非前藥型第三代頭孢菌素結(jié)構(gòu)特征和譜學(xué)性質(zhì)的計(jì)算分析

余德觀,陳旭雷,翁約約,廖穎藝,王朝杰

1. 溫州市人民醫(yī)院藥劑科,浙江 溫州 325000 2. 溫州市中心醫(yī)院藥劑科,浙江 溫州 325000 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院藥劑科,浙江 溫州 325003 4. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,浙江 溫州 325035

引 言

自20世紀(jì)80年代開發(fā)的大多數(shù)第三代頭孢菌素因其抗菌譜廣,組織分布好,不良反應(yīng)較低等優(yōu)點(diǎn)而在臨床上廣泛使用。但隨著細(xì)菌耐藥性的增加,尤以革蘭陰性菌為主的多重耐藥菌檢出率呈快速上升趨勢(shì),產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)和碳青霉烯酶仍是腸桿菌科細(xì)菌最重要的耐藥機(jī)制[1]。頭孢菌素的結(jié)構(gòu)是在母核——頭孢菌素基本結(jié)構(gòu)(basic structure of cephalosporin,BSC)基礎(chǔ)上,通過改變其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)提高體外穩(wěn)定性,抗菌活性和對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性,如分別在α和α′位置增加氨基和氫原子,會(huì)導(dǎo)致堿性化合物在胃的酸性條件下質(zhì)子化,7β氨基對(duì)抗菌活性(X=H)至關(guān)重要,用烷氧基(—OR)替換C-7處的氫可提高抗菌活性,當(dāng)Z是五元雜環(huán)而不是六元雜環(huán)時(shí),6α氫對(duì)于生物活性和抗菌活性是必需的[2]。因此,對(duì)于頭孢菌素的結(jié)構(gòu)研究是拓展其藥學(xué)特性的有效手段。

光譜技術(shù)與量子化學(xué)計(jì)算相結(jié)合的方法已成為探究結(jié)構(gòu)行為和觀察藥物分子電子結(jié)構(gòu)最有效的方法之一[3]。有研究報(bào)道[4]X3LYP雜化密度泛函在預(yù)測(cè)諧波振動(dòng)頻率方面表現(xiàn)更準(zhǔn)確,Kostjukova[5]等用X3LYP雜化密度泛函方法計(jì)算研究了吖啶橙染料在水溶液中的振動(dòng)吸收光譜,分析了使用各種泛函和基組的計(jì)算結(jié)果后,證明其頻率一致性最好。在頭孢菌素的已有研究中,作為功能性藥物載體的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),由于其具有較好的親和性且三級(jí)結(jié)構(gòu)、凈電荷和溶解度大小均已熟知[6],Cheng等[7]研究了頭孢克洛等頭孢菌素與HSA的猝滅機(jī)制、結(jié)合模式和構(gòu)象變化,并對(duì)其結(jié)合進(jìn)行了熱力學(xué)分析,證實(shí)了其與HSA之間存在相互作用,同時(shí)Dittrich[8]等用密度泛函理論進(jìn)一步預(yù)測(cè)了頭孢克洛的晶體結(jié)構(gòu)和不同構(gòu)象的靜電勢(shì);Chaudhary[9]等通過光譜實(shí)驗(yàn)和理論量子化學(xué)方法研究了頭孢拉定的振動(dòng)光譜(紅外和拉曼)、NBO、AIM、化學(xué)反應(yīng)性等內(nèi)容。

由于頭孢菌素類品種繁多,其不同結(jié)構(gòu)間的性質(zhì)比較與特性仍缺乏系統(tǒng)性的研究。為了探索其內(nèi)在性質(zhì),促進(jìn)新藥研發(fā),確定藥物結(jié)構(gòu)變異的功能,針對(duì)我國抗感染藥物醫(yī)藥市場(chǎng)中占據(jù)市場(chǎng)份額較大的第三代頭孢菌素[10],篩選無需結(jié)構(gòu)修飾,性質(zhì)穩(wěn)定的非前藥型頭孢菌素頭孢布坦(ceftibuten,CTB)、頭孢唑肟(ceftizoxime,CZX)、頭孢地尼(cefdinir,CDR)、頭孢克肟(cefixime,CEC)、頭孢噻肟(cefotaxime,CTX)、頭孢曲松(ceftriaxone,CRO)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)和頭孢哌酮(cefoperazone,CFP)作為研究對(duì)象(見圖1),將借助密度泛函理論(density functional theory,DFT)探索其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)規(guī)律。

圖1 非前藥型第三代頭孢菌素在X3LYP/6-311+G(d,p)水平下的主要鍵長及其母核結(jié)構(gòu)Fig.1 The bond lengths and its core structure of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins by X3LYP/6-311+G(d,p)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化、IR、UV譜計(jì)算

本研究采用密度泛函理論方法X3LYP,在6-311+G(d,p)基組水平上對(duì)非前藥型第三代頭孢菌素的幾何結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,然后進(jìn)行水相中的紅外光譜、紫外-可見光譜計(jì)算,得到無虛頻的能量極小結(jié)構(gòu),并對(duì)波函數(shù)進(jìn)行電子結(jié)構(gòu)分析。密度泛函計(jì)算利用Gaussian16[11]程序?qū)崿F(xiàn),Chemoffice2018繪制分子幾何結(jié)構(gòu)圖,計(jì)算結(jié)果用Origin8.5作圖,其中IR譜采用矯正因子(0.969 8)[12]并比較其計(jì)算和實(shí)驗(yàn)峰位歸屬。

1.2 分子表面靜電勢(shì)、分子前線軌道分析

將波函數(shù)文件在Multiwfn3.8[13]程序中分別對(duì)分子表面靜電勢(shì)、原子電荷、紫外吸收分子軌道進(jìn)行分析,并通過可視化程序VMD和Multiwfn3.8繪制分子靜電勢(shì)分布圖、軌道圖和能隙數(shù)據(jù)。最后,根據(jù)可視化結(jié)果預(yù)測(cè)藥物的活性反應(yīng)位點(diǎn),并對(duì)其光譜性質(zhì)進(jìn)行研究。

1.3 反應(yīng)性描述符分析

利用概念密度泛函理論(conceptual density functional theory,CDFT)研究分子的親電/親核性,并解釋其反應(yīng)活性和反應(yīng)位點(diǎn)。全局反應(yīng)性描述符可用于闡明分子中的化學(xué)鍵、反應(yīng)機(jī)理和反應(yīng)位點(diǎn),比較化合物的反應(yīng)活性。全局反應(yīng)性描述符包括:電離勢(shì)(IP)、電子親和勢(shì)(EA)、電負(fù)性(χ)、整體硬度(η)、化學(xué)勢(shì)(μ)、整體親電指數(shù)(ω)和整體柔軟度(S),計(jì)算公式如式(1)—式(7)

IP=-εHOMO

(1)

EA=-εLUMO

(2)

χ=-(εLUMO+εHOMO)/2

(3)

η=(εLUMO-εHOMO)/2

(4)

μ=-χ=(εLUMO+εHOMO)/2

(5)

ω=μ2/2η

(6)

S=1/η

(7)

在CDFT中引入福井函數(shù),以衡量各個(gè)化合物當(dāng)電子數(shù)或外部化學(xué)勢(shì)發(fā)生變化時(shí)的電子密度差異。研究人員可以根據(jù)原子電荷,得出每個(gè)原子的福井函數(shù)值。一般來說,福井函數(shù)值越大,對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的反應(yīng)性越大,f+(r)越大代表親電性越大,f-(r)越大代表親核性越大,f0(r)越大則表明其與自由基的反應(yīng)能力強(qiáng)。簡縮福井函數(shù)公式如式(8)—式(10)

親核攻擊:f+=q(N+1)-q(N)

(8)

親電攻擊:f-=q(N)-q(N-1)

(9)

自由基攻擊:f0=[q(N+1)-q(N-1)]/2

(10)

式(8)—式(10)中:q為原子的電荷量;N為中性態(tài);N-1為電離1個(gè)電子狀態(tài);N+1為結(jié)合1個(gè)電子狀態(tài)。通過以上公式分別計(jì)算全局反應(yīng)性描述符和局部反應(yīng)性描述符參數(shù),并列表分析其反應(yīng)活性。

1.4 分子對(duì)接研究

通過從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)靶向蛋白(PDB:1AO6),使用Pymol軟件去除水分子和小配體后,加氫,計(jì)算電荷,導(dǎo)入POCASA系統(tǒng)(http://g6altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/)[14],并計(jì)算蛋白配體的最佳結(jié)合位點(diǎn),用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接,采用拉馬克遺傳算法(lamarckain genetic algorithm,LGA)進(jìn)行對(duì)接運(yùn)算。最后使用LigPlot+和Pymol對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 幾何結(jié)構(gòu)分析

分析非前藥型第三代頭孢菌素優(yōu)化后的藥物分子結(jié)構(gòu)(圖1),發(fā)現(xiàn)各頭孢菌素基本結(jié)構(gòu)BSC的二面角和鍵角相近,但由于取代基的不同,使得各個(gè)藥物取代基附近的空間結(jié)構(gòu)有所差異,其中N、O等原子對(duì)鍵長的影響較大。如CTB和CZX兩個(gè)藥物結(jié)構(gòu)相近,對(duì)比兩者之間的二面角數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),由于取代基的不同,CTB的C18-C15-C17-C19二面角為-33.697°,而CZX的N22-C13-C14-C15二面角卻為-19.897°,相同結(jié)構(gòu)間的二面角如C8-N5-C6-C9分別為55.474°和55.120°卻非常接近;對(duì)比CDR和CEC兩個(gè)藥物,相同結(jié)構(gòu)間的鍵角如CDR的 C22-N10-O7和CEC的C24-N12-O7非常相近,但由于取代基的不同,發(fā)現(xiàn)二面角中CDR的N10-C22-C24-C25和CEC的N12-C24-C26-C27剛好相反,這可能與取代基的空間效應(yīng)有關(guān),CEC的乙酸基占據(jù)體積較大,使噻唑環(huán)發(fā)生反轉(zhuǎn);對(duì)比CZX和CTX的幾何數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),基本結(jié)構(gòu)的鍵角數(shù)據(jù)也非常接近,由于CTX酯基的取代,C17-N10-C18-C22的二面角為45.998°,而CZX的C8-N5-C6-C9的二面角為55.120°,比較接近,由此可見該取代基對(duì)其他基團(tuán)空間位置的影響不大。

由于非前藥型第三代頭孢菌素中已有的結(jié)構(gòu)參數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)僅限CZX[15],對(duì)其的理論值和實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行線性回歸(圖2),計(jì)算決定系數(shù)R2和均方根誤差(root mean square error,RMSE),對(duì)比實(shí)驗(yàn)和理論數(shù)據(jù)基本吻合。

圖2 在X3LYP/6-311+G(d,p)水平下CZX鍵長鍵角理論和實(shí)驗(yàn)值線性回歸擬合Fig.2 The theoretically calculated bond lengths and bond angles of CZX by X3LYP/6-311+G(d,p) fit linearly with the experimental values

2.2 紅外吸收光譜

圖3 CZX (a)和CTX (b) 的實(shí)驗(yàn)和理論光譜圖Tfr:噻吩;ν:伸縮振動(dòng);γ:面外彎曲振動(dòng);δ:面內(nèi)彎曲振動(dòng)Fig.3 Experimental and calculated IR spectra of CZX (a) and CTX (b)Tfr:Thiofuran;ν:Stretching;γ:Out of plane bending;δ:In plane bending

以上圖譜信息基本與實(shí)驗(yàn)吻合,但也有一些差別,這些差別主要因?yàn)槔碚撚?jì)算模擬是計(jì)算單個(gè)分子的計(jì)算模式,而實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果是在固體粉末狀下的分子共同表現(xiàn)結(jié)果,分子間存在多種相互作用造成的[17]。除此發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)光譜3 330 cm-1附近出現(xiàn)較強(qiáng)水分峰[18],理論計(jì)算中卻沒有,這是由于計(jì)算單個(gè)分子的IR譜,所以沒有氫鍵締合的O—H峰?？傮w上,理論計(jì)算還是為分子的振動(dòng)情況提供了較為準(zhǔn)確的信息。

圖4 水相中CTB至CFP在X3LYP/6-311+G(d,p)水平下的基態(tài)紅外吸收光譜圖Fig.4 Ground-state infrared absorption spectra of CTB to CFP in water by X3LYP/6-311+G(d,p)

2.3 紫外-可見吸收光譜

有機(jī)化合物的紫外吸收光譜可以反映分子結(jié)構(gòu)中發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)的特性,通過光譜的解析可以了解共軛體系、空間位阻等對(duì)化合的影響。

非前藥型第三代頭孢菌素的紫外-可見吸收光譜在可見光范圍內(nèi)峰形較寬且強(qiáng),最強(qiáng)紫外吸收峰主要集中200～250和300～350 nm范圍[圖5(a,b)]。其中,CTB、CZX、CDR、CEC、CTX和CRO的最強(qiáng)吸收峰分別出現(xiàn)在220、241、303、311、241和242 nm附近,對(duì)比CTB和CZX發(fā)現(xiàn),由于CZX中N—O基團(tuán)的吸電子能力比CTB中遠(yuǎn)端的羧基強(qiáng),導(dǎo)致紫外波長發(fā)生紅移;對(duì)比CZX和CTX發(fā)現(xiàn),CTX由于酯基的存在使284 nm處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)峰,原因?yàn)轷セ纳珗F(tuán)作用,當(dāng)酯基與BSC等基本結(jié)構(gòu)處于非共軛狀態(tài)時(shí),總的吸收是各個(gè)生色團(tuán)吸收的總和,表現(xiàn)結(jié)果為284 nm處吸收強(qiáng)度的顯著增加;對(duì)比CDR和CEC發(fā)現(xiàn),CEC在結(jié)構(gòu)上由于乙酸基的存在,紫外峰整體發(fā)生了紅移,這也充分說明了BSC母核的取代官能團(tuán)存在吸電子基團(tuán)時(shí),能使紫外吸收峰發(fā)生紅移。而CFP由于苯環(huán)的存在,紫外光譜中由π—π*躍遷產(chǎn)生的特征吸收帶受到羥基取代基的影響,形成p—π共軛結(jié)構(gòu),吸收峰紅移,吸收強(qiáng)度增大,精細(xì)結(jié)構(gòu)消失,同時(shí),由于BSC母核形成的共軛作用以及羰基生色團(tuán)作用,降低了π*軌道能量,在吸收紫外光后可發(fā)生π—π*和n—π*躍遷,使吸收峰發(fā)生了紅移。

圖5 水相中在X3LYP/6-311+G(d,p)計(jì)算水平下非前藥型第三代頭孢菌素CTB-CEC(a)和CTX-CFP(b)的紫外光譜圖Fig.5 UV-Visible spectra of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins CTB-CEC (a) and CTX-CFP (b) in water by X3LYP/6-311+G(d,p)

通過計(jì)算的垂直激發(fā)能(E)、吸收波長(λ)、振子強(qiáng)度(f)和主要躍遷組態(tài)數(shù)據(jù)分析(表1)可知,其最大吸收峰的主要是由HOMO→LUMO+1,HOMO-2→LUMO和HOMO-1→LUMO+2等軌道電子躍遷貢獻(xiàn)的。

表1 水相中在X3LYP/6-311+G(d,p)計(jì)算水平下非前藥型第三代頭孢菌素的紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)Table 1 UV-Visible data of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins in water by X3LYP/6-311+G(d,p)

2.4 分子表面靜電勢(shì)

通過靜電勢(shì)圖分析(圖6),藍(lán)色區(qū)域表示負(fù)電荷或親電區(qū)域(電子的密集區(qū)域),易受到親電試劑的進(jìn)攻;紅色區(qū)域表示正電荷或親核區(qū)域,易受到親核試劑的進(jìn)攻;白色表示零電位區(qū)域。其中,黃球?qū)?yīng)靜電勢(shì)極大點(diǎn),藍(lán)球?qū)?yīng)靜電勢(shì)極小點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)非前藥型第三代頭孢菌素中極大點(diǎn)大多分布在羥基和氨基的氫原子附近,而極小點(diǎn)主要分布在羰基O原子和N原子較集中的部位。如CTB的極大點(diǎn)主要分布在噻唑環(huán)以及其他部位在羧基中的羥基氫原子附近,極小點(diǎn)主要分布在羰基O原子附近,分析認(rèn)為羥基在共軛條件下O原子的一對(duì)電子參與形成p—π共軛,使供電子能力較強(qiáng),容易受到親核試劑的攻擊;而羰基等基團(tuán)中,O的電負(fù)性比C大,誘導(dǎo)效應(yīng)使之吸電子能力增強(qiáng),容易受到親電試劑的攻擊。

圖6 非前藥型第三代頭孢菌素在X3LYP/6-311+G(d,p)水平下的靜電勢(shì)等值面圖Fig.6 Molecular electrostatic potential maps of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins

2.5 前線分子軌道分析

前線分子軌道(frontier molecular orbital,FMO)是一種分子軌道理論,通過對(duì)前線分子軌道的計(jì)算分析,可以預(yù)測(cè)分子的得失電子能力,在分子附近,HOMO和LUMO軌道分別提供和接受電子。非前藥型第三代頭孢菌素的前線軌道能隙的范圍都在3.62～4.49 eV之間(圖7),CAZ分子相對(duì)于其他分子有較低的HOMO和LUMO能隙Δε=3.62 eV,說明該分子具有較高的占據(jù)軌道,供電子能力最強(qiáng),分子最活潑。相反,CFP分子軌道的HOMO和LUMO的Δε較大,所受到的束縛力就較小,說明該分子更難接受電子。以上研究進(jìn)一步描述了這些分子軌道間的電子離域性,從而解釋了整個(gè)分子的穩(wěn)定性。

圖7 非前藥型第三代頭孢菌素前線分子軌道圖Fig.7 Frontier molecular orbital maps of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins

2.6 反應(yīng)性描述符

2.6.1 全局反應(yīng)性描述符

通過分析全局反應(yīng)性參數(shù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)(表2),非前藥型第三代頭孢菌素之間的反應(yīng)活性差異不大,其中,CAZ的親電指數(shù)(ω)最大,表明其得電子能力強(qiáng),反應(yīng)活性最高,CFP的(μ)值最低,硬度(η)最大,說明其對(duì)微干擾下化學(xué)體系電子云畸變的抵抗能力較強(qiáng),穩(wěn)定性最好。

表2 非前藥型第三代頭孢菌素在X3LYP/6-311+G(d,p)水平下的全局反應(yīng)性指數(shù)(單位:eV)Table 2 Global reactivity indexes of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins by X3LYP/6-311+G(d,p) (Unit:eV)

2.6.2 局部反應(yīng)性描述符

除了整體反應(yīng)性參數(shù)外,分子中的原子的局部反應(yīng)對(duì)于理解分子結(jié)構(gòu)的反應(yīng)機(jī)理也很重要。為進(jìn)一步判斷藥物分子的活性位點(diǎn),對(duì)非前藥型第三代頭孢菌素進(jìn)行局部反應(yīng)性指數(shù)分析,即簡縮福井函數(shù)(condensed fukui function,CFF) 中的(f+,f-,f-)以及軟度(s+,s-)和親電指數(shù)(ω+,ω-)。分析非前藥型第三代頭孢菌素CFF的f-、s-和ω-數(shù)值發(fā)現(xiàn)(表3),CDR和CAZ的f-、s-和ω-數(shù)值最大,表明這兩個(gè)藥物分子的第2位S原子(噻唑環(huán)上)和CTB的第20位S原子(噻唑環(huán)上) 最容易受到親電試劑的進(jìn)攻;而分析CFF的f+、s+和ω+中的極大值發(fā)現(xiàn),CAZ的f+、s+和ω+最大,表明該藥物分子的第31位C原子(羧基的α碳)最容易受到親核試劑的進(jìn)攻。以上局部反應(yīng)性描述符分析結(jié)果基本與靜電勢(shì)分析結(jié)果一致。

表3 非前藥型第三代頭孢菌素在X3LYP/6-311+G(d,p)水平下的簡縮福井函數(shù)值(單位:eV)Table 3 The condensed fukui function value of the non-prodrug-type third-generation cephalosporins by X3LYP/6-311+G(d,p) (Unite:eV)

2.7 分子對(duì)接研究

分子對(duì)接可以對(duì)藥物和生物大分子之間的相互作用做出模擬,可以更直觀地了解藥物與大分子之間相互作用的結(jié)合位點(diǎn)和作用力類型。通過分析CZX與HSA之間的結(jié)合方式發(fā)現(xiàn)(圖8),其作用力以疏水作用力、氫鍵、π-陽離子相互作用為主,結(jié)合位點(diǎn)較深。非前藥型第三代頭孢菌素與HSA之間通過氫鍵作結(jié)合的殘基主要有GLU292、ASN295、LYS444、ARG218、ARG222、ALA291等,通過疏水相互作用相結(jié)合的殘基主要有TRP216、LEU238、HIS440等(圖9)。發(fā)現(xiàn)形成氫鍵的原子大多為N或O原子,這與靜電勢(shì)的分析結(jié)果非常吻合,原因?yàn)闃O值點(diǎn)容易受到親電或親核試劑進(jìn)攻,使該原子得到或者失去電子形成氫鍵。

圖8 CZX與HSA的分子對(duì)接圖Fig.8 Molecular docking diagram of CZX and HSA

圖9 非前藥型第三代頭孢菌素與HSA的結(jié)合模式圖Fig.9 Binding mode diagrams between the non-prodrug-type third-generation cephalosporins and HSA

3 結(jié) 論

本研究系統(tǒng)全面地分析了非前藥型第三代頭孢菌素的結(jié)構(gòu)性質(zhì),可為該類藥物的生產(chǎn)質(zhì)控、檢測(cè)判斷、新藥開發(fā)、雜質(zhì)鑒定等多方面提供參考。