金納米顆粒的制備及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展

陳雪,李昉,劉樹峰

(青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,山東 青島 266042)

近年來,以癌癥為標(biāo)志的很多重大性疾病對于人類健康生活的影響越來越大,因此對于某些核酸、蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確檢測是十分必要的。結(jié)合各種生物策略的電化學(xué)傳感器層出不窮,并且表現(xiàn)非常突出[1-2]。在電化學(xué)生物核酸傳感器中,因其檢測目標(biāo)的微小,傳感器所處的平臺(tái)及介質(zhì)也須是特定的環(huán)境,并且對平臺(tái)的要求較高,比如Au電極、玻碳電極的表層面積的控制[3]。在另一方面,為了提高傳感器的靈敏度與特異性,將納米材料應(yīng)用于傳感器的制造,這也是基于各種物理材料的不斷發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)某些材料的尺度縮小到納米級(jí)別時(shí),其中部分的物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)有著顯著的改變,并且還會(huì)顯現(xiàn)獨(dú)特性能,可能是因?yàn)楦弑砻娣e或量子效應(yīng)引發(fā)的[4-5]。目前,隨著電化學(xué)生物傳感器與納米材料的不斷發(fā)展,它們可以很好地結(jié)合起來應(yīng)用于生物傳感器中用于更加靈敏準(zhǔn)確地檢測。

在電化學(xué)生物傳感器中,除了各種生物放大策略(比如雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熵驅(qū)動(dòng)、催化發(fā)夾組裝、滾環(huán)擴(kuò)增策略等)的應(yīng)用,DNA自身的各種結(jié)構(gòu)也有著無限可能。DNA的特殊物理化學(xué)性質(zhì)可通過幾種組裝策略來形成高度可預(yù)測的結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)已被貫通在各個(gè)領(lǐng)域[6-7]。新的DNA結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)工具的制備和應(yīng)用使許多實(shí)驗(yàn)進(jìn)程變得簡單易操作,并使堿基數(shù)目多的和任意的DNA結(jié)構(gòu)對于不同的應(yīng)用變得可行。此外,DNA所形成的納米結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有可編輯性和生物相容性的優(yōu)異材料。傳統(tǒng)來講,DNA的自身納米結(jié)構(gòu)與生物放大策略相結(jié)合就可很好地制造傳感器。為進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度與特異性,引入納米材料,將其生物功能化[8]。生物功能納米材料近年來也應(yīng)用了許多種類,其中金納米顆粒(AuNPs)的許多特性值得我們?nèi)ヌ骄俊?/p>

單質(zhì)金(Au)是化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定的元素之一,納米尺寸級(jí)別的金除此之外還具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)、光電性質(zhì)以及生物相容性[9]。納米材料(NMs)為環(huán)境、食品安全和臨床診斷應(yīng)用的電化學(xué)生物傳感器提供了眾多優(yōu)勢,包括實(shí)現(xiàn)了較低的檢測限(LOD)。由于納米材料具有較大的表面積和較高的負(fù)載能力,已有多種信號(hào)增強(qiáng)策略被報(bào)道利用納米材料作為多種信號(hào)分子和生物識(shí)別元素的載體。由于許多納米材料具有電化學(xué)活性(如金屬納米顆粒)。它們還被用作電活性示蹤劑,以生產(chǎn)具有增強(qiáng)性能的納米結(jié)構(gòu)電化學(xué)傳感器,并被用作催化劑,其表面具有現(xiàn)成的活性位點(diǎn)[10]。金納米粒子(AuNPs)可能是生物傳感器中使用最廣泛的納米粒子,因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)合成快速簡單,具有形狀控制和窄尺寸分布、生物相容性以及易于生物結(jié)合。在電化學(xué)生物傳感器方面,AuNPs因其獨(dú)特的電化學(xué)特性而引起了人們的特別興趣,這使得各種生物傳感器的開發(fā)成為可能。因此,在眾多的納米材料中,金納米顆粒(AuNPs)是科研工作者研究最多的,在生物傳感、疾病診斷、醫(yī)療等方面有著很好的應(yīng)用前景。金納米顆粒的制備及特性我們還需繼續(xù)深入探究,其在生物傳感器中的應(yīng)用已經(jīng)成為放大信號(hào)的一種常用手段。

1 金納米顆粒(AuNPs)的制備

檸檬酸三鈉還原四氯金酸:將200 mL的0.01%的HAuCl4溶液攪拌煮沸后,將5 mL的1%檸檬酸三鈉溶液快速加入煮沸的溶液中。當(dāng)溶液變成深紅色,表明金納米顆粒的形成,此時(shí)將溶液繼續(xù)攪拌并冷卻,得到穩(wěn)定的金納米膠體。后續(xù)對于金納米顆粒的表征,對于純度,在紫外-可見光范圍內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)特定位置的特征峰即可證明金膠的完好制備,再根據(jù)其吸光度(朗伯-比爾定律)就可計(jì)算金納米顆粒的濃度。透射電鏡下其形狀更直觀一點(diǎn)。上述0.01%的HAuCl4溶液與1%檸檬酸三鈉溶液的比例所制得的金納米顆粒粒徑較小,其不同的比例所形成的粒徑大小是不同的,根據(jù)實(shí)驗(yàn)狀況進(jìn)行調(diào)整。

2 金納米顆粒的性質(zhì)[11]

2.1 電化學(xué)特性

金本身就具導(dǎo)電性,納米金也有著良好的導(dǎo)電性,可增強(qiáng)原本電極的導(dǎo)電性。因其電化學(xué)特性,AuNPs更多地適用于電化學(xué)生物傳感器。

2.2 易于表面修飾

一方面,體積更小,比表面積更大;最重要的是,金達(dá)到納米尺寸后,顆粒表面總是覆有一層保護(hù)劑分子,就可利用分子間的相互作用將這些分子與特定的試劑反應(yīng),以得到想要修飾的基團(tuán)或環(huán)境。還可用作催化劑,在其表面上具有現(xiàn)成的活性位點(diǎn)。因此,金納米顆?？梢暂^容易地被多種分子修飾,被應(yīng)用于生物傳感器中,并將其功能和應(yīng)用擴(kuò)展到化學(xué)分析、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中。

2.3 局部表面等離子體共振(SPR)

AuNPs表面的特殊性(帶有自由電子),會(huì)在入射光的作用下形成表面等離子體共振效應(yīng),在紫外-可見光范圍內(nèi)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)特征峰。合成金納米顆粒后,只需紫外表征就可判斷是否制備成功,驗(yàn)證AuNPs上修飾DNA是否成功也可用此方法(若DNA修飾成功后,其體積會(huì)略增大,與AuNPs自身的出峰位置相比會(huì)向長波長方向移動(dòng))。由于金納米顆粒間等離子體激元耦合效應(yīng),金納米顆粒之間的分散與聚集過程會(huì)伴隨從紅色到藍(lán)色的顏色變化,這是肉眼就可觀察到現(xiàn)象,鹽度等許多環(huán)境變化都會(huì)影響金納米顆粒的聚集與分散程度,成為開發(fā)比色生物傳感器的通用范例。

3 金納米顆粒在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

金納米顆粒(AuNPs)可能是生物傳感器中使用最廣泛的納米粒子,因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)合成快速簡單,具有形狀和窄尺寸分布可控性、生物相容性和易生物結(jié)合性。對于電化學(xué)生物傳感器而言,AuNPs因其獨(dú)特的電化學(xué)特性,使得各種生物傳感器的開發(fā)成為可能。迄今為止制造的大多數(shù)基于AuNPs的電化學(xué)生物傳感器都報(bào)道了AuNPs作為電化學(xué)標(biāo)記或分析物受體的載體,或作為電極表面的改性劑的用途,通常與聚合物和石墨烯結(jié)合或與其他納米材料結(jié)合。

3.1 金納米顆粒與碳納米管的結(jié)合用于超靈敏電化學(xué)DNA生物傳感器的制造

納米材料已廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感系統(tǒng),用于高靈敏度和高選擇性地檢測各種生物目標(biāo)。金納米顆粒自身就具有獨(dú)特優(yōu)勢,還可與其他納米材料結(jié)合協(xié)同放大信號(hào)?；凇昂Ｄ憼睢碧技{米管-金納米顆粒(CNT-AuNPs)納米團(tuán)簇,Han等人[12]開發(fā)了一種簡單、無標(biāo)記、超靈敏的三明治型電化學(xué)DNA生物傳感器,用于DNA檢測時(shí)的信號(hào)放大(如圖1所示)。具體來說,多巴胺(DA)的電化學(xué)聚合被用于修飾金電極,通過席夫堿反應(yīng)將胺基修飾的探針DNA (NH2-ssDNA)共價(jià)連接到聚多巴胺(PDA)功能化的金電極表面來制備DNA生物傳感器,其中PDA的茶酚官能團(tuán)與胺基修飾的DNA偶聯(lián),以將DNA探針錨定在PDA的界面上。此時(shí)為無靶的狀態(tài),即原始狀態(tài)。當(dāng)有靶標(biāo)(T-DNA)存在時(shí),通過與P-DNA雜交,暴露出一個(gè)位點(diǎn),將雙鏈DNA功能化的AuNPs引入傳感器中。之后,末端修飾的單壁碳納米管通過位點(diǎn)與DNA雜交連接到金納米粒子表面,形成三維放射狀納米團(tuán)簇,產(chǎn)生顯著的電化學(xué)響應(yīng)。由于DNA鏈的柔性、相對大質(zhì)量的AuNPs和共軛CNT的大接觸表面積,CNT-AuNPs納米簇被定位在金電極表面附近,有著非常高效的電子轉(zhuǎn)移。所以,利用簡單的電化學(xué)表征:循環(huán)伏安法(CV)、電化學(xué)阻抗譜(EIS)和線性掃描伏安法(LSV),就可對DNA生物傳感器的制備過程和性能進(jìn)行可行性的驗(yàn)證。由于碳納米管-金納米顆粒具有更大的接觸表面積和超電子導(dǎo)電性,這種新設(shè)計(jì)的3D DNA納米結(jié)構(gòu)顯示出對DNA的超靈敏檢測,檢測極限為5.2 fM (線性范圍為0.1 pmol/L至10 nmol/L),以及在最優(yōu)環(huán)境下區(qū)分單錯(cuò)配DNA和完全匹配的目標(biāo)DNA的高選擇性。這種生物傳感器結(jié)合了碳納米管和金納米粒子的協(xié)同特性,展現(xiàn)出了高準(zhǔn)確性、強(qiáng)特異性的信號(hào)放大策略,用于實(shí)現(xiàn)對DNA檢測和診斷應(yīng)用的靈敏電化學(xué)生物傳感器。

圖1 電化學(xué)DNA生物傳感器的制造和檢測過程示意圖

3.2 金納米顆粒應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器中以提高靈敏度

金納米粒子(AuNPs)已經(jīng)被開發(fā)應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器中,由于單個(gè)金納米顆粒幾乎都會(huì)裝載數(shù)百條DNA鏈,這為靶標(biāo)的檢測提供了顯著的擴(kuò)增。再結(jié)合其他策略,待測靶標(biāo)就可被特異性地檢測到,檢測限相對較低。Ge等人[13]設(shè)計(jì)了一種無需聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/Cas12a介導(dǎo)的雙模式電化學(xué)生物傳感器(圖2),用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-1。合成了功能化的復(fù)合生物納米材料Fe3O4@AuNPs/DNA Fc&Ru作為信號(hào)單元,選擇SHZD32-1的特征基因片段作為靶DNA (tDNA)。當(dāng)Cas12a、crRNA和tDNA同時(shí)存在時(shí),形成了三元復(fù)合物Cas12a-crRNA-tDNA,并且激活了CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對單鏈DNA的非特異性切割能力。因此,信號(hào)單元中的單鏈DNA-Fc被切割,導(dǎo)致二茂鐵(Fc)的快速掃描伏安(FSV)信號(hào)的降低和被Fc抑制的釕絡(luò)合物(Ru)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)信號(hào)的增加。AuNPs的加入使得信號(hào)數(shù)倍擴(kuò)增,檢測限達(dá)到預(yù)期的效果。其中,ECL和FSV的線性范圍分別為1～107 fM/L和10～108 fM/L,ECL和FSV的檢測限分別為0.3 fM/L和3 fMl/L。準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、選擇性和可靠性均令人滿意。此外,無PCR檢測可在室溫下一小時(shí)內(nèi)完成,無需復(fù)雜的操作和樣品處理,在轉(zhuǎn)基因作物的實(shí)際應(yīng)用檢測中顯示出巨大的潛力。并且可以有助于開發(fā)更加環(huán)境友好的基于AuNPs的電化學(xué)生物傳感器。且由于電化學(xué)發(fā)光(ECL)和快速掃描伏安(FSV)信號(hào)可以交叉驗(yàn)證,因此準(zhǔn)確度和可靠性很高。這種生物傳感器為高靈敏度、精確和特定的轉(zhuǎn)基因生物現(xiàn)場檢測提供了新的解決方案,并為CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在傳感器開發(fā)中的應(yīng)用提供了新思路。對于以上無生物擴(kuò)增策略的電化學(xué)生物傳感器的制造,AuNPs是擴(kuò)增信號(hào)中的重要組成部分。

圖2 用于轉(zhuǎn)基因大豆無PCR檢測的CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的雙模式電化學(xué)生物傳感器示意圖

綜上所述,基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)開發(fā)了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆的雙模式電化學(xué)生物傳感器,該傳感器具有以下顯著優(yōu)勢:(1) 高靈敏度,檢測限低至0.3 fM/L,可檢測低濃度轉(zhuǎn)基因成分;(2) 高選擇性,普通干擾不會(huì)影響檢測;(3) 準(zhǔn)確度高,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過114%和11%;(4)高信賴性,ECL和FSV信號(hào)可以交叉驗(yàn)證,可避免假陰性或假陽性結(jié)果;(5)簡單的實(shí)驗(yàn)步驟,只要制備好傳感器,檢測就可一步完成;(6) 溫和的實(shí)驗(yàn)環(huán)境,可在室溫下進(jìn)行,無需PCR擴(kuò)增;(7) 反應(yīng)時(shí)間短,可在1 h內(nèi)完成。因此,這種雙模式電化學(xué)生物傳感器在轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的快速檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。

3.3 金納米顆粒(AuNPs)制造的電化學(xué)DNA傳感器用于多核苷酸激酶的檢測

金納米顆粒因其良好的導(dǎo)電性被廣泛應(yīng)用,又因其體積小,比表面積大,和其他的生物納米材料結(jié)合在電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用有著更優(yōu)的效果。T4多核苷酸激酶(PNK)活性的測定和PNK抑制劑的篩選對于疾病診斷和藥物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。已經(jīng)應(yīng)用了許多電化學(xué)策略用于PNK活性和抑制的靈敏測量,然而之前的策略中經(jīng)常會(huì)有其他的分子標(biāo)記和電化學(xué)讀出的檢測過程的多個(gè)步驟。在此展示了一種電化學(xué)DNA (E-DNA)傳感器,用于一步檢測PNK,具有“信號(hào)開啟”讀出功能,不需要額外的分子標(biāo)記修飾。在面圖3中,Lin等人[14]設(shè)計(jì)了高度可切換的雙鏈DNA (dsDNA)探針被固定在金納米粒子修飾的二硫化鉬納米材料(MoS2-AuNPs)上,該納米材料具有大表面積和高電導(dǎo)率,用于提高PNK檢測中的信號(hào)增益。這種集成了MoS2-AuNPs的“Signal-ON”E-DNA傳感器比沒有MoS2-AuNPs的傳感器具有更高的靈敏度,檢測極限為2.18×104U/mL。此外,該體系的分析結(jié)果顯示出高選擇性,能夠?qū)NK與其他酶和蛋白質(zhì)區(qū)分開,并可用于篩選抑制劑。MoS2-AuNPs已被廣泛用作電極修飾材料,以提高小分子、蛋白質(zhì)和核酸的超靈敏檢測的導(dǎo)電性。該傳感器結(jié)合了電化學(xué)DNA傳感器和MoS2-AuNPs的優(yōu)點(diǎn):(1) E-DNA傳感器易于制造,能夠以高靈敏度直接檢測復(fù)雜樣品中的PNK,顯示出臨床應(yīng)用的潛力;(2) 與報(bào)道的具有最大信號(hào)抑制限制的“Signal-OFF”生物傳感器相比,該傳感器產(chǎn)生的“Signal-ON”電化學(xué)信號(hào)更穩(wěn)定;(3) 一步和無試劑的便利性和信號(hào)穩(wěn)定性使得傳感器能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測PNK的活性;(4) MoS2-AuNPs不僅可以提供有效的DNA固定面積,而且加快電化學(xué)標(biāo)記分子的電子傳遞,增強(qiáng)法拉第電流,從而提高PNK檢測的靈敏度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,這種E-DNA傳感器可以靈敏地檢測緩沖液和細(xì)胞裂解液中的PNK,篩選PNK抑制劑,并可以進(jìn)一步用于疾病診斷和藥物發(fā)現(xiàn)。

圖3 用于檢測PNK活性的E-DNA信號(hào)傳感器的示意圖

4 結(jié)語

介紹了金納米顆粒的制備方法,金納米顆粒的特性及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用。金納米顆粒在電化學(xué)生物傳感器中起到了很強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)的作用,并通過其導(dǎo)電性、電化學(xué)特性、AuNPs局部表面等離子體共振等特性來制備更精準(zhǔn)靈敏的傳感器,在未來的化學(xué)分析、生物傳感、疾病診斷等方向有著很大的應(yīng)用潛力。