一種水楊醛芳基銥(III)配合物的合成、結(jié)構(gòu)與抗癌活性研究

彭炳華,羅志進(jìn),蘇煒,李培源

(1.南寧師范大學(xué) 廣西天然高分子化學(xué)與物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,廣西 南寧 530001)

一直以來(lái),癌癥危及人體健康和生命安全。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),2020年確診癌癥的患者數(shù)達(dá)1 930萬(wàn)人,死于癌癥的患者多達(dá)1 000萬(wàn)。2020年新增乳腺癌病例230萬(wàn),已成為最常見(jiàn)癌癥,其次是肺癌、結(jié)腸直癌。癌癥是第二大死亡原因,目前,全球五分之一的人在其一生中都會(huì)罹患癌癥,八分之一的男性和十一分之一的女性會(huì)死于癌癥。隨著全球人口增長(zhǎng)和預(yù)期壽命的增加,癌癥將會(huì)更加常見(jiàn)。因此,世界衛(wèi)生組織和各國(guó)衛(wèi)生部門都把治療癌癥作為一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。為解決癌癥困擾人類健康的重大難題,許多科研工作者研制了多種抗腫瘤藥物。但不少抗癌藥物存在毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性的缺陷。因此,尋找低毒性、療效更好的抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。

1965年順鉑被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗癌活性[1]。直到今日,順鉑及其類似藥物如奧沙利鉑、卡鉑、洛鉑、奈達(dá)鉑等作為主要臨床抗癌藥物而被廣泛應(yīng)用[2]。順鉑具有良好的抗癌效果,還能與多種抗癌藥物協(xié)同作用,廣泛應(yīng)用于包括膀胱癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤在內(nèi)的臨床治療。但順鉑類抗癌藥物存在毒副作用大、容易產(chǎn)生耐藥性的缺陷。為了解決順鉑的缺陷,科研人員相繼研發(fā)了第二代藥物卡鉑和第三代藥物奧沙利鉑,并分別于1989年、2002年上市。第二代卡鉑在結(jié)構(gòu)上的不同,是用1,1-環(huán)丁烷二酸根代替原有的氯離子,這使得耳毒性和腎毒性顯著降低。奧沙利鉑的結(jié)構(gòu)引入了手性配體(R,R)-1,2-環(huán)己二胺,是第一個(gè)對(duì)順鉑、卡鉑耐藥的腫瘤有效的鉑類藥物[2]。除了奧沙利鉑,已經(jīng)上市的第三代鉑類抗癌藥物還有奈達(dá)鉑、洛鉑以及庚鉑,但這些抗癌藥物因?yàn)槎靖弊饔么蟮仍驔](méi)有在全球范圍內(nèi)取得應(yīng)用,只是在個(gè)別國(guó)家內(nèi)上市?？傮w上,目前市場(chǎng)使用的鉑類抗癌藥物具有低毒高效的趨勢(shì),但仍然存在著毒副性作用較大等問(wèn)題,這些都是阻礙癌癥患者康復(fù)的因素。因此,尋找毒副作用更低、療效更好的抗癌藥物,是一件具有非常重大意義的事情。

水楊醛由于其廣泛的藥理作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注。最近,報(bào)道了一些水楊醛衍生物,它們顯示出抗真菌性、抗菌性,特別是抗腫瘤活性[3-5]。科研人員合成了一種雌酮-水楊醛-縮氨基硫脲雜化物(雌酮-TSC)[6],并進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),MCF-7乳腺癌細(xì)胞系(雌酮-TSC:6.4 mol/L)測(cè)得的IC50值較低。此外,雌酮-TSC的銅(II)配合物表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性(IC50<0.3～2 mol/L)。在SUM159乳腺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,他們檢測(cè)到較低水平的活性氧,并觀察到雌酮-TSC的配合物存在微弱的GSH耗竭,因此其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)氧化應(yīng)激有關(guān)。此外,水楊醛衍生物與某些金屬離子的絡(luò)合可能會(huì)增加細(xì)胞毒性作用。

在尋找治療癌癥潛在藥物的過(guò)程中,有機(jī)銥(III)絡(luò)合物已成為一種非常有前景的選擇。有機(jī)銥(III)配合物具有更高的結(jié)構(gòu)多樣性和穩(wěn)定性,許多科研工作者開(kāi)始探索有機(jī)銥(III)配合物的抗癌性能。有研究結(jié)果顯示,有機(jī)銥(III)配合物具有高度有效的抗癌活性[7-8]。例如,薩德勒及其同事研究了一系列半夾心銥(III)抗癌劑。他們發(fā)現(xiàn),通過(guò)修飾連接到銥中心的配體可以使其實(shí)現(xiàn)有效的活性,結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化會(huì)對(duì)其生物活性產(chǎn)生非常顯著的影響[9-10]。劉哲[11]等研究發(fā)現(xiàn),三苯胺修飾的熒光半夾心銥(III)縮氨基硫脲(TSC)抗腫瘤復(fù)合物可以以能量依賴的方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,在溶酶體中積聚,進(jìn)而導(dǎo)致溶酶體完整性受損。該復(fù)合物可以阻斷細(xì)胞周期,提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。這說(shuō)明,銥(III)金屬配合物有望成為治療惡性腫瘤的有效藥物。

基于水楊醛和有機(jī)銥(III)配合物極具前景的藥理學(xué)性質(zhì),本實(shí)驗(yàn)將4-亞胺二乙基水楊醛與苯胺的生成物2-苯胺基-5-二乙氨基-苯酚作為配體和二氯(五甲基環(huán)戊二烯基)合銥(III)二聚體([(Cp*)IrCl2]2)反應(yīng)制備水楊醛芳基銥(III)配合物((Cp*)IrLCl,L=2-苯胺-5-(二乙基氨基)苯酚),并且通過(guò)核磁共振氫譜、元素分析、HR-ESI質(zhì)譜分析以及X射線單晶衍射充分表征了配合物的結(jié)構(gòu)。此外,還研究了水楊醛芳基銥(III)配合物對(duì)T24人膀胱癌細(xì)胞、MGC-803人胃腺癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞和NCI-H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-300核磁共振儀(300 MHz),德國(guó)Bruker公司生產(chǎn);Waters UPLC XEVO G2 TOF質(zhì)譜儀,美國(guó)沃特爾公司生產(chǎn);Bruker CCD單晶衍射儀,德國(guó)Bruker公司生產(chǎn);Elementar Vario EL Cube元素分析儀,德國(guó)Elementar Analysensysteme GmbH公司生產(chǎn)。二氯(五甲基環(huán)戊二烯基)合銥(III)二聚體,市售;4-亞胺二乙基水楊醛,市售;苯胺,市售;三乙胺,市售;乙醇,市售;實(shí)驗(yàn)室用胎牛血清(10%),市售;青霉素-鏈霉素(1%),市售;RPMI-1640培養(yǎng)基,市售。

1.2 配體L的合成

稱取4-亞胺二乙基水楊醛1.93 g(0.01 mol),加入約10 mL無(wú)水乙醇溶解,加入0.1 g (0.01 mol)三乙胺,氬氣保護(hù),攪拌10 min,然后加入0.93 g (0.01 mol)苯胺,繼續(xù)常溫?cái)嚢? h,直到有大量黃色固體生成,邊抽濾,邊用無(wú)水乙醇沖洗3遍,得到配體L。

1.3 配合物1的合成

稱取L 23.0 mg(0.1 mmol)于25 mL 茄形瓶中,用6 mL 無(wú)水乙醇作為溶劑溶解,加入三滴三乙胺,氬氣保護(hù),反應(yīng)10 min,加入40 mg (0.05 mmol)二氯(五甲基環(huán)戊二烯基)合銥(III)二聚體,常溫下,攪拌3 h,有黃色固體產(chǎn)生,停止反應(yīng),反應(yīng)液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干,用少量甲醇溶解,然后緩慢沿著茄形瓶壁勻一層正己烷,靜置48 h,得到固體,過(guò)濾,得到產(chǎn)品21 mg,61%。HR-ESI-MS (DMSO) m/z[Found (Calcd)]:595.231 6(595.230 0)(100%) {[Ir(η5-C5(CH3)5)(L)]Cl-Cl-}+≡C27H34ON2Ir。1H NMR (300 MHz,DMSO-d6) δ:8.08 (s,1H),7.62 (d,J=7.8 Hz,2H),7.45 (s,2H),7.32～7.25 (m,1H),7.21 (d,J=9.1 Hz,1H),6.15～5.98 (m,2H),3.38～3.31 (m,4H),1.28 (s,15H),1.12 (s,6H)。Calcd for C27H34ON2ClIr·1/2CH2Cl2:C,49.09;H,5.24;N,4.16;Found:C,49.41;H,5.41;N,4.23。

1.4 單晶測(cè)試

單晶測(cè)試在Oxford Diffraction Gemini E 智能系統(tǒng)上進(jìn)行,用Cu靶產(chǎn)生的λ=1.5418 ?的X射線對(duì)晶體進(jìn)行衍射(測(cè)試溫度為293 K),收集衍射點(diǎn)數(shù)據(jù)。晶體結(jié)構(gòu)主要是由直接法和Fourier法解出,各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正,全部非氫原子的坐標(biāo)、各向異性溫度因子和氫原子的坐標(biāo)及各向同性溫度因子修正至收斂,氫原子從Fourier圖上定出,所有計(jì)算均在PC計(jì)算機(jī)上用SHELXTL-97[12]程序進(jìn)行。

在室溫下,使用石墨單色MoKα輻射(h=0.710 73 ?),使用Bruker SMART CCD儀器收集所有衍射數(shù)據(jù)。應(yīng)用了使用SADABS程序的半經(jīng)驗(yàn)吸收校正,并使用SAINT[13]進(jìn)行了原始數(shù)據(jù)幀積分。使用程序SHELXS-97[14]通過(guò)直接方法求解晶體結(jié)構(gòu),并使用具有各向異性熱參數(shù)的SHELXTL-97通過(guò)F2上的全矩陣最小二乘法對(duì)所有非氫原子進(jìn)行細(xì)化。所有氫原子都位于計(jì)算的位置,并按各向同性進(jìn)行細(xì)化,但水分子的氫原子除外,這些氫原子固定在差分傅里葉圖中并按各向異性進(jìn)行細(xì)化。

1.5 體外抗腫瘤活性

MTT分析法,其檢測(cè)原理為:利用活細(xì)胞中線粒體與非線粒體系統(tǒng)脫氫酶將MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚,甲瓚的生成量與活細(xì)胞的數(shù)目成正比,然后用DMSO(二甲基亞砜)溶解細(xì)胞中的甲瓚,再用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

通過(guò)MTT法測(cè)定化合物對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性來(lái)評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性,細(xì)胞株分別為人膀胱癌細(xì)胞(T24)、人胃腺癌細(xì)胞(MGC-803)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-H460)和人正常肝細(xì)胞(HL-7702)。將細(xì)胞分別在盛有1640培養(yǎng)液[內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清]的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃,5% CO2,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的癌細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰蛋白酶液消化后,用1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)配成細(xì)胞懸液,加入96孔板,每孔200 μL 1～3×104個(gè)細(xì)胞/孔,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。采用MTT法,設(shè)置6個(gè)濃度梯度,濃度分別為10,20,30,50,60,80 μmol·L-1,每孔加入1 μL濃度不同的藥物,再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。之后,每孔加入20 μL (5 mg/mL) MTT置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,吸掉上清液,每孔加入200 μL的DMSO(二甲基亞砜)置搖床上低速震蕩,10 min后在酶標(biāo)儀上使用492 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。每種藥物重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),每次做3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的合成與表征

配合物的合成是根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道完成的,如圖1。反應(yīng)得到的配合物經(jīng)過(guò)單晶測(cè)試、核磁共振氫譜(1H NMR)、質(zhì)譜(ESI-MS)和元素分析表征確認(rèn)。

圖1 配合物1的合成

2.2 晶體結(jié)構(gòu)描述

配合物1的分子結(jié)構(gòu)通過(guò)X射線單晶衍射分析確定(圖2)。表1列出了部分化學(xué)鍵長(zhǎng)度和角度。配合物在單斜晶系空間群P21/c中結(jié)晶。配合物顯示出標(biāo)準(zhǔn)的“三腳鋼琴凳”幾何結(jié)構(gòu),其中η、π鍵結(jié)合的五甲基環(huán)戊二烯基作為座位,N、O螯合配體和末端氯化物作為三腳。通過(guò)雙齒配體通過(guò)N1和O1與銥結(jié)合形成平面五元螯合環(huán)。Ir-Cl和Ir質(zhì)心的鍵距分別為2.429和1.772?,與文獻(xiàn)中類似配合物的鍵距幾乎相同[14]。與銥螯合的配體的鍵距對(duì)于Ir1-N1為2.123?,對(duì)于Ir1-O1為2.073?,這在釕類似物中發(fā)現(xiàn)的值范圍內(nèi)[17-20]。雙齒角O1-Ir1-N1為85.079(8),小于O1-Ir1-Cl1和N1-Ir1-Cl1,與鋼琴凳結(jié)構(gòu)一致。晶體參數(shù)列于表1,部分鍵長(zhǎng)和鍵角列于表2。用于結(jié)構(gòu)分析的晶體學(xué)數(shù)據(jù)已存放在劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心(CCDC),參考編號(hào)為:2175230(1)。

表1 配合物1的晶體數(shù)據(jù)

表2 配合物1的部分鍵距(?)和角度(°)

圖2 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)圖

2.3 生物活性

為了研究配合物1作為抗腫瘤藥物的活性,分別測(cè)試了其對(duì)T24人膀胱癌細(xì)胞、MGC-803人胃腺癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞和NCI-H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性,測(cè)試結(jié)果如表3所示。同時(shí)為了對(duì)比研究,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下也測(cè)試了順鉑的細(xì)胞毒性,配合物的IC50值在微摩爾范圍內(nèi),分別為8.19±0.58,5.48±0.59,5.86±0.92,9.57±0.44 μmol/L,結(jié)果表明健康細(xì)胞HL-7702的細(xì)胞毒性較小(15.60±0.37 μmol/L )。配體L的IC50值整體較大,IC50值都在93 μmol/L以上。配合物1的IC50值分別為17.45±1.32,39.26±5.62,21.85±1.22和24.67±6.32 μmol/L。配合物1的IC50值大于順鉑的IC50值,但遠(yuǎn)小于配體L的IC50值。

表3 配合物1及配體對(duì)四種癌細(xì)胞的IC50值

3 結(jié)論

將4-亞胺二乙基水楊醛和苯胺按照物質(zhì)的量比為1∶1共混制備了2-苯胺基-5-二乙氨基-苯酚,并將2-苯胺基-5-二乙氨基-苯酚作為配體與二氯(五甲基環(huán)戊二烯基)合銥(III)二聚體反應(yīng)制備了水楊醛芳基銥(III)配合物。通過(guò)核磁共振氫譜、元素分析、HR-ESI質(zhì)譜分析和X射線單晶衍射對(duì)目標(biāo)配合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。水楊醛芳基銥(III)配合物對(duì)T24人膀胱癌細(xì)胞、MGC-803人胃腺癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞和NCI-H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出一定的體外抑制活性,IC50值分別為17.45±1.32,39.26±5.62,21.85±1.22和24.67±6.32 μmol/L。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看到,目標(biāo)配合物的抗腫瘤活性具有一定的選擇性,對(duì)T24人膀胱癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞的體外抑制活性高于HL-7702健康細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為有機(jī)金屬抗癌藥物的研究和開(kāi)發(fā)提供參考,但其具體的抗癌機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。