高聚合度菊粉通過(guò)調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸改善高脂飲食誘導(dǎo)的犬肥胖

陸 江,朱道仙,盧勁曄*,劉 莉,郝福星,吳 植,盧 煒,劉 靜

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院,泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,泰州 225300;3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,泰州 225300)

肥胖是犬最常見(jiàn)的代謝性疾病之一,近年來(lái)發(fā)病率不斷升高,成為寵物行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題,而且肥胖還可誘發(fā)糖尿病、高血壓等疾病,嚴(yán)重危害動(dòng)物健康,增加飼養(yǎng)成本[1-2]。研究表明,腸道與脂肪組織具有串?dāng)_現(xiàn)象,稱為腸-脂肪組織軸[3]。肥胖與腸-脂肪組織軸關(guān)系密切,腸道黏膜屏障功能障礙導(dǎo)致脂多糖易位產(chǎn)生的代謝性內(nèi)毒素血癥是肥胖癥最重要的啟動(dòng)因子之一[4-6]。因此,調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸有望成為肥胖防治的一種有效途徑。

菊粉是一種聚合度(degree of polymerization, DP)為2～60的果糖聚合物,具有降血糖和血脂、調(diào)節(jié)腸道菌群及提高免疫等多種生理功能,已廣泛應(yīng)用于豬、牛及家禽等動(dòng)物[7-9]。通常把DP≤10的稱為低聚合度菊粉,DP≥23的稱為高聚合度菊粉[10],不同聚合度的菊粉可產(chǎn)生不同的生理功能[11]。He等[12]研究發(fā)現(xiàn),高聚合度菊粉可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能影響腸-胰腺軸緩解急性胰腺炎,而低聚合度菊粉無(wú)此作用。王琦[13]研究表明,菊粉可降低高脂飲食小鼠的體重,且高聚合度菊粉效果優(yōu)于低聚合度菊粉。然而,高聚合度菊粉通過(guò)調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸改善肥胖癥的作用還有待于研究。因此,本試驗(yàn)主要研究高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬肥胖改善作用及其與腸-脂肪組織軸的關(guān)系,為高聚合度菊粉在犬抗肥胖功能性食品上的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物福利與倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)NSF202108),40只泰迪型貴賓犬由本單位美容實(shí)驗(yàn)犬舍提供,雄性,3歲,體重5.5 kg左右,健康狀況良好。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證為SYXK(蘇)2021-0037。

1.2 主要材料

高聚合度菊粉(Orafti? HP,聚合度≥23,純度>99%)購(gòu)于常州迪沙醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取40只泰迪型貴賓犬,隨機(jī)等分為5組:正常飼糧組(CD組)、高脂飼糧組(HFD組)、低劑量高聚合度菊粉組(LHI組)、中劑量高聚合度菊粉組(MHI組)和高劑量高聚合度菊粉組(HHI組)。試驗(yàn)前各組均以正常飼糧進(jìn)行2周適應(yīng)性飼喂。然后,CD組飼喂正常飼糧,HFD組飼喂高脂飼糧,LHI組、MHI組和HHI組分別飼喂含1.0%、3.0%和5.0%高聚合度菊粉的高脂飼糧。試驗(yàn)期為12周。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中,所有犬均單籠飼養(yǎng),每天08:30及16:30各喂食1次,所有犬每天自由活動(dòng)15 min左右?；A(chǔ)飼糧參考《犬營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NRC—2016)配制,各組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 體重、采食量和體脂率的測(cè)定

試驗(yàn)前稱量體重,然后每2周稱重1次,按公式:

體重增加率=(測(cè)量體重-初始體重)/初始體重×100%,計(jì)算體重變化情況。按:采食量=給予飼糧-剩余飼糧,每周計(jì)算1次采食量,按:平均采食量=總采食量/總時(shí)間,計(jì)算平均采食量。試驗(yàn)結(jié)束后,用EchoMRI體成分分析儀(美國(guó),EchoMRI LLC公司)測(cè)定體脂率。

1.5 血液生化檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),空腹經(jīng)橈外側(cè)靜脈采集各組試驗(yàn)犬的血液,3 000 r·min-1離心10 min得到血清。當(dāng)天用試劑盒測(cè)定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和葡萄糖(Glu)含量,試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。用ELISA試劑盒法(購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司)測(cè)定白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)、脂多糖(LPS)和D-乳酸含量。

1.6 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)

試驗(yàn)結(jié)束后,所有犬禁食12 h,然后按2.0 g·kg-1體重服用葡萄糖。在給藥后0、30、60、90和120 min,通過(guò)血糖檢測(cè)試劑盒測(cè)量橈側(cè)靜脈血液中的葡萄糖濃度。然后,以血糖濃度為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線,并計(jì)算出曲線下面積(AUC)。

1.7 胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)

在OGTT試驗(yàn)結(jié)束后第3天,按0.5 U·kg-1體重肌肉注射胰島素,在給藥后0、30、60、90和120 min,通過(guò)血糖檢測(cè)試劑盒測(cè)量橈側(cè)靜脈血液中的葡萄糖濃度。然后,以血糖濃度為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線,并計(jì)算出曲線下面積(AUC)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束后,分別取腹部皮下白色脂肪組織和結(jié)腸黏膜,用TRIzol法提取脂肪組織總RNA和結(jié)腸黏膜總RNA。然后合成cDNA并用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin) 為內(nèi)參基因,檢測(cè)脂肪組織中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)的mRNA相對(duì)表達(dá)量以及空腸黏膜中閉鎖蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。目的基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成,詳見(jiàn)表2。目的基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔΔCt法計(jì)算。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences for PCR

1.9 Western blot檢測(cè)

用RIPA裂解液提取皮下脂肪組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h,PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h,用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加Ⅰ抗IL-6(1∶2 000)、TNF-ɑ(1∶2 000)和GAPDH(1∶5 000),置于4 ℃搖床中孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,每次5 min。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次,每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J分析軟件對(duì)各組條帶的光密度值進(jìn)行分析,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。所有抗體均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。按上述方法,檢測(cè)結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1和MLCK表達(dá)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,兩組間數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,采用Pearson方法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬體重、采食量和體脂率的影響

從圖1a可知,各組犬體重呈增加趨勢(shì),HFD組體重從第2周開(kāi)始顯著高于CD組(P<0.05),MHI組和HHI組體重從第4周開(kāi)始顯著低于HFD組(P<0.05),LHI組體重從第8周開(kāi)始顯著低于HFD組(P<0.05)。從圖1b可知,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),HFD組體重增加率顯著高于CD組(P<0.05),約增加34%,各劑量高聚合度菊粉組的體重增加率顯著低于HFD組(P<0.05)。各組間平均采食量無(wú)顯著變化(圖1c)。HFD組犬體脂率顯著高于CD組,高聚合度菊粉以劑量依賴式降低高脂飲食犬的體脂率,與HFD組差異顯著(P<0.05,圖1d)。

a. 體重變化;b.體重增加率;c.平均采食量;d.體脂率。圖中CD正常飼糧組,HFD為高脂飼糧組,LHI、MHL和HHI分別為低劑量、中劑量和高劑量高聚合度菊粉組,下圖同。*表示與CD組比較P<0.05, #表示與HFD組比較P<0.05a. Body weight change; b. Body weight gain rate; c. Average feed intake; d. Body fat rate. In the figure, CD. Normal diet group; HFD. High fat diet group; LHI, MHL and HHI. Low-dose, medium-dose and high-dose high polymerization inulin groups, respectively. The same as below. * P<0.05 compared with CD group, and # P<0.05 compared with HFD group圖1 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬體重、采食量和體脂率的影響Fig.1 Effects of inulin with high degree of polymerization on body weight, feed intake and body fat rate in dogs fed with high-fat diet

2.2 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知,HFD組血中TG、TC和LDL-C的含量顯著高于CD組,HDL-C顯著低于CD組(P<0.05)。隨著高聚合度菊粉劑量的增加,高脂飲食犬血中TG、TC和LDL-C的含量逐漸降低,HDL-C含量逐漸升高,且HHI組與HFD組有顯著差異(P<0.05)。所有組之間的Glu含量無(wú)顯著差異。

表3 血液生化指標(biāo)的變化Table 3 Changes of blood biochemical indexes mmol·L-1

2.3 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血糖代謝的影響

從圖2a、圖2b可以看出,各組犬口服給予葡萄糖后,血糖值呈顯著增加趨勢(shì),在第30分鐘達(dá)到最高值,隨后血糖值呈逐漸降低趨勢(shì);與CD組相比,HFD組AUC顯著增加,高脂飲食中添加低、中、高劑量高聚合度菊粉后,LHI組、MHI組和HHI組的AUC顯著低于HFD組(P<0.05)。ITT結(jié)果顯示(圖2c、2d),各組犬肌肉注射胰島素后,血糖值呈顯著降低趨勢(shì),在第60 min 達(dá)到最低值,隨后血糖值呈逐漸增加趨勢(shì);與CD組相比,HFD組AUC顯著增加,高脂飲食中添加低、中、高劑量高聚合度菊粉后AUC呈降低趨勢(shì),HHI組的AUC顯著低于HFD組(P<0.05)。

a. 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)血糖變化;b. OGTT曲線下面積;c. 胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)血糖變化;d. ITT曲線下面積。*.P<0.05a. Changes of blood glucose in oral glucose tolerance test (OGTT); b. AUC of OGTT blood glucose curve; c. Changes of blood glucose in insulin tolerance test (ITT); d.AUC of ITT blood glucose curve. *. P<0.05 圖2 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血糖代謝的影響Fig.2 Effect of inulin with high degree of polymerization on blood glucose metabolism in dogs fed with high-fat diet

2.4 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬結(jié)腸黏膜屏障功能的影響

與CD組比較,HFD組血清中D-乳酸的含量顯著升高(P<0.01);與HFD組比較,MHI組和HHI組D-乳酸顯著降低(P<0.05,圖3a)。從圖3b可以看出,與CD組比較,HFD組結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào);不同劑量高聚合度菊粉均可回調(diào)這些mRNA相對(duì)表達(dá)量,MHI組和HHI組Occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于HFD組(P<0.05);HFD組結(jié)腸黏膜中MLCK的mRNA表達(dá)較CD組顯著上調(diào),而MHI組和HHI組MLCK的mRNA表達(dá)較HFD組顯著下調(diào)。Western blot結(jié)果顯示,與CD組比較,HFD組結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào),MLCK蛋白表達(dá)顯著上調(diào);與HFD組比較,MHI組和HHI組Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào),MLCK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖3c、3d)。

a. 血清中D-乳酸含量;b. 結(jié)腸黏膜中閉鎖蛋白、閉鎖小帶蛋白-1和肌球蛋白輕鏈激酶的mRNA相對(duì)表達(dá)量;c～d. 結(jié)腸黏膜中閉鎖蛋白、閉鎖小帶蛋白-1和肌球蛋白輕鏈肌酶的Western blot相對(duì)定量分析。*.P<0.05; **.P<0.01a. The content of D-lactic acid in serum; b. The relative mRNA expression of Occludin, Zonula occludens protein 1(ZO-1) and myosin light chain kinase(MLCK); c-d. The relative expression of occludin, ZO-1 and MLCK in colonic mucosa by Western blot.*.P<0.05; **.P<0.01圖3 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬結(jié)腸黏膜屏障功能的影響Fig.3 Effect of inulin with high degree of polymerization on colonic mucosal barrier function in dogs fed with high-fat diet

2.5 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血清及脂肪組織炎癥因子表達(dá)的影響

由圖4a、4b、4c 可知,與CD組比較,HFD組血清IL-6、TNF-ɑ和LPS含量顯著升高(P<0.01);隨著高聚合度菊粉劑量增加,高脂飲食犬血清IL-6、TNF-ɑ和LPS含量均呈下降趨勢(shì);與HFD組比較,MHI組TNF-ɑ和LPS含量顯著降低(P<0.05),HHI組IL-6、TNF-ɑ和LPS含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。高脂飲食犬血清LPS與IL-6、TNF-ɑ均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.663,P<0.001;r=0.695,P<0.001。圖4d、e)。HFD組脂肪組織中IL-6、TNF-ɑ的mRNA相對(duì)表達(dá)量較CD組顯著上調(diào),但隨著高聚合度菊粉劑量增加呈下調(diào)趨勢(shì),MHI組(P<0.05)和HHI組(P<0.01)均與HFD組有顯著差異(圖4f、4g)。Western blot結(jié)果顯示,與CD組比較,HFD組脂肪組織中IL-6、TNF-ɑ蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,與HFD組比較,MHI組和HHI組IL-6、TNF-ɑ蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05,圖4h、4i)。

3 討 論

肥胖是動(dòng)物能量代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致能量攝入超過(guò)消耗所引起的大量脂肪積聚于脂肪組織的一種代謝病,并且還可引發(fā)胰島素抵抗,加劇糖脂代謝紊亂,使病情惡化[14-15]。利用高能高脂飲食構(gòu)建動(dòng)物肥胖癥是研究肥胖發(fā)生機(jī)制以及尋求有效治療方法的極為重要方式[16],田威龍等[17]利用高能高脂飲食成功建立豬的肥胖模型。本試驗(yàn)以貴賓犬為試驗(yàn)動(dòng)物,給予高脂飼糧后,不僅體重、體脂率和血脂水平顯著增加,還發(fā)生了葡萄糖耐量受損及胰島素抵抗。本研究結(jié)果與之前一些研究結(jié)果相一致[18-19]。以上結(jié)果提示,本試驗(yàn)成功建立了高脂飼糧誘導(dǎo)的肥胖犬模型。給予高聚合度菊粉干預(yù)可降低高脂飲食犬的體重、體脂率及血脂水平,改善糖耐量受損和胰島素抵抗。這些結(jié)果說(shuō)明高聚合度菊粉對(duì)改善犬肥胖具有積極作用。

研究表明,白色脂肪組織(WAT)炎癥是促進(jìn)肥胖發(fā)展的重要因素。WAT中的脂肪細(xì)胞以及M1巨噬細(xì)胞可分泌大量的TNF-α及IL-6等促炎因子,這些促炎因子釋放到循環(huán)系統(tǒng),引起全身慢性低度炎癥,進(jìn)一步加劇代謝紊亂,加快肥胖及其相關(guān)代謝病的發(fā)展。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn),LPS易位介導(dǎo)的TLR4/NF-κB通路可促進(jìn)犬脂肪組織炎癥和肥胖。而腸黏膜屏障功能障礙是LPS易位的重要前提。腸道黏膜屏障是由腸物理屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障4個(gè)部分組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[21]。緊密連接是腸物理屏障的重要組成部分,由多種腸道緊密連接蛋白組成[22]。緊密連接蛋白Occludin主要負(fù)責(zé)調(diào)控緊密連接的通透性[23],ZO-1調(diào)控細(xì)胞骨架形成[24],MLCK可調(diào)控這些蛋白表達(dá)[25]。研究表明,緊密連接蛋白表達(dá)水平降低是機(jī)體腸道屏障功能損傷的主要原因[26-27],高脂飲食可通過(guò)誘導(dǎo)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)降低或分布異常引起腸黏膜屏障受損[28-29]。Kim等[30]發(fā)現(xiàn)高脂飲食可導(dǎo)致小鼠腸道中LPS易位進(jìn)入血液,誘導(dǎo)脂肪組織和肝中TLR4及其下游產(chǎn)物IL-6和TNF-α的高表達(dá)。細(xì)胞試驗(yàn)也表明,脂肪細(xì)胞中LPS-TLR4信號(hào)通路激活誘導(dǎo)的慢性低度炎癥與肥胖關(guān)系密切[31-32]。上述結(jié)果表明,腸-脂肪組織軸對(duì)話機(jī)能紊亂與肥胖有密切關(guān)系。本研究中,高脂飼糧組結(jié)腸黏膜中Occludin和ZO-1表達(dá)下調(diào),血清LPS和D-乳酸水平升高,血清中IL-6和TNF-α水平升高,脂肪組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)升高,給予高聚合度菊粉后,可逆轉(zhuǎn)這些變化。這些結(jié)果說(shuō)明高聚合度菊粉可以調(diào)節(jié)“腸黏膜屏障功能障礙-LPS易位-脂肪組織炎癥”這一腸-脂肪組織軸機(jī)能紊亂。

4 結(jié) 論

綜上,高聚合度菊粉可能通過(guò)改善“腸黏膜屏障功能-LPS易位-脂肪組織炎癥”這一途徑調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸,從而有效改善高脂飲食誘導(dǎo)犬的肥胖和血糖血脂代謝。