏頭堿(烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿)和3種單酯型烏頭堿(14-α-苯甲酰烏頭堿、14-α-苯甲酰新烏頭堿、14-α-苯甲酰次烏頭堿)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的生物效應(yīng),發(fā)現(xiàn)雙酯型烏頭堿的心臟毒性、器官毒性以及功能毒性均比單酯型烏頭堿強(qiáng)。雷懷成[21-24]等發(fā)現(xiàn)烏頭堿在給藥后短時(shí)間內(nèi),會(huì)導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加。Gao等[25]研究認(rèn)為烏頭堿能通過(guò)部分線粒體依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)H9c2心肌凋亡。都姣嬌等[26]報(bào)道了心肌細(xì)胞的存活率會(huì)隨著次烏頭堿濃度的升高而下降。目前,附子中的烏頭堿以及次烏頭堿的毒性研究較多,而結(jié)構(gòu)與烏頭堿和次烏頭堿有一定差別的新烏頭堿毒性評(píng)估報(bào)道較少,且主要集中在心肌細(xì)胞層面[27-28]。同時(shí),毒性評(píng)估的方法和方案也不統(tǒng)一,導(dǎo)致結(jié)論有偏差?；诖?本文選擇新烏頭堿為研究對(duì)象,以SD大鼠為模型動(dòng)物,依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》(GB 15193.3-2014)中的霍恩氏法,開(kāi)展新烏頭堿對(duì)大鼠的急性經(jīng)口毒性評(píng)價(jià),并探究新烏頭堿對(duì)于大鼠的主要臟器(包括心臟、肝臟以及腎臟)的毒性作用,為附子的安全使用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與材料

新烏頭堿(純度≥99.47%,購(gòu)自廣東雋沐生物科技股份有限公司);玉米油(食品級(jí));蘇木素-伊紅染液購(gòu)自武漢市皮諾飛生物科技有限公司;10%福爾馬林中性固定液購(gòu)自南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒和磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自白鯊生物科技有限公司;脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JJ-12J型脫水機(jī)、JB-B5型包埋機(jī)JB-L5型凍臺(tái)均購(gòu)自于武漢俊杰電子有限公司;RM2016型病理切片機(jī)購(gòu)自于上海徠卡儀器有限公司;KD-P型組織攤片機(jī)購(gòu)自于浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;DHG-9140型烤箱購(gòu)自上?；厶﹥x器制造有限公司;10212432C型載玻片及蓋玻片購(gòu)自于江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司;NIKON ECLIPSE CI型正置光學(xué)顯微鏡和NIKON DS-U3型成像系統(tǒng)均購(gòu)自日本尼康有限公司;CL-21M型冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;E-330全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠50只,雌雄各半,體重為180～220 g。大鼠由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為SYXK(贛)2015-0001,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(湘)2019-0004。給藥前,所有大鼠在試驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行5 d環(huán)境適應(yīng),環(huán)境溫度為24 ℃±2 ℃,相對(duì)濕度50 % ± 10 %,按性別分籠飼養(yǎng),試驗(yàn)期間喂基礎(chǔ)飼料,飼料由湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,飼料許可證號(hào)為SCXK(湘)2020-0006,自由飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物給藥

SPF級(jí)SD大鼠50只,按性別隨機(jī)分成10組,雄性和雌性均分為1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)給藥組,每組5只。給藥組灌胃新烏頭堿,雄性給藥組劑量分別為1.00、2.15、4.64、10.0 mg·kg-1,雌性給藥組劑量分別為0.464、1.00、2.15、4.64 mg·kg-1,對(duì)照組灌胃相同體積的食用級(jí)玉米油。以上各組大鼠均按體質(zhì)量10 mL·kg-1一次性經(jīng)口灌胃。灌胃前大鼠禁食16 h左右,自由飲水,灌胃后,禁食3～4 h。之后自由飲食和飲水,持續(xù)觀察14 d。

1.4.2 臨床觀察

連續(xù)14 d觀察大鼠的毛發(fā)、眼部、皮膚、活動(dòng)狀態(tài)以及精神狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱大鼠的體重,并且每周稱1次體重。觀察期內(nèi)若發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡,立即解剖,肉眼觀察其心臟、肝臟以及腎臟病理形態(tài)變化,并記錄各組死亡大鼠數(shù)量。

1.4.3 臟器指數(shù)的測(cè)定與分析

14 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)所有大鼠進(jìn)行處死解剖,取心臟、肝臟以及腎臟并且稱重,計(jì)算各大鼠各個(gè)器官的臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器重量/體重*100 %)。

采用SPSS26.0軟件分析臟器指數(shù)的數(shù)據(jù)。用單因素方差分析法(ANOVA)分析兩組間臟器指數(shù)數(shù)據(jù)的差異性。根據(jù)最小顯著性差異法(LSD),P<0.05為具有顯著性差異,其中,P<0.01為差異十分顯著。

1.4.4 組織病理學(xué)分析

將解剖的心臟、肝臟、腎臟稱重后用10 %的福爾馬林固定液固定24 h以上后,經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水,石蠟包埋,切片機(jī)切片,蘇木素-伊紅(HE)染色等一系列程序后,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)研究。

1.4.5 氧化應(yīng)激能力指標(biāo)的測(cè)定

將解剖的大鼠肝臟、腎臟稱重后于-80 ℃冷藏24 h以上,之后取一定量的肝臟組織和腎臟組織,與一定比例的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)混合研磨后,按試劑盒規(guī)定的轉(zhuǎn)速,在4℃條件下離心,取上清液。接著使用相關(guān)試劑盒測(cè)定肝臟和腎臟的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、腎臟的脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)以及肝臟的丙二醛(MDA),之后采用SPSS26.0軟件分析氧化應(yīng)激能力指標(biāo)的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠的一般狀況

對(duì)于雄性大鼠,大部分低劑量給藥組(1.00、2.15 mg·kg-1)的大鼠在給藥24 h之內(nèi)表現(xiàn)出呆滯、嗜睡、食欲下降等癥狀。少部分還出現(xiàn)震顫、驚厥、流涎、痙攣、叫聲異常、昏迷、體位異常、流淚、鼻翼扇動(dòng)豎毛等現(xiàn)象。24 h過(guò)后,除了個(gè)別表現(xiàn)呆滯的,其余皆恢復(fù)正常,食欲增加,此兩個(gè)劑量的大鼠無(wú)死亡。而中高劑量組(4.64、10.0 mg·kg-1)的大鼠給藥后2 h內(nèi)5只大鼠皆不同程度地出現(xiàn)與低劑量給藥組(1.00、2.15 mg·kg-1)一樣的中毒癥狀,小部分還出現(xiàn)眼睛和鼻孔出血、流淚、抽搐。在給藥4 h內(nèi),這兩個(gè)給藥組大鼠相繼全部死亡。各組大鼠死亡數(shù)如表1所示。

對(duì)于雌性大鼠,給藥劑量為0.464 mg·kg-1的大鼠在給藥6 h之內(nèi)出現(xiàn)昏睡、呆滯、震顫、心跳異常,食欲下降,其中1只出現(xiàn)流涎和冷汗。8 h之后開(kāi)始恢復(fù)正常,此劑量無(wú)大鼠死亡。劑量為1.00 mg·kg-1的大鼠在給藥24 h之內(nèi)表現(xiàn)出呆滯、嗜睡、食欲下降等癥狀,少部分還出現(xiàn)流涎、痙攣、叫聲異常、昏迷、體位異常、流淚、鼻翼扇動(dòng)、豎毛、冷汗、腹瀉、眼睛以及鼻孔出血等現(xiàn)象。24 h過(guò)后恢復(fù)正常,食欲增加,此劑量組有1只大鼠死亡。對(duì)于劑量為2.15和4.64 mg·kg-1的大鼠給藥后4 h內(nèi)5只大鼠皆不同程度地出現(xiàn)震顫、驚厥、不安、痙攣、呆滯、嗜睡、昏迷、體位異常、叫聲異常、豎毛、冷汗、鼻翼扇動(dòng)、抽搐。一部分出現(xiàn)流涎、腹瀉、眼睛以及鼻孔出血等現(xiàn)象。在給藥8 h內(nèi),全部動(dòng)物相繼死亡。各組大鼠死亡數(shù)如表2所示。解剖實(shí)驗(yàn)中死亡的大鼠,肉眼可見(jiàn)其心臟顏色變黑變暗甚至有變硬現(xiàn)象,而肝臟和腎臟未見(jiàn)有明顯的改變。初步判斷,新烏頭堿在短時(shí)間內(nèi)會(huì)對(duì)大鼠的心臟以及神經(jīng)系統(tǒng)造成明顯的作用。有研究報(bào)道烏頭類生物堿對(duì)迷走神經(jīng)有強(qiáng)烈的興奮作用,釋放出乙酰膽堿作用于心臟,極易形成室性混亂性心律,如室早、室速甚至室顫[29],也有文獻(xiàn)指出雙酯型烏頭生物堿可使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,從而引起心律失常[30,31]。本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象說(shuō)明新烏頭堿可能與其它烏頭類生物堿一樣,會(huì)影響大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)和心臟功能。

給藥組的雄性大鼠和雌性大鼠的死亡數(shù)分別見(jiàn)表1和表2,依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》(GB 15193.3-2014)中LD50的測(cè)定方法,得出雄性大鼠的LD50約為3.16 mg·kg-1,雌性大鼠的LD50約為1.26 mg·kg-1。可以看出雄性比雌性的耐受性更強(qiáng),造成這種差異的原因可能是與不同性別大鼠的身體組成、激素、肝臟代謝、腎臟清除能力、蛋白質(zhì)結(jié)合與分布的差異有關(guān)[32-33]。

表1 雄性大鼠各給藥組的死亡數(shù)Tab.1 Death number of male rat dose group

表2 雌性大鼠各給藥組的死亡數(shù)Tab.2 Death number of female rat dose group

2.2 新烏頭堿對(duì)大鼠體重的影響

在14 d的觀察期內(nèi),存活下來(lái)的各個(gè)劑量組的大鼠平均體重變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。由圖中可以看出,雄性大鼠給藥組和雌性大鼠給藥組的體重變化趨勢(shì)與各自的對(duì)照組相比,均無(wú)明顯差異。這說(shuō)明單次給藥,如果大鼠能夠存活下來(lái),新烏頭堿對(duì)大鼠的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。

t/d

2.3 新烏頭堿對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的某個(gè)臟器與其體重的比值,是毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的指標(biāo)。當(dāng)動(dòng)物的臟器因染毒受損后,其臟器的重量也往往隨之改變,從而引起了臟器指數(shù)的變化。一般來(lái)說(shuō),臟器指數(shù)增大,則提示著臟器充血、水腫或增生肥大等;而臟器指數(shù)減小,則提示著臟器萎縮、缺血、發(fā)育不良等變化。本實(shí)驗(yàn)用臟器指數(shù)來(lái)研究新烏頭堿對(duì)大鼠心臟、肝臟、腎臟的影響,結(jié)果見(jiàn)表3。雌雄大鼠各給藥組的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與對(duì)照組相比不具有顯著性差異(P>0.05);雄性2.15 mg·kg-1組的心臟指數(shù)與對(duì)照組相比差異十分顯著(P<0.01),而雌性0.464 mg·kg-1組和1.00 mg·kg-1組的心臟指數(shù)與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。初步表明了新烏頭堿對(duì)大鼠的心臟有明顯的影響,并且對(duì)雌性大鼠的影響更明顯。

表3 新烏頭堿對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響
Tab.3 Effect of mesaconitine on organ coefficient of rats

劑量組心臟指數(shù)/g(100 g)-1肝臟指數(shù)/g(100 g)-1腎臟指數(shù)/g(100 g)-1雄性對(duì)照組0.38±0.01a3.79±0.200.45±0.01雄性1.00 mg·kg-10.42±0.073.91±0.550.42±0.03雄性2.15 mg·kg-10.49±0.07??3.67±0.260.42±0.01雌性對(duì)照組0.32±0.063.67±0.450.41±0.02雌性0.464 mg·kg-10.41±0.07?4.05±0.380.41±0.05雌性1.00 mg·kg-10.40±0.05?3.60±0.160.40±0.03

*表示與對(duì)照組比較,差異具有顯著性(P<0.05),**表示與對(duì)照組比較,差異十分顯著(P<0.01)。a:表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.4 組織病理學(xué)分析

通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)大鼠的心臟、肝臟和腎臟的病理切片進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2～4所示。由圖2可知,與對(duì)照組相比,各給藥組雌雄大鼠心臟心肌細(xì)胞水腫,間質(zhì)血管擴(kuò)張充血。由圖3可知,各給藥組雌雄大鼠肝臟有脂肪空泡或變性,并且有肝細(xì)胞壞死,雄性2.15 mg·kg-1組和雌性1.00 mg·kg-1組大鼠肝臟的匯管區(qū)見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。由圖4可知,

(a:雄性對(duì)照組;b:雄性1.00 mg·kg-1組;c:雄性2.15 mg·kg-1組;d:雌性對(duì)照組;e:雌性0.464 mg·kg-1組;f:雌性1.00 mg·kg-1組)。

各給藥組大鼠腎臟都存在著腎小管水腫,腎間質(zhì)血管擴(kuò)張充血,并且雄性各給藥組大鼠腎臟出現(xiàn)部分腎小球纖維組織增生,雌性0.464 mg·kg-1組大鼠腎臟出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。病理組織學(xué)分析結(jié)果表明,一定劑量的新烏頭堿會(huì)對(duì)大鼠肝臟造成一定的損傷。

2.5 新烏頭堿對(duì)大鼠臟器氧化應(yīng)激能力的影響

iNOS能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生NO,當(dāng)機(jī)體NO濃度太高時(shí),會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。LPO和MDA經(jīng)常被作為脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo),脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,組織中LPO以及MDA的含量越高,提示著組織的損傷越大。根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果,本實(shí)

表4 新烏頭堿對(duì)大鼠氧化應(yīng)激能力的影響Tab.4 Effect of mesaconitine on oxidative stress capacity of

*表示與對(duì)照組比較,差異具有顯著性(P<0.05),**表示與對(duì)照組比較,差異十分顯著(P<0.01)。a:表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

驗(yàn)通過(guò)測(cè)定肝臟和腎臟的氧化應(yīng)激能力的指標(biāo)來(lái)研究新烏頭堿對(duì)大鼠肝臟、腎臟的影響,結(jié)果見(jiàn)表4。各給藥組雌雄大鼠的肝臟MDA指標(biāo)、腎臟iNOS指標(biāo)以及腎臟LPO指標(biāo)與對(duì)照組大鼠相比不具有顯著性差異(P>0.05)。雌性1.00 mg·kg-1組大鼠和雄性1.00 mg·kg-1組大鼠的肝臟iNOS指標(biāo)與雌雄對(duì)照組大鼠相比具有顯著性差異(P<0.05),而雄性2.15 mg·kg-1組大鼠的肝臟iNOS指標(biāo)與雄性對(duì)照組大鼠相比差異十分顯著(P<0.01)。表明了一定劑量的新烏頭堿對(duì)大鼠的肝臟有明顯的損傷。

3 結(jié)論

本文通過(guò)14 d急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn),探討了附子中內(nèi)源性組分新烏頭堿的生物效應(yīng),得到新烏頭堿對(duì)雄性大鼠和雌性大鼠的LD50分別為3.16和1.26 mg·kg-1,表明新烏頭堿對(duì)生物具有較強(qiáng)毒性。病理組織學(xué)分析結(jié)果表明,一定劑量的新烏頭堿會(huì)對(duì)大鼠肝臟造成一定的損傷,氧化應(yīng)激能力指標(biāo)也進(jìn)一步驗(yàn)證了一定劑量的新烏頭堿的確會(huì)對(duì)大鼠肝臟造成損傷。因此,在使用附子時(shí)要注意其劑量以及使用周期。