阿維菌素廢菌渣循環(huán)利用的發(fā)酵工藝研究

劉麗虹，程曦，楊柳，張偉龍，夏冰，寇娜

(1.石家莊市農業(yè)技術推廣中心，石家莊 050000; 2.河北興柏農業(yè)科技股份有限公司河北省阿維菌素生物技術重點實驗室，石家莊 051530)

阿維菌素是阿維鏈霉菌深層發(fā)酵而得的高效低毒生物農藥和醫(yī)藥中間體，在農業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥領域都有廣泛的應用[1]。21 世紀，隨著基因編輯、合成生物學等現(xiàn)代前沿生物技術在微生物育種上的應用，構建出主產阿維菌素B1a 工程菌的產業(yè)化，阿維菌素放罐效價達7～8 g/L[2-3]，同時大量發(fā)酵效價增長的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵培養(yǎng)的前4 d，日平均效價增長量僅為其后的1/2。這是由于阿維鏈霉菌菌體生長與產物合成非偶聯(lián)，其發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)過生長繁殖期、穩(wěn)定期和產素期，由于穩(wěn)定期的存在，阿維菌素生物合成所需的各種前體物質和酶的積累有個過程，對前期效價增長有一定程度的影響。為此，業(yè)界開展了前體物質對效價影響的研究，來縮短穩(wěn)定期，提高發(fā)酵效價。陳海燕等[4]研究了在發(fā)酵培養(yǎng)過程中滴加丙酸鈉、乙酸鈉對效價的影響。王文亮等[5]研究了在培養(yǎng)基中添加纈氨酸、亮氨酸作為前體物質對效價增長的影響。程曦等[6]研究了在發(fā)酵前期補入產素期發(fā)酵液，誘導處于生長繁殖期的阿維鏈霉菌生物合成阿維菌素。阿維菌素生物合成本質是阿維鏈霉菌進行復雜的生物化學反應過程，其生化反應總速度由相對較慢的步驟決定，添加一種或幾種前體物質難以保證生化反應速度的整體提高，嘗試開展在阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加阿維菌素廢菌渣作為前體混合物的工藝研究，在回收利用廢菌渣的同時，提高阿維菌素發(fā)酵效價。

阿維菌素廢菌渣是阿維菌素發(fā)酵液經(jīng)過濾、烘干、萃取、干燥后的固體物質(以下通稱菌渣)，主要成分為阿維鏈霉菌菌絲體、助濾劑及其初級代謝產物，阿維菌素B1a 含量僅為0.1%～0.2%。生態(tài)環(huán)境部出臺的《國家危險廢物名錄(2021 年版)》規(guī)定，將抗生素菌渣按照危險廢物處置和管理，限制其作為肥料和飼料的應用。當前主要的處置方式為焚燒[7]，既增加碳排放、浪費能源和資源,又有悖于綠色低碳發(fā)展的理念。而生態(tài)環(huán)境部出臺的《制藥工業(yè)污染防治技術政策》鼓勵企業(yè)研究、開發(fā)、推廣發(fā)酵菌渣在生產工藝中的再利用技術。筆者就此在搖瓶及50 L 發(fā)酵罐上研究了培養(yǎng)基中添加菌渣對發(fā)酵效價及培養(yǎng)過程的影響，為循環(huán)利用菌渣和進一步提高發(fā)酵效價提供思路、方法和相關數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)AVX-33由河北興柏農業(yè)科技股份有限公司菌種室提供。

1.1.2 設備

20 L 種子罐、50 L 發(fā)酵罐，配套有補料、DO和pH 等自動控制系統(tǒng)和具有數(shù)據(jù)采集及分析功能的軟件系統(tǒng)(鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術公司)；NDJ-1 型旋轉式黏度計(上海越平科學儀器有限公司)；TS-211B 臥式恒溫搖床(無錫瑪瑞特科技有限公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.1.3 菌渣

來源于本公司提取車間(F622-20221127)，黑褐色粉末或顆粒狀，過40 目篩篩選。主要成分為粗蛋白、粗纖維和無氮浸出物(表1)及17 種氨基酸，其中谷氨酸1.61%、亮氨酸1.32%、甘氨酸1.22%、丙氨酸1.06%、脯氨酸1.03%、天門冬氨酸0.94%、纈氨酸0.90%等，含量最低的蛋氨酸0.050%。

表1 菌渣主要成分及含量 (%)

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 搖瓶種子培養(yǎng)基

質量濃度分別為玉米淀粉25 g/L，熱軋黃豆餅粉8 g/L，花生餅粉10 g/L，酵母膏4 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈷10 mg/L，消前pH 8.0～8.5。

培養(yǎng)條件：搖床轉速220 r/min，溫度28～29 ℃，培養(yǎng)時間2～3 d。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

質量濃度分別為淀粉140g/L，熱軋黃豆餅粉21g/L，酵母粉8 g/L，菌渣8 g/L，輕質碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質量分數(shù)0.025%；消前pH 7.5～8.0，搖瓶裝量50 mL/250mL，接種量5 mL。

培養(yǎng)條件：溫度27～28 ℃，轉速220 r/min，培養(yǎng)時間10～12 d。

1.2.3 種子罐(20 L)

原材料質量濃度分別為淀粉22 g/L，熱軋黃豆餅粉6 g/L，酵母粉3g/L，花生粉6 g/L，酵母膏3 g/L，氯化鈷10 mg/L；計料體積12 L，消前pH 9.0～9.5、消后pH 7.3～7.8。

培養(yǎng)條件：溫度28～29 ℃，空氣流量10～25 L/min，攪拌轉速200～600 r/min，培養(yǎng)時間2～3 d。

1.2.4 發(fā)酵罐(50 L)

按接后體積計算投料量，原材料質量濃度分別為淀粉140 g/L，熱軋黃豆餅粉21 g/L，酵母粉8 g/L，菌渣8 g/L，輕質碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質量分數(shù)0.025%；消后體積33～35 L，接種量8%～10%。

培養(yǎng)條件：溫度27～28 ℃，攪拌轉速600 r/min，空氣流量30～45 L/min，培養(yǎng)時間10～12 d。

1.3 測定方法

1.3.1 黏度測定

取發(fā)酵液適量，選2#轉子，將黏度計的轉子沒于發(fā)酵液中，并使液面淹沒于轉子的凹槽刻度處，開啟黏度計，旋轉穩(wěn)定后讀取黏度值。

1.3.2 生物量測定

準確量取50 mL 發(fā)酵液置于250 mL 三角瓶中，添加適量助濾劑。于水浴鍋中升溫至約95 ℃，維持3～5 min，抽濾得濾餅，適量熱水洗，102 ℃烘干至恒重，降溫稱量(W2)，計算生物量。

式中：20 為換算系數(shù)，W1為助濾劑質量，W0為濾布質量。

1.3.3 B1a 效價測定

精確稱取2 mL 發(fā)酵液，加入50 mL 容量瓶中，再添加適量甲醇至規(guī)定位置，超聲浸取10～20 min，甲醇定容、過濾待用。

HPLC 系統(tǒng)：色譜柱C18、4.6 mm×250 mm，柱溫30 ℃，流動相甲醇∶水=9∶1 (體積比)，流量1.0 mL/min、測量用波長246 nm，進樣量20 μL，記錄測量的峰面積，外標法計算B1a 效價。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度菌渣對效價的影響

為考察菌渣對發(fā)酵效價的影響情況，對其設計了5 個質量濃度：4、6、8、10、12 g/L。其中，每個質量濃度接3 支三角瓶進行搖瓶試驗，圖1 數(shù)據(jù)(平均值±標準差)顯示，隨著菌渣質量濃度的增加，放瓶效價逐漸提高，當菌渣質量濃度達8 g/L時，放瓶效價最高，達到8 053μg/mL，這是由于培養(yǎng)基中添加菌渣后，等效于發(fā)酵液中提前積累了阿維鏈霉菌的初級代謝產物，縮短了穩(wěn)定期，相對延長了產素期，提高放瓶效價。而后又逐步下降，當菌渣質量濃度增至12 g/L，放瓶效價下降至7 432μg/mL，是由于菌渣中存在的某些限制性物質過量，抑制了阿維菌素的生物合成。故以菌渣質量濃度8 g/L，在50 L 發(fā)酵罐研究其對發(fā)酵效價、生物量和黏度等指標的影響情況。

圖1 菌渣質量濃度對效價的影響

2.2 菌渣對發(fā)酵效價的影響

將培養(yǎng)好的種子液按10%接種量分別轉入相同培養(yǎng)條件的試驗組和對照組。圖2 為11 批次起步效價對比數(shù)據(jù)，培養(yǎng)基添加菌渣罐批平均起步效價(平均值±標準差)(479±81)μg/mL，較對照組(385±82)μg/mL 高94 μg/mL，增加24.0%，有顯著提高(P單尾=0.007)。抗生素作為次級代謝產物，是由于初級代謝產物的過量積累和外界環(huán)境脅迫所產生的有利于其生產的代謝活動[8]，在阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量菌渣相當于提前積累了阿維鏈霉菌的初級代謝產物和添加合成阿維菌素所需的前體物質，有利于初級代謝向次級代謝的轉化，縮短穩(wěn)定期，提高發(fā)酵起步效價。圖3 為11 批次放罐效價對比數(shù)據(jù)，試驗組平均放罐效價(平均值±標準差)(8 042±716)μg/mL，較對照組(7 366±563)μg/mL 高676μg/mL，增加9.0%，有顯著提高(P單尾=0.011)。這是由于試驗組添加菌渣后，有利于初級代謝向次級代謝的轉化，縮短了穩(wěn)定期，相對延長了產素期，即增加了阿維鏈霉菌生物合成阿維菌素的時間，提高了放罐效價；試驗組標準差716μg/mL，較對照組563 μg/mL 高153μg/mL，無顯著差異(P=0.46)。

圖2 菌渣對起步效價的影響

圖3 菌渣對放罐效價的影響

2.3 菌渣對生物量、黏度的影響

生物量表示單位體積發(fā)酵液中菌絲體的數(shù)量，與其他理化指標一樣對發(fā)酵效價有重要影響，其濃度大小與培養(yǎng)基特別是其中氮源含量密切相關[9]。將培養(yǎng)好的種子液依次接入試驗罐和對照罐，29 h開始取樣檢測試驗罐和對照罐的生物量(圖4)。結果表明：29 h 生物量分別快速達到36.3、28.8 g/L，這期間主要表現(xiàn)為阿維鏈霉菌的生長繁殖期，隨后生物量的增加相對較慢，增加機理主要表現(xiàn)為發(fā)酵液的蒸發(fā)作用，至281 h 放罐生物量分別為52.8、42.3 g/L，且全程表現(xiàn)為試驗罐生物量高于對照罐，原因在于試驗罐培養(yǎng)基加入了8 g/L 的菌渣。但在發(fā)酵培養(yǎng)的后期增加的更多，是由于隨著發(fā)酵的進行，阿維鏈霉菌自身產生了某些蛋白酶，酶解并利用菌渣中的粗蛋白引起一定程度的二次生長繁殖，但此時的阿維鏈霉菌已經(jīng)具有次級代謝能力，表現(xiàn)出菌體生長繁殖與產物合成同時進行的混合型發(fā)酵特征，所以并未對效價增長造成影響。此現(xiàn)象有別于傳統(tǒng)的阿維鏈霉菌菌體生長與產物合成非偶聯(lián)特征。

圖4 菌渣對生物量的影響

黏度作為發(fā)酵控制的重要指標，對發(fā)酵液中氧的傳遞有重大影響。其高低除了與生物量有關外，還與菌絲形態(tài)、代謝過程密切相關。圖5 表明：發(fā)酵培養(yǎng)29、41 h 試驗罐生物量明顯高于對照罐，但黏度(69.6、74.2 mPa·s)與對照罐(71.4、73.8 mPa·s)相當，這是由于試驗罐生物量高，與加入了質量濃度8 g/L菌渣有關。但隨著發(fā)酵培養(yǎng)的深度進行，發(fā)酵后期試驗罐(88.4 mPa·s)黏度明顯高于對照罐(81.7 mPa·s)，這是由于發(fā)酵后期，試驗罐菌渣中粗蛋白的酶解導致菌體二次生長繁殖，菌體細胞原生質飽滿，菌絲剛性增加所致[10]，且以后的多次試驗，重復了這一現(xiàn)象。

圖5 菌渣對黏度的影響

3 結論

長期以來，抗生素菌渣的處置技術限于政策困境，一方面嚴格限制其作為肥料、飼料的使用，而采取焚燒的處置方式，又有悖于低碳經(jīng)濟和科學發(fā)展觀，使菌渣的處置進入兩難境地。開展菌渣無害化處理或循環(huán)利用菌渣的研究成為必然，以消除或減輕菌渣對環(huán)境污染的影響。張廣志等[11]在菌渣中分離出嗜熱脂肪芽孢桿菌，并進行堆料發(fā)酵，以降解其中的阿維菌素，減輕菌渣中殘留阿維菌素對環(huán)境影響。劉小鵬等[12]研究了阿維菌素菌渣經(jīng)微生物發(fā)酵改性后替代其他氮源在阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)中的應用技術，以降低阿維菌素生產費用。由于阿維菌素是阿維鏈霉菌生長繁殖到一定階段開始生物合成，本研究基于菌渣混合物的初級代謝產物特性，加入培養(yǎng)基后，等效于提前積累初級代謝產物和合成阿維菌素所需的基質、前體和誘導物，有利于加快初級代謝向次級代謝的轉化進程，提高起步效價；縮短穩(wěn)定期，即相對延長產素期，提高放罐效價。

研究結果表明：在培養(yǎng)基中添加8 g/L 菌渣，能夠加快阿維鏈霉菌由初級代謝向次級代謝的轉化進程，縮短阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)的穩(wěn)定期，提高發(fā)酵效價。其中，阿維菌素發(fā)酵起步效價增加24.0%、放罐效價增加9.0%，為進一步工業(yè)化應用提供數(shù)據(jù)和理論支撐。同時，該研究對其他菌體生長繁殖與產物合成非偶聯(lián)型次級代謝發(fā)酵菌渣的再利用有借鑒價值。