加味三黃膏治療大鼠肛門潰瘍和腫脹的藥效機制研究 Δ

張馨月 ，于 倩 ，李勝楠 ，楊亦柳 ，李文杰 ，陳 越 ，嚴銘銘 ， （.長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院/長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 307；.吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，長春 307）

痔瘡是臨床常見的肛腸科疾病，病灶位于肛門部位，其常見癥狀包括肛門潰瘍、直腸腫脹等，具有較高的發(fā)病率，任何年齡段均可發(fā)生，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。有研究認為，痔瘡的發(fā)病原因包括肛管下黏膜靜脈曲張、肛管部位靜脈瓣因壓迫導(dǎo)致靜脈回流障礙等[2]。臨床常用的治療方法有藥物治療、門診手術(shù)治療和外科手術(shù)治療，但手術(shù)治療容易損傷肛門周圍括約肌，而致患者大便失禁，術(shù)后肛門口疤痕攣縮，嚴重者可致肛門狹窄、排便困難[3—4]。

三黃膏始載于《醫(yī)心方》，原方由大黃、黃連、黃芩3味藥材組成，本研究在此基礎(chǔ)上加入地榆、冰片2 味藥材，其中地榆具有涼血止血、清熱解毒、培清養(yǎng)陰、消腫斂瘡的功效，冰片用于治療瘡瘍腫痛、潰后不斂。5味藥材均有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，共奏清熱涼血、解毒消腫之功。臨床研究表明，三黃膏能有效減輕患者的痔瘡水腫，緩解疼痛，同時對患者術(shù)后肛門疼痛、出血、瘢痕形成等有明顯的改善和預(yù)防作用[5]，但其作用機制尚不明確。本研究利用冰醋酸和巴豆油建立大鼠肛門潰瘍和腫脹模型，對加味三黃膏治療模型大鼠的藥效機制進行研究，旨在為闡明加味三黃膏治療痔瘡的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括AB265-S 型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、CP223C 型電子天平（美國OHAUS 公司）、INFINITE M200PRO 型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）、DT5-2B 型低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

黃連、大黃、黃芩、地榆、冰片飲片均購自長春宏檢大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教授鑒定均為真品；兔瞬時受體電位通道V1（transient receptor potential channel V1，TRPV1）抗體、兔P 物質(zhì)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＆L）抗體、免疫組化試劑盒（批號分別為bs-23926R、bs-0065R、bs-40295G-HRP、IHC001）和蘇木精-伊紅（HE）染液均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏（批號210235，規(guī)格10 g/支）和復(fù)方角菜酸酯乳膏（批號LCJ9275，規(guī)格20 g/支）均購自長春宏檢大藥房；白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；伊文思藍購自上海麥克林生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康成年SD雌性大鼠，8～10周齡，體重（210±10）g，購自宏達生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2020-0001。所有大鼠于溫度（24±2）℃、相對濕度（60±10）%的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。動物實驗通過長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準，批準號為2021218。

2 方法

2.1 不同劑量加味三黃膏的制備

按照相關(guān)文獻方法[6]和前期預(yù)實驗結(jié)果進行制備：取大黃、黃芩、黃連各5.0 g，酌予斷碎，加入米醋沒過藥材，浸泡過夜；鍋中加入80 g豬油預(yù)熱，將上述藥材同置鍋中炸枯，去渣，濾過得藥油；取1.0 g 冰片與2.5 g 地榆粉末（過120目篩），置于藥油中，加入適量蜂蠟混勻，冷卻至室溫，即得藥膏50 g，作為中劑量加味三黃膏。同法制備低、高劑量加味三黃膏（5味藥材的取樣量分別為中劑量的1/2和2倍）。

2.2 大鼠肛門潰瘍實驗

2.2.1 分組、建模與給藥

取大鼠70只，隨機取10只作為空白組，其余大鼠按照相關(guān)文獻方法[7]建立肛門潰瘍模型：將經(jīng)99%冰醋酸溶液充分浸泡的濾紙片（直徑6 mm）置于大鼠肛門，使濾紙片緊密接觸肛周皮膚及黏膜，并于40 s 時更換1 次濾紙片，80 s時取下濾紙片。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，為了防止模型大鼠死亡，將造模成功且體重排名前10位的大鼠作為模型組，其余造模成功的大鼠隨機分為中藥陽性對照組（馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏1 g/kg）[8]、西藥陽性對照組（復(fù)方角菜酸酯乳膏，按照人鼠體表面積換算藥物劑量為1 g/kg）[9]和加味三黃膏低、中、高劑量組（185、370、740 mg/kg），每組10 只。各給藥組大鼠每天在肛門內(nèi)2 cm處涂抹相應(yīng)藥物1次，連續(xù)給藥15 d。

2.2.2 指標(biāo)考察

分別于給藥前（第0 天）及給藥第6、9、11、13、15 天稱量各組大鼠體重，計算體重增加量；觀察肛門潰瘍情況，測量肛門潰瘍的最大直徑，并計算潰瘍面積：潰瘍面積（mm2）＝π×（潰瘍面最大直徑/2）2；同時參考相關(guān)文獻方法[10]，根據(jù)潰瘍面積大小、炎癥液體滲出情況和肛周腫脹情況對給藥第15 天的大鼠進行肛門潰瘍等級評價：+++表示有大量炎癥液體滲出，潰瘍面積大于35 mm2，肛門邊緣為暗紅色，紅腫隆起大于1.3 mm；++表示有較多炎癥液體滲出，潰瘍面積為25～35 mm2，肛門邊緣為紅色；+表示有少量炎癥液體滲出，潰瘍面積為15～＜25 mm2，肛門邊緣為淡粉色。

2.3 大鼠直腸腫脹實驗

2.3.1 分組、建模與給藥

取大鼠70只，隨機取10只作為空白組，其余大鼠按照相關(guān)文獻方法于肛門內(nèi)注入巴豆油混合液（蒸餾水、吡啶、乙醚、6%巴豆油按體積比1∶4∶5∶10 混合[11]）造成大鼠直腸黏膜水腫，以建立直腸腫脹模型，直腸在接觸巴豆油6 h 后達到腫脹峰值[12]。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，為了防止模型組大鼠死亡，將建模成功且體重排名前10 位的大鼠分為模型組，剩余大鼠隨機分為中藥陽性對照組（馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏1 g/kg）[8]、西藥陽性對照組（復(fù)方角菜酸酯乳膏，按照人鼠體表面積換算藥物劑量為1 g/kg）[9]和加味三黃膏低、中、高劑量組（185、370、740 mg/kg），每組10只。各給藥組大鼠在直腸接觸巴豆油6 h時，在肛門內(nèi)2 cm處涂抹相應(yīng)藥物1次，4 h后第2次涂抹相應(yīng)藥物。

2.3.2 大鼠血清中炎癥因子含量和直腸肛門腫脹率的檢測

取大鼠70 只，按“2.3.1”項下方法分組、建模、給藥。第2次給藥后2 h取血，根據(jù)試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α 含量；然后處死大鼠，從肛門起取向上15 mm 長的直腸，即從肛門皮毛邊緣起剪切，修剪肛門皮毛及直腸周圍結(jié)締組織后稱重，即得直腸濕重；將取出的直腸置于80 ℃恒溫干燥箱中干燥16 h，再次稱重，即得直腸干重，按下式計算大鼠直腸肛門腫脹率：直腸肛門腫脹率＝（直腸濕重-直腸干重）/直腸濕重×100%。

2.3.3 大鼠直腸組織病理形態(tài)觀察

另取大鼠70 只，按“2.3.1”項下方法分組、建模、給藥。第2次給藥后2 h處死大鼠，從肛門起取向上15 mm長的直腸，剔除直腸周圍結(jié)締組織，用生理鹽水漂洗、濾紙吸干水分。將大鼠直腸組織固定于多聚甲醛中，用HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠直腸組織病理形態(tài)變化。

2.3.4 大鼠直腸組織中TRPV1和P物質(zhì)表達的檢測

另取大鼠70 只，按“2.3.1”項下方法分組、建模、給藥，按“2.3.3”項下方法取直腸組織，并固定于多聚甲醛中，然后切片、脫蠟、水化、熱修復(fù)處理，并用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗后，加入兔TRPV1 抗體、兔P 物質(zhì)抗體（稀釋比例均為1∶200），孵育1 h，再用PBS清洗，加入二抗（稀釋比例為1∶500），孵育20 min，最后用PBS 清洗，加入二甲基聯(lián)苯胺染色及蘇木精復(fù)染，經(jīng)乙醇脫水至透明后，用中性樹膠封片，即得。用顯微鏡觀察并采集圖片，每張切片各選5 個不同視野，采用Image J 軟件分析陽性表達（棕黃色）的平均光密度（optical density，OD）值。

2.3.5 大鼠直腸血管通透性的檢測

取250 mg 伊文思藍，置于10 mL 容量瓶中，用甲酰胺完全溶解均勻，得伊文思藍標(biāo)準品溶液。取上述伊文思藍標(biāo)準品溶液，用甲酰胺稀釋至不同濃度，使用酶標(biāo)儀于620 nm 波長處測定OD 值。以濃度為橫坐標(biāo)（x）、平均OD值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準曲線，求得伊文思藍的回歸方程y＝0.125 5x+0.033 4（R2＝0.999 7）。

另取大鼠70 只，按“2.3.1”項下方法分組、建模、給藥。在直腸水腫達到腫脹峰值前30 min（即直腸接觸巴豆油后5.5 h），按20 mg/kg劑量尾靜脈注射含1%伊文思藍的生理鹽水，4.5 h 后（即第2 次給藥后）處死大鼠，于肛門皮毛邊緣取15 mm長的直腸，置于0.5 mL甲酰胺溶液中，于45 ℃恒溫水浴72 h 后稱重，并使用酶標(biāo)儀在620 nm 波長處測定樣本浸泡的甲酰胺溶液的OD 值。根據(jù)伊文思藍回歸方程計算各樣本中所含伊文思藍的質(zhì)量，再按下式計算各組大鼠直腸血管通透性：血管通透性＝伊文思藍質(zhì)量（μg）/直腸質(zhì)量（g）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠肛門潰瘍實驗結(jié)果

3.1.1 大鼠體重變化

與空白組同時間點比較，模型組大鼠從給藥第6 天起體重增加量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組同時間點比較，各給藥組大鼠體重增加量整體呈現(xiàn)升高趨勢，其中，加味三黃膏低劑量組從給藥第13天起，加味三黃膏中、高劑量組從給藥第9天起，中、西藥陽性對照組從給藥第15 天起體重增加量升高趨勢顯著（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1 加味三黃膏對肛門潰瘍模型大鼠體重的影響（±s，n＝10）

3.1.2 大鼠肛門潰瘍面積變化

與空白組比較，模型組不同時間點大鼠的肛門潰瘍面積均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組不同時間點大鼠的肛門潰瘍面積均減?。ǔ游度S膏高劑量組0 d外），其中加味三黃膏各劑量組大鼠從給藥第6 天起、西藥陽性對照組大鼠從給藥第13 天起、中藥陽性對照組大鼠從給藥第15 天起肛門潰瘍面積均顯著減小（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 加味三黃膏對肛門潰瘍模型大鼠肛門潰瘍面積的影響（±s，n＝10，mm2）

表1 加味三黃膏對肛門潰瘍模型大鼠肛門潰瘍面積的影響（±s，n＝10，mm2）

-：無潰瘍；a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組加味三黃膏低劑量組加味三黃膏中劑量組加味三黃膏高劑量組西藥陽性對照組中藥陽性對照組給藥0 d-62.20±6.24a 56.19±4.45 59.93±2.65 63.11±6.35 60.28±4.54 61.39±4.77給藥6 d-58.13±6.77a 47.51±5.28b 47.22±4.58b 46.18±6.06c 51.67±5.68 53.14±5.05給藥9 d-50.18±4.58a 41.41±3.22b 42.16±5.26b 37.69±4.72c 46.87±5.32 46.78±4.84給藥11 d-46.31±5.86a 38.14±4.74b 36.14±2.64b 30.46±3.28c 40.45±5.01 41.64±3.93給藥13 d-43.43±5.56a 35.24±4.16b 28.54±4.53c 22.65±6.65c 35.23±2.53b 36.11±2.53給藥15 d-39.61±8.43a 30.53±5.23c 21.75±3.86c 15.64±3.75c 28.45±5.32c 30.56±5.87b

3.1.3 大鼠肛門潰瘍等級變化

與模型組比較，各給藥組大鼠肛門潰瘍等級均降低，其中加味三黃膏各劑量組改善效果優(yōu)于西藥陽性對照組和中藥陽性對照組。結(jié)果見表2。

表2 加味三黃膏對肛門潰瘍模型大鼠肛門潰瘍等級的影響（n＝10）

3.2 大鼠直腸腫脹實驗結(jié)果

3.2.1 大鼠血清中IL-2、IL-4和TNF-α含量變化

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-2、IL-4 和TNF-α 含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，西藥陽性對照組、中藥陽性對照組和加味三黃膏各劑量組大鼠血清中IL-2、IL-4 和TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 加味三黃膏對直腸腫脹模型大鼠血清中IL-2、IL-4和TNF-α含量的影響（n＝10）

3.2.2 直腸肛門腫脹率變化

空白組大鼠直腸肛門無腫脹。模型組大鼠直腸肛門腫脹率為（82.12±4.13）%，表明造模成功。西藥陽性對照組、中藥陽性對照組和加味三黃膏低、中、高劑量組大鼠直腸肛門腫脹率分別為（71.32±4.76）%、（75.12±6.13）%、（70.42±13.00）%、（66.12±3.76）%、（52.32±1.32）%，均顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。

3.2.3 大鼠直腸組織病理形態(tài)變化

空白組大鼠直腸黏膜上皮組織完整，結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠直腸黏膜上皮組織出現(xiàn)局部壞死，炎癥細胞浸潤明顯，黏膜下層水腫，靜脈血管擴張；與模型組比較，西藥陽性對照組、中藥陽性對照組和加味三黃膏各劑量組大鼠的直腸黏膜組織損傷均有不同程度改善，腺體排列較為整齊，邊界較清，炎癥明顯改善。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠直腸組織HE染色結(jié)果

3.2.4 加味三黃膏對大鼠直腸組織中TRPV1 及P 物質(zhì)表達的影響

TRPV1和P物質(zhì)染色陽性均呈棕黃色或褐色，二者主要分布在胞漿或間質(zhì)中。免疫組化結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠直腸組織中TRPV1及P物質(zhì)表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥陽性對照組、中藥陽性對照組和加味三黃膏各劑量組大鼠直腸組織中TRPV1 及P 物質(zhì)表達均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 加味三黃膏對大鼠直腸組織中TRPV1表達的影響

圖5 加味三黃膏對大鼠直腸組織中P物質(zhì)表達的影響

3.2.5 大鼠直腸血管通透性變化

與空白組比較，模型組大鼠直腸血管通透性顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥陽性對照組、中藥陽性對照組和加味三黃膏各劑量組大鼠直腸血管通透性均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠直腸血管通透性測定結(jié)果（n＝10）

4 討論

痔瘡是臨床上較常見的疾病之一?；颊咭蚧继幐腥?、出血等，而促使肛門直腸底部及肛門處的靜脈叢與黏膜發(fā)生病變，最終導(dǎo)致肛門直腸腫脹和疼痛的同時，引發(fā)炎癥及潰瘍等癥狀。本研究結(jié)果顯示，加味三黃膏可有效改善大鼠肛門潰瘍及肛門腫脹，降低直腸血管通透性，其作用機制可能與抑制IL-2、IL-4 和TNF-α 的釋放，減輕直腸組織病理損傷有關(guān)。HE染色結(jié)果也顯示，模型組大鼠直腸黏膜上皮組織出現(xiàn)局部壞死，炎癥細胞浸潤明顯，黏膜下層水腫，靜脈血管擴張；經(jīng)加味三黃膏干預(yù)后，大鼠直腸組織病理損傷有效改善，炎癥反應(yīng)得到緩解。

肛門不僅是一個身體器官，也是一個感受器。肛門直腸中的TRPV1主要分布于肛管黏膜下層的結(jié)締組織中，組織損傷后的炎癥反應(yīng)能引起炎癥區(qū)域中H+濃度上升，H+能直接激活TRPV1，向中樞傳遞傷害性神經(jīng)信號，直接引起傷害性疼痛感受[13]。TRPV1 作為痛覺產(chǎn)生的關(guān)鍵性離子通道，當(dāng)其被激活時，可誘發(fā)大量Ca2+內(nèi)流，引起IL-2、IL-4、TNF-α、前列腺素等炎癥因子大量釋放，進一步引起炎癥，產(chǎn)生痛感[14]。P 物質(zhì)作為炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的一種小分子神經(jīng)肽，主要參與創(chuàng)傷修復(fù)中細胞增殖、分化的調(diào)節(jié)，還可通過擴張血管，增加血管通透性及相關(guān)蛋白滲出，并與淋巴細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞等胞膜上受體結(jié)合，誘導(dǎo)釋放大量炎癥因子，如IL-2、IL-4和TNF-α，從而導(dǎo)致炎癥加劇[15]。因此，TRPV1、P 物質(zhì)與創(chuàng)面炎癥及疼痛密切相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示，模型組大鼠直腸組織中TRPV1及P物質(zhì)表達均較空白組顯著增強，經(jīng)加味三黃膏干預(yù)后，各給藥組大鼠直腸組織中TRPV1 及P 物質(zhì)表達均較模型組顯著降低，表明加味三黃膏可以通過抑制TRPV1及P物質(zhì)的表達來改善炎癥，緩解疼痛。

綜上所述，加味三黃膏可通過降低炎癥因子釋放、抑制TRPV1及P物質(zhì)表達來改善大鼠肛門潰瘍和腫脹，進而達到改善大鼠實驗性痔瘡的作用。