母牛分枝桿菌菌苗對HIV感染合并結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者外周血T細(xì)胞亞群的影響

楊正貴 蔣澤順 劉蘭 韓雪

AIDS是由HIV感染所引起的一種嚴(yán)重的免疫缺陷性疾病,是當(dāng)今全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。HIV主要攻擊人體CD4+T細(xì)胞,引起CD4+T細(xì)胞進(jìn)行性減少,CD8+T細(xì)胞相對增加,CD4+/CD8+比值倒置,進(jìn)而引起一系列疾病[1]。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染是AIDS患者最常見的機(jī)會性感染。MTB感染會加重HIV感染者的病程,是AIDS患者死亡的主要原因。為降低HIV感染者活動性結(jié)核病的發(fā)病率,須盡早在HIV感染者中對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)者進(jìn)行預(yù)防性治療。目前對于HIV感染合并LTBI者主要采用單獨口服異煙肼、利福平或利福布汀等進(jìn)行抗結(jié)核預(yù)防性治療[2]。但由于HIV感染者既要接受抗病毒治療又要接受抗結(jié)核治療,用藥時間長、用藥種類多、不良反應(yīng)大,很難全程堅持抗結(jié)核治療。

母牛分枝桿菌是1964年Boenicke從母牛乳腺中分離出來的無毒且快速生長的非結(jié)核分枝桿菌。因其具有良好的免疫治療和免疫預(yù)防作用[3-4],近年來廣泛應(yīng)用于腫瘤、哮喘、結(jié)核病的輔助免疫治療[5-6],也是世界衛(wèi)生組織在一項Ⅲ期臨床試驗中評估有效性和安全性的唯一菌苗,其在免疫正常人群LTBI者抗結(jié)核預(yù)防性治療方面的臨床應(yīng)用價值得到了廣泛認(rèn)可[7-9]。母牛分枝桿菌菌苗在結(jié)核病患者和結(jié)核菌素皮膚試驗強(qiáng)陽性學(xué)生人群中的使用開展研究較多,但在免疫缺陷人群中研究相對較少。本研究旨在探討HIV合并LTBI者使用母牛分枝桿菌菌苗后是否對其細(xì)胞免疫功能有一定的影響,為探索HIV感染者預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

對象和方法

一、研究對象

1.研究對象遴選:采用多中心前瞻性隊列研究方法,對2003年6月至2020年6月寧夏回族自治區(qū)銀川市AIDS管理機(jī)構(gòu)管理的HIV感染者進(jìn)行MTB感染篩查,排除拒絕結(jié)核菌素皮膚試驗者和過敏者,共篩查HIV感染者546例。經(jīng)結(jié)核菌素皮膚試驗篩查符合HIV感染合并LTBI標(biāo)準(zhǔn)者133例(24.4%)。按照研究對象納入和排除標(biāo)準(zhǔn),最終納入96例作為研究對象。按照銀川市所轄6個不同縣區(qū)劃分,以興慶區(qū)、西夏區(qū)篩查出的研究對象作為試驗組,以賀蘭縣、永寧縣、靈武市、金鳳區(qū)篩出研究對象作為對照組。試驗組63例,其中,男性55例(87.3%),女性8例(12.7%);年齡范圍為20～60歲,年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為36.0(31.0,47.0)歲;對照組33例,其中,男性31例(93.9%),女性2例(6.1%);年齡范圍為18～60歲,年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為36.0(31.0,49.0)歲。兩組患者年齡(Z=-0.460,P=0.645)、性別(χ2=0.435,P=0.510)分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:126400004540028529-01),所有研究對象均簽署知情同意書。

2.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HIV感染診斷:參照《中國艾滋病診療指南(2018年版)》[1];(2)HIV合并LTBI診斷:根據(jù)結(jié)核菌素皮膚試驗結(jié)果判定;(3)年齡:年齡范圍為18～70歲。

3.排除標(biāo)準(zhǔn):(1)肝、腎功能不全或有肝、腎疾病者;(2)確診為活動性肺結(jié)核者[10];(3)重度免疫缺陷患者(CD4+T細(xì)胞計數(shù)<200個/μl);(4)妊娠、哺乳期婦女;(5)合并其他嚴(yán)重疾病者;(6)有服用異煙肼禁忌證者;(7)吸毒者。

二、研究方法

1.結(jié)核菌素皮膚試驗:由培訓(xùn)合格的專業(yè)護(hù)士進(jìn)行操作。于研究對象左前臂內(nèi)側(cè)1/3處注射結(jié)核菌素純蛋白衍生物試劑(TB-PPD,北京祥瑞生物制品股份有限公司)0.1 ml,并在72 h后對注射部位進(jìn)行隨訪觀察。局部紅腫硬結(jié)平均直徑<5 mm或無紅腫硬結(jié)者判定為MTB感染陰性;局部有紅腫硬結(jié)且平均直徑≥5 mm,或有水皰、潰爛者判定為MTB感染陽性。

2.治療方法:(1)試驗組:在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的基礎(chǔ)上,注射母牛分枝桿菌菌苗22.5 μg/次(商品名:微卡,安徽龍科馬生物制藥有限公司,生產(chǎn)批號:20191001),每2周注射1次,共3次。(2)對照組:在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的基礎(chǔ)上,口服異煙肼300 mg/次(杭州民生藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)批號:T21F060),1次/d,連續(xù)服用6個月。

3.實驗室檢測:于治療前和治療結(jié)束后1個月、3個月隨訪時,采集研究對象晨起空腹肘部靜脈血5 ml,采用流式細(xì)胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]對CD4+、CD8+、CD3+等T細(xì)胞含量進(jìn)行檢測,試劑購自安捷倫生物(杭州)有限公司。另外,將研究對象靜脈血離心后利用全自動生化儀進(jìn)行檢測。

4.臨床觀察指標(biāo):(1)免疫指標(biāo):CD3+T細(xì)胞計數(shù)、CD4+T細(xì)胞計數(shù)、CD8+T細(xì)胞計數(shù)在治療前和治療結(jié)束后1個月、3個月的情況。(2)安全性評價:治療前后進(jìn)行肝功能及胃腸道功能進(jìn)行檢查,評估不良反應(yīng)發(fā)生情況。按照實驗室分析結(jié)果和臨床指標(biāo)判定是否異常。

5.質(zhì)量控制:通過邀請從事AIDS、結(jié)核病、檢驗、流行病學(xué)研究的專家結(jié)合本地區(qū)實際情況對治療方案進(jìn)行評估和篩選,并制定治療方案細(xì)則。在項目進(jìn)行之前,對各個管理機(jī)構(gòu)人員進(jìn)行任務(wù)分配,并且對其負(fù)責(zé)的部分進(jìn)行培訓(xùn),培訓(xùn)內(nèi)容包括注射結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物和母牛分枝桿菌菌苗接種程序,針管的選擇、劑量、注射部位、操作方式等。由于研究對象特殊,要求在問卷調(diào)查過程中,調(diào)查員要熟悉問卷中的每一個問題,以患者可接受的方式進(jìn)行調(diào)查,保證各項工作高效、高質(zhì)量地完成,每次工作要進(jìn)行及時記錄和查漏補缺。為每位研究對象建立檔案記錄本,內(nèi)容包括知情同意書、問卷調(diào)查內(nèi)容信息、各項指標(biāo)化驗報告單、藥品發(fā)放記錄單及不良反應(yīng)記錄表等。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、治療前肝功能情況

治療前,兩組研究對象谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶比值、谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、白蛋白等肝功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。具體見表1。

表1 治療前兩組研究對象肝功能指標(biāo)的比較

二、治療前后T細(xì)胞亞群水平變化情況

試驗組CD3+T細(xì)胞水平在治療后1個月和3個月均明顯高于治療前,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;CD4+和CD8+T細(xì)胞水平治療后3個月明顯高于治療前,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平在治療后1個月和3個月差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后3個月,試驗組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+比值均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。具體見表2。

表2 兩組研究對象治療前及治療后1個月和3個月T細(xì)胞亞群指標(biāo)變化情況比較

三、治療前后肝功能指標(biāo)水平變化情況

與治療前相比,對照組在治療后1個月谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯增高,堿性磷酸酶、白蛋白水平則明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;治療后3個月堿性磷酸酶水平明顯降低,谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平略高于正常值范圍(正常參考值:7～40 U/L)。與治療前相比,試驗組在治療后1個月和3個月所有肝功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后1個月,試驗組谷草轉(zhuǎn)氨酶水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;治療后3個月試驗組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均明顯低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。具體見表3。

表3 兩組研究對象治療前及治療后1個月和3個月肝功能指標(biāo)變化情況比較

四、不良反應(yīng)及退出治療情況

在治療過程中,對研究對象進(jìn)行肝功能檢測和癥狀篩查,建立不良反應(yīng)和不耐受人員退出機(jī)制。對照組由于失訪、肝功能異常(谷丙轉(zhuǎn)氨酶或谷草轉(zhuǎn)氨酶高于正常參考值3倍以上)及胃腸道反應(yīng)原因,導(dǎo)致治療完成率為84.9%(28/33),其中,肝功能異常占整個退出治療原因中的比例為3/5;試驗組無不良反應(yīng),無退出治療患者,治療完成率達(dá)到100.0%(63/63),明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.235,P=0.007)。

討 論

母牛分枝桿菌菌苗作為一種雙向免疫調(diào)節(jié)劑,近些年來被發(fā)現(xiàn)在預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展和治療中均有一定的效果,其預(yù)防LTBI的主要機(jī)制是通過提高感染者的固有和獲得性細(xì)胞免疫水平,尤其是升高CD4+T細(xì)胞的水平,升高CD4+/CD8+比值,提高針對MTB的特異性細(xì)胞免疫功能,阻止LTBI發(fā)展成為活動性結(jié)核病[11]。因其用藥時間短、不良反應(yīng)少等優(yōu)點,接受程度高。HIV感染人體后主要攻擊CD4+T細(xì)胞,典型的特征是持續(xù)性的CD4+T細(xì)胞缺失和功能異常,CD8+T細(xì)胞相對增加,導(dǎo)致CD4+/CD8+比例失調(diào)。因此,CD4+T細(xì)胞水平變化是評估HIV感染者臨床療效和預(yù)測疾病發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo),被用于HIV感染者隨訪觀察。如果HIV合并LTBI者能夠通過注射母牛分枝桿菌菌苗提高CD4+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞水平,就可以同時達(dá)到提高HIV感染治療療效和預(yù)防LTBI發(fā)生發(fā)展的雙重目標(biāo)。本研究顯示,HIV感染合并LTBI者注射母牛分枝桿菌菌苗后1個月,CD3+T細(xì)胞水平明顯高于治療前,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,CD4+和CD8+T細(xì)胞水平較治療前略有升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;治療結(jié)束3個月時,CD4+、CD8+、CD3+T細(xì)胞水平均明顯高于治療前,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值明顯高于口服異煙肼組,而CD8+T細(xì)胞水平明顯低于口服異煙肼組。這與方剛等[8]研究母牛分枝桿菌菌苗輔助抗結(jié)核治療方案治療肺結(jié)核效果一致。

世界衛(wèi)生組織推薦HIV合并LTBI者抗結(jié)核預(yù)防性治療主要選擇6～9個月口服異煙肼方案,而異煙肼的主要不良反應(yīng)是胃腸道刺激和肝功能損傷。本研究表明,口服異煙肼組中由于失訪、肝功能異常及胃腸道反應(yīng)等原因,導(dǎo)致最終治療完成率為84.9%;而試驗組在注射母牛分枝桿菌菌苗的整個過程中,無不良反應(yīng)發(fā)生及退出。對兩組研究對象在治療前與治療后1個月和3個月肝功能指標(biāo)水平變化研究發(fā)現(xiàn),與治療前相比,口服異煙肼組在治療后1個月谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯升高,堿性磷酸酶、白蛋白水平則明顯降低;治療后3個月堿性磷酸酶水平明顯降低,谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯升高。雖然所有的指標(biāo)水平均在正常值范圍內(nèi)變化,但是與治療前相比,口服異煙肼組無論在治療后1個月還是3個月谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶都保持在比較高的水平,而谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶作為判斷肝功能情況的轉(zhuǎn)氨酶,其升高程度越高,說明肝損傷的程度越高[12],提示口服異煙肼可能有增加HIV感染合并LTBI人群肝功能損傷的風(fēng)險。而且筆者研究還發(fā)現(xiàn),對照組在異煙肼治療完成后3個月,谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平仍略高于正常值范圍。谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高提示肝細(xì)胞受損或壞死,該指標(biāo)對此有著很強(qiáng)的敏感性和專一性[13],更加表明口服異煙肼會增加HIV感染合并LTBI者肝損傷的可能性。對兩組研究對象在治療結(jié)束后同一時間點分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在治療結(jié)束后1個月,注射母牛分枝桿菌菌苗組谷草轉(zhuǎn)氨酶水平低于口服異煙肼組;在治療結(jié)束后3個月,注射母牛分枝桿菌菌苗組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均明顯低于口服異煙肼組。高水平的谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶都是表明肝臟受損的特異性指標(biāo),說明相比于口服異煙肼的治療方法,注射母牛分枝桿菌菌苗可能對HIV感染合并LTBI者的肝功能損傷風(fēng)險更小。

泰國的一項臨床試驗發(fā)現(xiàn),在應(yīng)用異煙肼對HIV感染者進(jìn)行抗結(jié)核預(yù)防性治療的過程中,共有23.2%的患者發(fā)生不良反應(yīng)[14]。而對于母牛分枝桿菌菌苗用于抗結(jié)核預(yù)防性治療的安全性在多項研究中都得到了肯定,無論對于一般人群還是合并HIV感染者,都未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng),并且在治療結(jié)束后研究對象的肝功能未出現(xiàn)異常[15]。傳統(tǒng)的抗結(jié)核預(yù)防性治療方案需要口服異煙肼長達(dá)至少6個月,治療周期相對較長,難免導(dǎo)致患者依從性下降,出現(xiàn)失訪的情況,因此,治療完成率較低。此外,對于HIV感染合并LTBI者而言,同時服用抗病毒藥物和抗結(jié)核藥物加重了肝功能的損傷,且藥物之間的相互作用也更容易導(dǎo)致胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生。而母牛分枝桿菌菌苗不僅不良反應(yīng)少,也未發(fā)現(xiàn)對肝功能有損傷,并且縮短了抗結(jié)核療程,使患者的依從性更好,安全性更高。

本研究存在一定的局限性。目前對于LTBI篩查沒有“金標(biāo)準(zhǔn)”,而世界衛(wèi)生組織推薦的結(jié)核菌素皮膚試驗雖然可作為LTBI篩查的手段,但是對于重度免疫缺陷患者,其敏感度較低。另外,本研究屬于多中心研究,由于研究對象的特殊性,很難做到隨機(jī)分組,所以按照不同的HIV感染者定點管理治療單位給予不同的干預(yù)措施。

綜上,母牛分枝桿菌菌苗在一定程度上能夠改善HIV感染合并LTBI者的細(xì)胞免疫功能,而且具有較好的安全性,患者接受度高,為HIV感染者抗結(jié)核預(yù)防性治療提供了一種新的選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)楊正貴:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、文章撰寫、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱;蔣澤順:醞釀和設(shè)計實驗、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù);劉蘭:整理數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù);韓雪:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱