基于串聯(lián)親和層析法純化并鑒定豬初乳中SIgA

楊 悅,王 銳,甘 源,郝 飛,謝 星,張 磊,邵國青,孟慶國,陳 蓉*,馮志新, *

(1.南京師范大學海洋科學與工程學院,南京 210023;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點實驗室,南京 210014;3.南京農(nóng)業(yè)大學生命科學院,南京 210095;4.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

黏膜是脊椎動物免疫系統(tǒng)的第一道防線,分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)是黏膜免疫中結(jié)合病原,保護機體的主要效應分子[1-3]。SIgA主要以二聚體的形式存在,兩個IgA分子由一條J鏈(joining-chain)組裝形成二聚體,二聚體IgA與多聚免疫球蛋白受體(the polymeric Ig-receptor)的胞外區(qū),也叫分泌成分(secretory component,SC)相結(jié)合,形成完整的SIgA[4-5],隨后,SIgA借助分泌成分,從上皮固有層分泌到黏膜器官的腔面[3]。與其它免疫球蛋白類似,IgA分子是由兩條分子量約為55 ku的重鏈和兩條分子量約為25 ku的輕鏈組成,加上15 ku的J鏈和約為75 ku的分泌成分,SIgA的分子量約為400 ku[6]。除了形成主要的二聚體形式外,SIgA還存在四聚體,五聚體等更多元的聚合形式[7-8]。

近年來,基于IgA單克隆抗體的治療藥物研究越來越多[9-10]。針對結(jié)核分枝桿菌,大腸桿菌等呼吸道、消化道的病原,靶向黏膜免疫可產(chǎn)生特異性SIgA的黏膜疫苗也成為疫苗研究的新的方向[9,11]。病原感染機體后,SIgA出現(xiàn)時間相對較早,存在于取樣方便的黏膜分泌液中,因此特異性病原的SIgA也作為早期診斷試劑的靶標分子。如乳汁中豬流行性腹瀉病毒IgA抗體的檢測[12-13],胃癌的胃液分泌型IgA的檢測等[14],豬IgA雙抗夾心ELISA檢測方法的建立等[15]。無論是作為抗體治療藥物,還是檢測靶標,SIgA/IgA的分離純化是關(guān)鍵步驟。目前,SIgA的純化多以初乳為原材料,主要集中于人、鼠和牛[16-19]。本團隊曾采用傳統(tǒng)的硫酸銨鹽析法沉淀蛋白,DEAE52纖維離子、SephadexG-200凝膠層析和多次Protein A親和層析,最終分離純化出豬SIgA[20]。為了進一步提高豬SIgA的純化效率,本研究避開了費時的硫酸銨沉淀法,采用串聯(lián)親和層析,先用Protein G層析柱吸附過多的IgG,然后再用Protein A和Protein L層析柱結(jié)合SIgA,最后用陰離子柱Resource Q和分子篩Superose 6對親和層析柱上洗脫的蛋白進行精細純化,獲得了較高收率和較高純度且具有活性的豬SIgA,本研究旨在探究一種分泌型免疫蛋白球(SIgA)純化鑒定更高效的方法。

1 材料與方法

1.1 初乳的采集及乳清的分離

采集產(chǎn)仔當天的二元母豬初乳,4 ℃保存,然后用冷凍離心機5 000×g,在4 ℃下離心30 min,用移液器吸取中層乳清,并分裝保存于-40 ℃。

1.2 抗體與蛋白

陽性對照SIgA,為本實驗室每年由專人通過標準方法與流程[20],從產(chǎn)仔后2 d內(nèi)母豬初乳中提取,經(jīng)過鑒定后凍干,保存于-80 ℃的標準品?？关iSIgA的單抗購于Bethyl公司。SC蛋白和抗SC的單抗也為本實驗制備與保存[21]。

1.3 豬初乳SIgA的純化

取10 mL乳清,用PBS緩沖液5倍稀釋,然后用超高速離心機100 000×g,4 ℃離心1 h,再次吸取中層乳清并用0.22 μm 濾器過濾。用10倍柱體積的PBS緩沖液對Protein G(GenScript)、Protein A(GenScript)及Protein L(GenScript)進行平衡。將過濾后的乳清先到Protein G上進行掛柱,收集流穿液。Protein G的流穿液再依次到Protein A和Protein L柱上進行掛柱。最后用洗脫緩沖液(0.1 mol·L-1glycine,pH 3.0)對掛柱的蛋白進行洗脫并收集。蛋白被洗脫下來立即用1 mol·L-1Tris-HCl pH 8.0緩沖液進行中和,防止抗體長期在酸性環(huán)境中被破壞。

用SDS-PAGE進行鑒定,將含有目的蛋白的洗脫液使用超濾管進行離心濃縮,用低鹽緩沖液A(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,10 mmol·L-1NaCl)換液,然后用陰離子交換柱Resource Q(Cytiva)進行純化,通過緩慢增加高鹽緩沖液B(10 mmol·L-1Tris-HCl PH 8.0,1 mol·L-1NaCl)的比例來洗脫目的蛋白。收集在A280 nm處有吸收值的洗脫液,經(jīng)SDS-PAGE及Western blot鑒定,然后選取含有目的蛋白的峰進行下一步試驗。

最后用分子篩層析柱Superose 6(Cytiva)進行純化,緩沖液使用20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,300 mmol·L-1NaCl。收集在A280 nm處有吸收值的洗脫液,并通過SDS-PAGE及Western blot鑒定收集目的蛋白。整個蛋白的純化流程如圖1所示。

圖1 豬初乳SIgA的純化流程圖Fig.1 Flow diagram of the purification of SIgA from porcine colostrum

1.4 ELISA鑒定SIgA的特異性

將純化后的SIgA按照3 μg ·mL-1稀釋,每孔100 μL,4 ℃包被過夜,PBST清洗后用5% BSA(PBST緩沖液稀釋)37 ℃封閉2 h。用稀釋的HRP標記的羊抗豬SIgA的單抗(1∶10 000)37 ℃孵育1 h。最后每孔加入TMB 顯色液100 μL,37 ℃避光顯色8～10 min。加入50 μL終止液來終止反應,觀察結(jié)果。

1.5 Western blot鑒定SIgA的特異性

將純化后的SIgA經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜用含5%脫脂乳的TBST緩沖液4 ℃封閉過夜。TBST洗滌后加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗豬SIgA的單抗(TBST緩沖液稀釋),37 ℃,孵育2 h。最后加ECL顯色液顯色后曝光檢測。鑒定SC特異性是以SC單抗為一抗,37 ℃孵育2 h。加入1∶10 000稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG,37 ℃孵育2 h,其他步驟不變。

1.6 質(zhì)譜鑒定豬初乳SIgA

將純化后的SIgA進行SDS-PAGE電泳,然后用考馬斯亮藍染色液染色,最后用脫色液進行脫色。將SIgA的重鏈條帶及SC條帶切成膠粒,分別裝入1.5 mL EP管中,送上海拜譜生物科技有限公司進行質(zhì)譜鑒定。

每份樣品先用胰蛋白酶進行消化,然后使用Easy nLC 1200系統(tǒng)(Thermo Scientific)進行色譜分離。色譜柱使用反相Trap column(100 μm×20 mm,C18)以100%的0.1%甲酸水溶液平衡,再用0.1%甲酸乙腈水溶液進行洗脫,流速為300 nL·min-1,分析時間為60 min。

肽段分離后使用Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進行數(shù)據(jù)依賴采集式質(zhì)譜分析。分析時長為30 min,檢測模式為正離子,母離子掃描范圍為300～1 800 m/z,一級質(zhì)譜分辨率為30 000@m/z 200,二級質(zhì)譜分辨率為17 500 @ m/z 200。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索軟件使用 MaxQuant 1.6.17.0,檢索的數(shù)據(jù)庫為豬的參考蛋白組數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/proteomes/UP000008227)。

2 結(jié) 果

2.1 豬初乳乳清的分離

經(jīng)過低溫臺式離心機離心后,豬初乳可以明顯地分為3層,最上層為白色乳脂層,中間層為淡黃色乳清層,最底層為白色酪蛋白沉淀(圖2A),其中乳清層占90%～95%呈現(xiàn)懸濁液狀態(tài)。把乳清層用超速離心機離心后,依然分成乳脂,乳清和酪蛋白3層,乳清層變?yōu)橥该鞯臏\黃色(圖2B)。

A. 豬初乳經(jīng)過離心后的分層情況(經(jīng)過離心后可以分成3層,分別為乳脂層,乳清層和酪蛋白層,不同分層已經(jīng)用箭頭及相應文字進行標注);B. 經(jīng)過超速離心后的乳清層A. Stratification of porcine colostrum after centrifugation (The different layers have been marked with arrows and corresponding text); B. The whey layer after ultracentrifugation圖2 豬初乳經(jīng)離心后的分層情況及經(jīng)過超速離心后的乳清層Fig.2 Stratification of porcine colostrum after centrifugation and the whey layer after ultracentrifugation

2.2 串聯(lián)親和層析對豬初乳SIgA進行粗純

乳清樣品經(jīng)過SDS-PAGE,顯示在50和25 ku處各有一條條帶,分別對應免疫球蛋白的重鏈和輕鏈,提示在乳清中含有大量的免疫球蛋白(圖3A)。經(jīng)過Protein G和Protein A和Protein L掛柱后,用甘氨酸洗脫3個親和層析柱時,從Protein G柱上洗脫下來的蛋白最多,約有400 mg,其次為從Protein A柱上洗脫的蛋白,約有100 mg,從Protein L柱上洗脫下來的蛋白最少,大約只有40 mg。對洗脫下來的蛋白進行SDS-PAGE鑒定,發(fā)現(xiàn)從三個親和層析柱上洗脫下來的樣品均在55和25 ku處各有一條蛋白條帶(圖3B),為免疫球蛋白,但是尚無法區(qū)分IgG和SIgA,洗脫樣品的雜蛋白條帶較弱或者沒有,表明親和層析已經(jīng)達到一個較好的效果。由于理論上只有在Protein A和Protein L柱上洗脫下來的樣品中含有SIgA,因此,這對這兩個樣品進行進一步的純化。

A. 豬乳清層的SDS-PAGE分析(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1.分離的豬乳清);B.豬初乳乳清串聯(lián)親和層析純化過程中各樣品的SDS-PAGE分析(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1.乳清結(jié)合Protein G柱后的流穿液;2.Protein G柱的甘氨酸洗脫收集液;3.Protein A柱的甘氨酸洗脫收集液;4.乳清結(jié)合Protein G柱后又結(jié)合Protein A柱后的流穿液;5～6.Protein L柱的甘氨酸洗脫收集液)A. SDS-PAGE analysis of the porcine whey layer (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Isolated porcine whey); B. SDS-PAGE analysis of each sample during the tandem affinity chromatography purification of porcine colostrum whey (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Flow-through after whey binding to Protein G column; 2. Glycine eluent collection from Protein G column; 3.Glycine eluent collection from Protein A column; 4. Flow-through after whey binding to Protein G column and then to Protein A column; 5-6. Glycine eluent collection from Protein L column)圖3 豬初乳乳清親和層析純化過程中的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of porcine colostrum whey during affinity chromatography purification

2.3 離子交換和分子篩層析對豬初乳SIgA進行精細純化

從Protein A柱上洗脫下來的蛋白,進行離子交換時,蛋白分別在15%和35%的離子強度處各有一個洗脫峰,分別命名為P1峰和P2峰(圖4A)。其中P1峰的面積遠遠大于P2峰,表明 P1峰有更多的蛋白。SDS-PAGE對各個峰的不同收集管進行鑒定,發(fā)現(xiàn)各個收集管在55和25 ku處都各有一條蛋白條帶。對P1峰和P2峰的蛋白條帶進行進一步的對比,發(fā)現(xiàn),P2峰收集的蛋白,55 ku處條帶要相對P1峰的要略微偏上,即蛋白要略微偏大(圖4A)。根據(jù)之前的研究,SIgA的重鏈要比IgG的重鏈要略微偏大[20](圖5),因此推測P1峰為IgG,P2峰為SIgA。為了進一步確定P1和P2峰的蛋白性質(zhì),作者用羊抗豬SIgA重鏈的抗體對兩個峰的蛋白進行免疫印跡,結(jié)果表明,抗體可以很好地與P2峰的蛋白,還有陽性對照SIgA進行反應,而與P1峰的蛋白,豬的IgG,BSA等不發(fā)生反應(圖4B)。因此,P2峰是主要含有SIgA的目的峰。

A. Protein A柱純化蛋白的離子交換層析(橫坐標為洗脫體積,縱坐標為A280 nm的吸光值,次坐標為電導率。P1和P2兩個峰分別用箭頭標出。插入的SDS-PAGE圖為目的蛋白洗脫收集峰各個收集管的鑒定,其中1～4號收集管來源于P1收集峰;5～9號收集管來源于P2收集峰);B. 離子交換層析洗脫峰的Western bolt鑒定(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. P1峰的蛋白樣品;2. P2峰的蛋白樣品;3. SIgA標準品;4. 豬的IgG;5. BSA)A. Ion-exchange chromatography of protein purified by Protein A column (The horizontal coordinate is the elution volume, the vertical coordinate is the absorbance value of A280 nm and the secondary coordinate is the conductivity. Two peaks, P1 and P2, are marked with arrows respectively. The inserted SDS-PAGE plots show the identification of the individual collected fractions of the elution peaks of the target protein, where fractions 1-4 are from the P1 peak; fractions 5-9 are from the P2 peak); B. Western bolt identification of the collected fractions from ion exchange chromatography (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Protein sample of the P1 peak; 2. Protein sample of the P2 peak; 3. SIgA standards; 4. Pig IgG; 5. BSA)圖4 Protein A柱純化蛋白的離子交換層析及相應洗脫峰樣品的Western bolt鑒定Fig.4 Ion-exchange chromatography of Protein A column purified proteins and Western bolt identification of the corresponding elution peak samples

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. SIgA;2. IgGM. Protein relative molecular quality standard; 1. SIgA; 2. IgG圖5 SIgA及IgG的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of SIgA and IgG

類似,從Protein L柱上洗脫下來的蛋白進行離子交換層析時,出現(xiàn)了P1峰、P2峰和P3峰3個峰,分別在15%、35%和50%的離子強度處被洗脫(圖6A)。對三個峰收集的蛋白進行SDS-PAGE鑒定,結(jié)果顯示:P1、P2峰的蛋白在55和25 ku處均各有單一的條帶(圖6A),其中P2峰55 ku 處的重鏈要略大于P1峰的重鏈,推測P1峰為IgG,P2峰為SIgA。P3峰的蛋白條帶位于33～25 ku,可能為殘留的酪蛋白或者乳清中的其它蛋白。此外P2峰的所有收集管在70～90 ku有一條額外的條帶,推測可能是SIgA上的SC片段。對P1和P2峰收集的蛋白進行Western blot鑒定,結(jié)果顯示P2峰的蛋白能夠與羊抗豬SIgA重鏈的抗體于55 ku發(fā)生特異性結(jié)合,與陽性對照SIgA出現(xiàn)條帶的位置一致(圖6B),判斷P2峰為SIgA。而抗體與P1峰蛋白,豬的IgG和BSA都沒有明顯反應。

A. Protein L柱純化蛋白的離子交換層析(橫坐標為洗脫體積,縱坐標為A280 nm的吸光值,次坐標為電導率。P1、P2和P3峰分別用箭頭標出。插入的SDS-PAGE圖為目的蛋白洗脫收集峰各個收集管的鑒定,其中1號收集管來源于P1收集峰;2～7號收集管來源于P2收集峰,8～9號收集管來源于P3收集峰);B. 離子交換層析洗脫峰的Western bolt鑒定(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. P1峰的蛋白樣品;2. P2峰的蛋白樣品;3. P3峰的蛋白樣品;4. SIgA標準品;5. 豬的IgG;6. BSA)A. Ion-exchange chromatography of protein purified by Protein L column (The horizontal coordinate is the elution volume, the vertical coordinate is the absorbance value of A280 nm and the secondary coordinate is the conductivity. Peaks P1, P2 and P3 are marked with arrows respectively. The inserted SDS-PAGE plots show the identification of the individual fractions from the elution peaks of the target protein, where fraction 1 is from the P1 peak; fractions 2-7 are from the P2 peak and fractions 8-9 are from the P3 peak); B. Western bolt identification of the ion exchange chromatography elution peaks (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Protein sample of the P1 peak; 2. Protein sample of the P2 peak; 3. Protein sample from P3 peak; 4. SIgA standards; 5. Pig IgG; 6. BSA)圖6 Protein L柱純化蛋白的離子交換層析及相應洗脫峰樣品的Western bolt鑒定Fig.6 Ion exchange chromatography of Protein L column purified proteins and Western bolt identification of the corresponding elution peak samples

經(jīng)過上述陰離子柱交換層析,發(fā)現(xiàn)通過Protein L柱純化得到的SIgA蛋白更多,陰離子交換層析時的峰型更好,因此,選取圖6中的P2峰,進行進一步的分子篩層析。分子篩層析結(jié)果顯示,蛋白主要在13 mL 左右出現(xiàn)較為單一的峰(圖7A),在10和15.5 mL左右分別由一個較小的峰。SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn),主峰蛋白在55和25 ku各有一條蛋白條帶,提示為免疫球蛋白。10 mL左右的小峰,蛋白條帶位于70～90 ku,推測可能是SC蛋白。

A. 分子篩純化(橫坐標為洗脫體積,縱坐標為A280 nm的吸光值,其中主峰為目的蛋白。插入的SDS-PAGE圖為目的蛋白洗脫收集峰各個收集管的鑒定,其中1號管為分子篩純化上樣前的樣品。2～4為10 mL出小峰的收集樣品,5～9為主峰收集的樣品,10為15.5 mL處小峰收集的樣品);B. Western bolt鑒定(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. 主峰收集的樣品;2. SIgA標準品;3. IgG;4.BSA)A. Molecular sieve purification (The horizontal coordinate is the elution volume and the vertical coordinate is the absorbance value of A280 nm. where the main peak is the target protein. The inserted SDS-PAGE plot shows the identification of the individual collected fractions for the elution peaks of the target protein, where lane 1 is the sample prior to molecular sieve purification; lanes 2 to 4, are the collected fractions at 10 mL of the small peak; lanes 5 to 9 are the fractions collected from the main peak and lane 10 is the fraction collected from the small peak at 15.5 mL); B. Western bolt identification (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Sample collected from the main peak; 2. SIgA standards; 3. IgG; 4. BSA)圖7 SIgA的分子篩純化及Western bolt鑒定Fig.7 Molecular sieve purification and Western bolt identification of SIgA

15.5 mL處的小峰,在55和25 ku各有一條蛋白條帶,可能為殘留的少量IgG。Western blot鑒定,結(jié)果顯示主峰的蛋白能夠與羊抗豬SIgA重鏈的抗體在55 ku發(fā)生特異性結(jié)合,與泳道2陽性對照結(jié)果一致(圖7B)。判斷該主峰為豬的SIgA。

2.4 ELISA和Western blot 鑒定純化的豬初乳SIgA

由于純化的SIgA可用于ELISA測定,因此,我們用ELISA的方法來鑒定SIgA是否可以很好地被抗IgA(重鏈)的特異性抗體識別。結(jié)果顯示,與BSA相比,本研究純化的SIgA和SIgA陽性對照[20]與都抗IgA(重鏈)的抗體具有顯著的反應性。而本研究純化的SIgA與抗體的反應性與SIgA陽性對照相當,甚至還略高于SIgA陽性對照。因此,通過本論文中構(gòu)建的SIgA的純化方法,保留了SIgA的特性(圖8)。

1. Protein L柱洗脫收集液純化后的SIgA;2. Protein A柱洗脫收集液純化后的SIgA;3. SIgA標準品;BSA. 陰性對照;****表示差異極顯著(P<0.000 1);*表示差異顯著(P<0.05);ns表示差異不顯著(P>0.05)1. SIgA purified by Protein L column; 2. SIgA purified by Protein A column; 3. SIgA standards; BSA is the negative control; **** indicates a highly significant difference (P<0.000 1); * indicates a significant difference (P<0.05); ns indicates a non-significant difference (P>0.05)圖8 ELISA法檢測SIgA特異性Fig.8 ELISA assay for SIgA specificity

血清IgA與SIgA的不同之處在于,血清IgA不含有SC成分,SC是分泌型IgA的特有組分,因此,作者用抗SC的單抗對純化過程中的樣品進行了Western bolt雜交。其結(jié)果顯示,與商品化SC片段一致,不同純化階段的SIgA都能夠與抗SC的單抗反應,在70～95 ku有一條明顯的條帶;但是IgG和BSA沒有特異性的條帶(圖9)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. Protein A柱洗脫純化的SIgA蛋白;2. Protein L柱洗脫純化的SIgA蛋白;3. 分子篩純化時SIgA收集峰蛋白;4. 商品化SC;5. IgG;6. BSAM. Protein relative molecular quality standard; 1. SIgA protein purified by Protein A column; 2. SIgA protein purified by Protein L column; 3. SIgA protein collected during molecular sieve purification; 4. Commercial SC; 5. IgG; 6. BSA圖9 不同純化階段蛋白樣品與抗SC單抗的Western bolt驗證Fig.9 Western bolt verification of protein samples with anti-SC monoclonal antibody at different stages of purification

2.5 質(zhì)譜鑒定豬初乳SIgA

為了進一步確認純化得到的蛋白為SIgA,把重鏈對應的條帶以及疑似SC的條帶(圖10)進行了質(zhì)譜鑒定(圖11)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. 純化后的SIgA蛋白M. Protein relative molecular quality standard; 1. Purified SIgA protein圖10 純化后SIgA的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of purified SIgA

A. SC總離子圖譜;B. SIgA(重鏈)總離子圖譜A. SC total ion mapping; B. Total ion mapping of SIgA (heavy chain)圖11 純化后SIgA的質(zhì)譜鑒定Fig.11 Mass spectrometry identification of purified SIgA

重鏈對應條帶的質(zhì)譜結(jié)果顯示(表1),豐度最高,匹配性最好,覆蓋度最好,匹配的多肽條數(shù)最多的為豬的IgA重鏈區(qū)域(uniprot No.: A0A287B626),此外結(jié)果中豬的J鏈也占了相當?shù)谋壤?uniprot No.:A0A287BJU0;A0A5G2QR26;F1RUQ0;A0A287BEC0;A0A287BJL0;A0A287B5V2;A0A287BQC8)。疑似SC條帶的質(zhì)譜進行搜庫后,與豬的多聚免疫球蛋白受體,即SC(uniprot No.:A0A5G2RA19;F1SEY8;A0A287A0N2; A0A287B644;F1SEZ3;A0A287ADL4),有最好的匹配度,因此確定70～95 ku的條帶為SC片段。因此,可以判定純化得到的蛋白確實為豬的SIgA。

表1 SIgA(重鏈)及SC鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of SIgA (heavy chain ) and SC mass spectrometry

3 討 論

近年來,SIgA作為黏膜免疫的“主角”,其作為診斷靶標和治療藥物越來越受到重視[1,9]。相對IgG的純化,SIgA的提取更具有挑戰(zhàn)性[17,20]。與大部分傳統(tǒng)的SIgA純化方法相比[17,20],本研究在如下幾個方面具有創(chuàng)新和純化優(yōu)勢:1)離心步驟中,增加了超速離心,可以使酪蛋白沉淀地更徹底,使乳清層得到一個更好的分離,減少了下一個純化步驟中雜質(zhì)蛋白的非特異性吸附。2)先用Protein G填料吸附乳清中的大部分IgG,這樣避免由于大量的IgG吸附導致與Protein A及Protein L吸附的SIgA減少,最后使SIgA的收率減少。此外還避免在離子交換這一過程中,過多的IgG蛋白,增加純化次數(shù)及對柱子造成的損害。3)所用的強陰離子柱Resource Q,比DEAE52弱陰離子填料具有更強的蛋白吸附能力,洗脫時具有更好的分辨率。分子篩Superose 6也比SephadexG-200具有更好的分辨率。這將使純化獲得的蛋白具有更高的純度。4)在收率上,10 mL的初乳可以得到3 mg的SIgA蛋白,而使用傳統(tǒng)方法,相同的初乳,獲得SIgA的量只有1/3。5)從活性和完整性上,從ELISA的結(jié)果可以看出,相比本實驗室保存的豬SIgA,本方法純化的SIgA與抗豬IgA重鏈的抗體具有更好的反應性(圖8)。此外,本方法純化的SIgA與抗SC的抗體具有很好的反應性,表明純化的SIgA較好得保留了SC的部分(圖9),另外,從SDS-PAGE膠圖上看SC的條帶也比本實驗室保存的SIgA明顯,提示本純化方法可能更有利于SIgA的完整性。

與之前構(gòu)建的方法不同的是,在本方法中洗脫的蛋白沒有出現(xiàn)IgM。豬IgM的重鏈條帶大概在75 ku左右[20],可以在沒有進行任何純化的乳清以及親和層析的流穿液中發(fā)現(xiàn)(圖3)。本研究與2011年方法的主要差異,是本方法先用Protein G、Protein A和Protein L進行的串聯(lián)親和層析,這些填料與豬IgM的親和力還是未知。其中Protein G,與人的IgM和IgA有非常弱的親和力,但是對鼠的IgM和IgA卻沒有親和力,因此推測,在本方法中豬初乳中的IgM很有可能沒有結(jié)合到親和層析柱上,從而后繼的純化過程中也不會出現(xiàn)。而2011年的方法IgM是先過的SephadexG-200分子篩層析的時候出現(xiàn)的,此過程乳清中的所有蛋白都會出現(xiàn),因而出現(xiàn)了上述差異。

本研究可以看出,相比SIgA,豬初乳中IgG的含量占了有絕對的優(yōu)勢。進行串聯(lián)親和層析后,從Protein G柱上洗脫了400 mg IgG,Protein A柱洗脫蛋白進行離子交換時,IgG還是占據(jù)了主要部分(圖4A),甚至Protein L上洗脫的蛋白進行離子交換時,IgG峰依然要比IgA高(圖6A)。鑒于此,推測豬初乳中IgG含量顯著高于SIgA的原因,可能有如下三點:1)初乳中含有較多的SIgA,但是IgG依然為主要的抗體組分。2)SIgA的含量也有可能與初乳采集的時間有關(guān),本研究用的初乳是產(chǎn)后當天采集的,此時SIgA的分泌量可能還不多。3)SIgA存在較多的糖基化,可能導致其與填料的親和力下降,導致純化得到的SIgA不多。

本研究一方面為從豬初乳中純化SIgA提供了更高效的方法,為豬病的黏膜抗體診斷試劑盒提供原材料,另一方面也可為從其它動物初乳中提純SIgA提供參考。

4 結(jié) 論

采用串聯(lián)親和層析,強陰離子柱和精細分子篩層析進行純化,建立了一種從豬初乳中純化SIgA的高效純化方法,使用本方法純化的SIgA較原先方法(即硫酸銨沉淀,DEAE52弱陰離子層析,SephadexG-200凝膠層析和多次親和層析的純化方法)具有更高的反應性。