人鼻病毒3C蛋白酶發(fā)酵工藝研究

曾維星

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢 430068)

人鼻病毒3C蛋白酶是一種切割小RNA病毒科非結(jié)構(gòu)蛋白的關(guān)鍵酶,可識別含有Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro序列的蛋白,并切割Gln與Gly之間的酰胺鍵,酶切適宜溫度范圍為4 ℃至30 ℃[1],對于溫度敏感的底物較為友好,作為一種基因工程方面的工具酶,其作用為去除融合蛋白的標(biāo)簽[2]。3C 蛋白酶作為mRNA的體外合成重要酶原料,對其展開發(fā)酵工藝研究,具有一定的社會價值,描述了搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)3C 蛋白酶的重組大腸桿菌,確定了最優(yōu)培養(yǎng)基,接著通過發(fā)酵罐放大培養(yǎng)摸索,完成菌株穩(wěn)定表達(dá)3C蛋白酶的發(fā)酵工藝,為該酶的工業(yè)化放大生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗所用的重組菌株為本實驗室保存。

1.2 試劑及設(shè)備

酵母粉及蛋白胨購買于安琪酵母股份有限公司、磷酸二氫鉀、甘油、硫酸亞鐵、硫酸鋅等購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,垂直流潔凈工作臺為Opticlean1300型號,超微量紫外分光光度計為NanoDrop One型號,立式恒溫振蕩器為IS-RDV1型號,7 L發(fā)酵罐為BIOTECH-7JG-7000A型號,無油靜音空氣壓縮機(jī)為TE7502型號,低溫保存箱為DW-30L818P型號,pH計為德國梅特勒-托利多FE28-Standard型號,高壓均質(zhì)機(jī)為AH-NANO型號。

1.3 試驗過程

1.3.1 培養(yǎng)基的尋優(yōu)篩選

1.3.1.1 Plackett-Burman試驗

大腸桿菌生長所需要的營養(yǎng)包括六大類物質(zhì),需要有合適的碳源、氮源、微量元素的提供,其中微量元素需求量少,但對微生物的生長起著重要的促進(jìn)作用[3],通過單因素試驗,初步確定將酵母粉、蛋白胨、甘油、硫酸鋅、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、種齡、接種量為初始培養(yǎng)物料及條件作為培養(yǎng)的重點考察項目,見表1。根據(jù)表達(dá)常規(guī)所需的濃度設(shè)定高低水平值。選擇n=12的試驗組,并將上述的8個因素作為分析對象,使用Minitab 19 軟件設(shè)計Plackett-Burman試驗,按500 mL 三角搖瓶裝液150 mL 培養(yǎng)液規(guī)模實施試驗,取菌體生長4 h的OD600,實施完畢后,匯總數(shù)據(jù)至Minitab 19的新建列中分析因子設(shè)計。

表1 Plackett-Burman試驗預(yù)定因素的取值表

1.3.1.2 最陡爬坡試驗

按設(shè)計進(jìn)行Plackett-Burman試驗后,將結(jié)果錄入Minitab 19 軟件的新建列中,進(jìn)行DOE項下的因素分析,可得到方差分析數(shù)據(jù)表,根據(jù)各項因素的顯著性程度判斷該因素是否為影響培養(yǎng)OD600的顯著因素,T值表示接受原假設(shè)的置信區(qū)間,P值為除T值置信區(qū)間以外的區(qū)域,P值越小,說明統(tǒng)計學(xué)上,一般以P值<0.05作為因素顯著的判斷點,確定出酵母粉、蛋白胨、甘油三個因素具有顯著因素,并對顯著因素設(shè)置0.5～1.0的步長,且均為正效應(yīng)因素,實施最陡爬坡實驗。選取各因素在Plackett-Burman試驗設(shè)計中靠近上限的值為爬坡起點值。

1.3.1.3 響應(yīng)面試驗

最陡爬坡試驗確定中心點后,以中心點位置繼續(xù)對較優(yōu)的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,通過Minitab 19 軟件設(shè)計Box-Behnken試驗[4],進(jìn)一步對顯著影響培養(yǎng)的重要因素條件進(jìn)行分析,建立三因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計,見表2,然后按設(shè)計實施試驗,將試驗結(jié)果匯總至Minitab 19 的新建列中,分析響應(yīng)曲面設(shè)計。

表2 響應(yīng)面試驗水平設(shè)計表

1.3.1.4 延長時間培養(yǎng)

篩選到的培養(yǎng)基組成比例及合適初始條件后,無菌操作接種大腸桿菌菌種,轉(zhuǎn)移到IS-RDV1型號的立式恒溫振蕩器,開始搖床振蕩培養(yǎng),設(shè)置轉(zhuǎn)速200 r/min,設(shè)置溫度37 ℃,并且將培養(yǎng)時間延長至16 h 左右,過程中取樣,使用NanoDrop One超微量紫外分光光度計檢測發(fā)酵液OD600值,并對隨時間變化的OD600值進(jìn)行簡要的曲線描述,驗證篩選后的培養(yǎng)基是否符合培養(yǎng)需求,確認(rèn)對數(shù)生長期及對菌體生長程度進(jìn)行量化。過程中觀察大腸桿菌的生長OD600,充分了解該重組菌的延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期、衰退期,為放大培養(yǎng)提供參考依據(jù),以及驗證尋優(yōu)后的培養(yǎng)基是否符合。

1.3.2 大腸桿菌的發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

尋優(yōu)到可靠的培養(yǎng)成分的組成后,以7 L 罐進(jìn)行發(fā)酵設(shè)計,按比例配制所需要的培養(yǎng)基成分,并加入純化水,攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至潔凈的7 L 發(fā)酵罐內(nèi),進(jìn)行放大培養(yǎng)。整個發(fā)酵分為兩個階段,在發(fā)酵第一階段,即菌體密度富集階段,通過在線連續(xù)地觀察罐內(nèi)的DO值、pH值、溫度及檢測菌體OD600,鏡檢等措施判斷罐內(nèi)的發(fā)酵狀態(tài),了解重組大腸桿菌的生長趨勢,避免因生長過快,導(dǎo)致宿主菌的質(zhì)粒丟失[5],為了防止乙酸的積累,造成菌體發(fā)酵異常,因此在設(shè)計初期就選擇了非葡萄糖的碳源進(jìn)行發(fā)酵[6],當(dāng)以甘油為糖酵解起始物質(zhì)時,會由甘油脫氫酶GDH以及二羥基丙酮激酶(DHAK)分別轉(zhuǎn)化,最終轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸進(jìn)入到糖酵解[7]。根據(jù)生長節(jié)奏,人為干預(yù)調(diào)控DO、pH值、攪拌、溫度等重要參數(shù),控制大腸桿菌的生長速率維持略高的水平,進(jìn)一步減少乙酸積累的負(fù)面作用[8],在發(fā)酵第二階段,即產(chǎn)物濃度富集階段,菌體的生長繁殖速率放慢,將其導(dǎo)向產(chǎn)物合成代謝途徑,調(diào)整發(fā)酵參數(shù),以最經(jīng)濟(jì)的方式達(dá)到產(chǎn)物富集的目的,可適量將誘導(dǎo)階段的溫度降低,以表達(dá)產(chǎn)生更穩(wěn)定的可溶性蛋白,并調(diào)整合適的溫度,避免包涵體的大量產(chǎn)生,在保證產(chǎn)物表達(dá)量高的同時,盡量降低對能耗的需求。

1.3.3 大腸桿菌的發(fā)酵調(diào)控研究

重組蛋白在大腸桿菌的表達(dá)過程中,經(jīng)常會由于培養(yǎng)條件的原因,造成翻譯后的肽鏈不同程度的折疊錯誤,導(dǎo)致大腸桿菌在表達(dá)中產(chǎn)生不可溶的包涵體,盡管很多學(xué)者對包涵體的解決做出了大量的工作以及成效,但仍沒有一種普適性的方法來徹底抑制任意菌株表達(dá)產(chǎn)生包涵體[9]。本章進(jìn)行的發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)的研究,主要從溫度[10-12]、誘導(dǎo)添加物兩方面進(jìn)行初步的探索,分別進(jìn)行了37 ℃誘導(dǎo)與22 ℃誘導(dǎo)對比,山梨醇[13-15]添加誘導(dǎo)與甜菜堿[16-17]添加誘導(dǎo)效果試驗。

根據(jù)試驗設(shè)計,試驗項目包括:(1)37 ℃誘導(dǎo)、(2)22 ℃誘導(dǎo)、(3)加入甜菜堿、(4)加入山梨醇對蛋白表達(dá)的影響試驗。在發(fā)酵過程中,取過程樣,以便對微生物發(fā)酵過程中的表達(dá)進(jìn)行了解掌握,這些過程樣品包括:補(bǔ)料前的菌液,誘導(dǎo)前菌液,誘導(dǎo)過程中的菌液,根據(jù)情況,至少取1個樣品,誘導(dǎo)結(jié)束的菌液。樣品的處理:取樣后,菌液在高速離心機(jī)下12 000 r/min,5 min離心處理,再加入水重懸,反復(fù)3次,得到菌體重懸液,重懸液再高壓均質(zhì)機(jī)650 bar 左右高壓破碎處理2次,破碎液再次離心,12 000 r/min,15 min后,得到菌體上清以及菌體沉淀,菌體沉淀加純化水重懸至上清相等的體積,再加入5×protein loadingbuffer,煮沸5 min,再上樣電泳。

2 結(jié)果

2.1 篩選培養(yǎng)基結(jié)果

2.1.1 Plackett-Bumran試驗設(shè)計及結(jié)果數(shù)據(jù)

Plackett-Bumran 試驗設(shè)計及結(jié)果見表3,根據(jù)該結(jié)果做方差分析,分析表見表4,所預(yù)選的8個因素中,A、B、C三個因素的P值<0.05,呈現(xiàn)顯著性,為影響菌體生長的主要因素,其他因素的P值>0.05,D、F、G為正效應(yīng),在取值時應(yīng)取相對高的水平值,E、H為負(fù)效應(yīng),在取值時應(yīng)取相對低的水平值。

表3 Plackett-Bumran試驗數(shù)據(jù)表

表4 Plackett-Bumran試驗方差分析數(shù)據(jù)表

2.1.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗的數(shù)據(jù)結(jié)果見表5。最佳的Y值在第3行的試驗,A值5 g·L-1,B值10.5 g·L-1,C值9.5 g·L-1。

表5 最陡爬坡試驗數(shù)據(jù)表

2.1.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表6。對結(jié)果進(jìn)行回歸分析,所得到的回歸方程各項方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 回歸方程各項方差分析表

使用Minitab 19 對Box-Behnken試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面分析,得到回歸方程:Y=2.786 67-0.024 75 X1-0.044 00 X2-0.013 75 X3-0.06646 X12-0.055 46 X22-0.077 46 X32-0.019 25 X1X2+0.019 25 X1X3-0.030 25 X2X3,對回歸方程取各項的一階偏導(dǎo)數(shù)等于零,并整理得到三元一次方程組:-0.025-0.066 X1-0.019 X2+0.019 X3=0,-0.044-0.055 X2-0.019 X1-0.030 X3=0-0.014-0.077 X3+0.019 X1-0.030 X2=0,通過計算后,換算得到重要因素X1值-0.13,X2值-0.80,X3值0.081,A值4.94 g·L-1,B值8.6 g·L-1,C值9.54 g·L-1。代至回歸方程,得到理論最佳Y值為2.789,結(jié)合回歸方程的方差分析,失擬項的P值為0.136>0.05,失擬的顯著性不高,說明該響應(yīng)面模型與實際培養(yǎng)情況具有較好的擬合性。

2.1.4 延長時間生長培養(yǎng)結(jié)果

收集菌體生長OD600值,繪制生長曲線圖,見圖 1。發(fā)現(xiàn)菌體在0到2 h,生長較緩慢,處于適應(yīng)階段,2到4 h生長繁殖開始旺盛,4到8 h處于對數(shù)生長期,8到12 h左右,處于穩(wěn)定期,之后有衰退跡象,搖瓶水平生長OD600最高值為13.59。延長培養(yǎng)后,觀察整個過程,4 h時菌體已經(jīng)達(dá)到旺盛生長的對數(shù)前期,菌體OD600值為2.77,與響應(yīng)面模型理論值接近。

圖1 大腸桿菌OD600隨時間變化圖

2.2 放大培養(yǎng)結(jié)果

按尋優(yōu)后的發(fā)酵培養(yǎng)基,接種重組大腸桿菌放大發(fā)酵培養(yǎng),生長到4 h,其中7個批次的OD600已達(dá)到11.0～13.2,選擇發(fā)酵較優(yōu)的調(diào)控批次,其預(yù)先制定的發(fā)酵條件特點是通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、攪拌控制DO值范圍在15%～30%范圍內(nèi),維持pH值在6.90～7.10上下幅度0.20 較為寬泛的控制區(qū)間內(nèi)。使用Origin 9.0 軟件繪制發(fā)酵溫度、pH值、DO值、轉(zhuǎn)速等重要參數(shù)曲線圖(圖 2 ),作為大腸桿菌表達(dá)3C 蛋白酶的產(chǎn)業(yè)化放大依據(jù)。

圖2 發(fā)酵重要參數(shù)全周期曲線

2.3 菌株的發(fā)酵調(diào)控研究結(jié)果

通過圖3,37 ℃誘導(dǎo)時,據(jù)Image J 灰度分析,沉淀表達(dá)量約為可溶表達(dá)的3倍。通過對比,加入甜菜堿后未見包涵體表達(dá)降低,也未見明顯影響可溶3C 蛋白酶的表達(dá)。

M:蛋白marker;1:37 ℃ 誘導(dǎo)前的菌上清;2:37 ℃誘導(dǎo)前的菌沉淀;3:37 ℃ 誘導(dǎo)中的菌上清;4:37 ℃誘導(dǎo)的中菌沉淀;5:37 ℃ 誘導(dǎo)末的菌上清;6:37 ℃誘導(dǎo)末的菌沉淀;7:37 ℃ 誘導(dǎo)前的菌上清(甜菜堿);8:37 ℃誘導(dǎo)前的菌沉淀(甜菜堿);9:37 ℃ 誘導(dǎo)中的菌上清(甜菜堿);10:37 ℃誘導(dǎo)中的菌沉淀(甜菜堿);11:37 ℃ 誘導(dǎo)末的菌上清(甜菜堿);12:37 ℃誘導(dǎo)末的菌沉淀(甜菜堿)。

通過圖4,可以觀察到,37 ℃誘導(dǎo)時,加入山梨醇后未見包涵體表達(dá)降低,可溶表達(dá)量相對偏低。

M:蛋白marker;1:37 ℃ 誘導(dǎo)前的菌上清(山梨醇);2:37 ℃誘導(dǎo)前的菌沉淀(山梨醇);3:37 ℃ 誘導(dǎo)中的菌上清(山梨醇);4:37 ℃誘導(dǎo)中的菌沉淀(山梨醇);5:37 ℃ 誘導(dǎo)末的菌上清(山梨醇);6:37 ℃誘導(dǎo)末的菌沉淀(山梨醇);7:37 ℃ 誘導(dǎo)末菌上清;8:37 ℃誘導(dǎo)末的菌沉淀;9:37 ℃ 誘導(dǎo)末的菌上清(甜菜堿);10:37 ℃誘導(dǎo)末的菌沉淀(甜菜堿);11:37 ℃ 誘導(dǎo)末的菌上清(山梨醇);12:37 ℃誘導(dǎo)末的菌沉淀(山梨醇)。

通過電泳圖5,在補(bǔ)料前及誘導(dǎo)前,非目的蛋白的表達(dá)逐漸增加,在目的蛋白條帶位置附近,有明顯的粗條帶。在誘導(dǎo)后均隨著時間增加,可溶表達(dá)增加。

M:蛋白marker;1:補(bǔ)料前菌上清;2:補(bǔ)料前菌沉淀;3:誘導(dǎo)前菌上清;4:誘導(dǎo)前菌沉淀;5:誘導(dǎo)2 h菌上清;6:誘導(dǎo)2 h菌沉淀;7:誘導(dǎo)4 h菌上清;8:誘導(dǎo)4 h菌沉淀;9:誘導(dǎo)6 h菌上清;10:誘導(dǎo)6 h菌沉淀;11:誘導(dǎo)8 h菌上清;12:誘導(dǎo)8 h菌沉淀。

根據(jù)Image J 灰度分析軟件,對圖5 中的5～12號的3C 蛋白酶所在條帶進(jìn)行灰度分析,得到灰度分析產(chǎn)生的表達(dá)量值,將該表達(dá)量值與誘導(dǎo)時間作圖,得到圖6,通過該圖可以觀察到,可溶表達(dá)明顯多于包涵體表達(dá),在第2,4,6,8 h,可溶表達(dá)與包涵體表達(dá)量的比值分別為14.78,5.21,2.18,1.78,隨著可溶表達(dá)的增長,包涵體表達(dá)也隨可溶表達(dá)同步在增長,且二者增長速率接近。另外在22 ℃誘導(dǎo)時,可溶表達(dá)為主要表達(dá)占比,顯示出低溫誘導(dǎo)能夠明顯降低目的蛋白的包涵體表達(dá)。綜合上述研究,相對于37 ℃,誘導(dǎo)溫度22 ℃明顯降低包涵體表達(dá),根據(jù)表達(dá)情況,可將發(fā)酵結(jié)束時間確定在誘導(dǎo)后6 h。

圖6 重組菌在22 ℃誘導(dǎo)不同時間的可溶與包涵體表達(dá)量

通過試驗的SDS-PAGE電泳圖判斷,溫度明顯影響3C蛋白酶可溶表達(dá)以及3C 蛋白酶總表達(dá)量,較高溫度條件下的主要因素同樣也是溫度。甜菜堿以及山梨醇的添加,對于3 C蛋白酶的發(fā)酵表達(dá)沒有表現(xiàn)出明顯的提升或者損失。

3 討論

在本研究中,通過借助響應(yīng)面分析方法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,即通過Plackett-Bumran試驗確認(rèn)出對菌體生長具有顯著性影響的三個因子,即酵母粉、蛋白胨、甘油,進(jìn)一步尋優(yōu)確定酵母粉最佳添加濃度4.94 g·L-1,蛋白胨8.60 g·L-1,甘油為9.54 g·L-1。經(jīng)過放大培養(yǎng),結(jié)合大腸桿菌生長特性,確定了pH值在6.90～7.10,DO值在15%～30%,培養(yǎng)溫度37 ℃,誘導(dǎo)溫度22 ℃的發(fā)酵條件,發(fā)酵結(jié)束時間確定在誘導(dǎo)后6 h。通過上述研究,最終建立了適合于大腸桿菌表達(dá)3C蛋白酶的穩(wěn)定、可行的發(fā)酵工藝,未發(fā)現(xiàn)甜菜堿、山梨醇對降低包涵體表達(dá)的明顯促進(jìn)作用。本研究實施的大腸桿菌產(chǎn)人鼻病毒3 C蛋白酶發(fā)酵工藝研究,為進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了依據(jù),具有一定的實際意義。