生物原料蛋白胨中重要成分的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法

田夢(mèng)園 張進(jìn) 國果 李博巖

1（貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院， 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025）

2（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴陽 550025）

蛋白水解物（Protein hydrolysate）又稱蛋白胨，是蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿和酶不完全水解而得到的水溶性混合物。蛋白胨按來源可分為植物源、動(dòng)物源和微生物源。蛋白胨富含多種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充因子，因此被廣泛用于食品、微生物培養(yǎng)和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。尤其是以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的治療性抗體和功能性蛋白為主的現(xiàn)代生物制藥，越來越多地使用動(dòng)物源蛋白胨，用于改善細(xì)胞生長(zhǎng)特性和提高容積效率。蛋白胨的化學(xué)組成復(fù)雜，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的多種氨基酸、肽、碳水化合物、維生素、微量元素和生長(zhǎng)因子等物質(zhì)[2]，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡、抗氧化和抗菌等生物活性[3]，能夠顯著提高細(xì)胞的增長(zhǎng)速度和降低細(xì)胞培養(yǎng)成本。其中，氨基酸、鳥嘌呤和腺嘌呤是供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的核心成分，參與細(xì)胞呼吸、合成三磷酸腺苷，促進(jìn)蛋白質(zhì)、DNA 和RNA 合成[4]，可作為蛋白胨質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。然而，這些物質(zhì)的穩(wěn)定性以及含量易受溫度、濕度、濃度和光照條件等因素影響[5]，致使蛋白胨的生物性能與使用價(jià)值降低。因此，準(zhǔn)確分析和表征蛋白胨樣本中的化學(xué)成分是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題。目前，蛋白胨的研究主要集中在制備方法[6]、含量測(cè)定[7-11]和細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用[1]等方面，有關(guān)貯存條件等影響其成分變化以及質(zhì)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素的研究卻鮮有報(bào)道。

熒光、拉曼和近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合適用于大規(guī)模原材料的篩選與質(zhì)量鑒定，可以實(shí)現(xiàn)樣品的快速無損分析，是表征樣品質(zhì)量與批次變化的最常用方法[12]，但難以滿足蛋白胨溶液成分變化的解析要求。傳統(tǒng)的高效液相色譜法測(cè)定氨基酸，通常需要衍生化處理，存在操作繁瑣、破壞樣本、成本昂貴、衍生產(chǎn)物易污染儀器以及重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UHPLCMS/MS）具有超高效液相色譜的快速分離與質(zhì)譜的高分辨檢測(cè)能力，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行分析具有顯著優(yōu)勢(shì)[13]。

本研究利用UHPLC-MS/MS 技術(shù)，無需衍生化處理，直接測(cè)定蛋白胨樣品溶液中16 種重要化合物的含量，建立了一種準(zhǔn)確、高效分析蛋白胨的方法。通過考察不同貯存溫度條件下多組分含量的變化，確定蛋白胨樣品的適宜貯存和使用條件，為蛋白胨的質(zhì)量評(píng)估和控制提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Qsight LX50 超高效液相色譜儀、Qsight 210 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國珀金埃爾默公司）；120D 分析天平（日本島津公司）；ST8R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國賽默飛公司）；PHS-25 雷磁pH 計(jì)（上海儀電公司）；Syncronis HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國賽默飛公司）；Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國賽默飛公司）；Raptor Polar X 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國RESTEK公司）。

蛋白胨（美國Merck 公司）。標(biāo)準(zhǔn)品：鳥嘌呤（Guanine）、腺嘌呤（Adenine） （HPLC 級(jí)，≥98%，南京草本源生物科技有限公司）；脯氨酸（Pro） （HPLC 級(jí)，≥99%，美國Merck 公司）；天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和丙氨酸（Ala） （HPLC 級(jí)，≥98%），上海生工生物工程公司。甲酸（LC-MS 級(jí)，美國CNW 公司）；乙酸銨（LC-MS 級(jí)，美國Merck 公司）；乙腈（HPLC級(jí)，≥99.9%，美國Merck 公司）。蒸餾水（香港屈臣氏有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱取16 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各25.0 mg， 用0.10 mol/L HCl 溶解并定容至25 mL， 制備1.00 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。

移取適量的各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合后用1%甲酸-乙腈溶液稀釋，制備一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各物質(zhì)的濃度分別為Trp:0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mg/L；Phe、Leu、Ile:0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00 mg/L；Tyr、Val: 0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00、15.00 mg/L；Pro: 0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、5.00 mg/L；Ala: 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L；Thr、Ser、Arg、Lys、Glu、Asp: 0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L；Adenine:0.005、0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L；Guanine:0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L。溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品溶液制備

稱取1.60 g 樣品，以超純水溶解并定容至100 mL。取100 μL 溶液至2 mL 離心管中，加入900 μL 1%甲酸-乙腈溶液，4 ℃下以14000 r/min 離心5 min， 取上清液100 μL，與900 μL 90%乙腈混勻，過0.22 μm 濾膜后，待測(cè)。所有操作均在避光條件下完成。

1.2.3 不同貯存溫度條件下的樣品分析

取5 個(gè)不同貯存溫度（-80、-40、-20、4 和25 ℃）下的貯存樣品溶液，用UHPLC-MS/MS 方法分別于第0、2、4、6、8、15 和30 天分析樣品溶液中的14 種氨基酸和腺嘌呤、鳥嘌呤的含量，并測(cè)量溶液的pH 值。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 液相色譜條件

RESTEK Raptor Polar X 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 2.7 μm）；保護(hù)柱過濾器：Thermo Scientific?UHPLC filters（2.1 mm×0.2 μm，美國賽默飛公司）；流動(dòng)相A 為0.5%甲酸溶液，流動(dòng)相B 為90%乙腈溶液（含有20.0 mmol/L 乙酸銨）。梯度洗脫：0～2.0 min，2% A；2.0～15.0 min，2%～15% A；15.0～20.0 min，15%～30% A；20.0～21.0 min，30%～12% A；21.0～23.0 min，12% A；23.0～25.0 min，12%～2% A；25.0～30.0 min，2% A。柱溫：20 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；ESI 噴霧電壓：5850 V；反吹干燥氣流速：120 L/h；霧化器流速：220 L/h；熱表面誘導(dǎo)去溶劑質(zhì)譜接口溫度：320 ℃；離子源溫度：350 ℃。各目標(biāo)物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 16種化合物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)與色譜保留時(shí)間信息Table 1 Mass spectrometric (MS) parameters and chromatographic retention time of 16 kinds of compounds

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用MATLAB R2021b 軟件（MATHWORKS）進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析（ANOVA）、Tukey′s HSD 檢驗(yàn)和主成分分析（PCA），以p＜0.05 表示有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)一般以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

氨基酸多屬于極性較強(qiáng)的化合物，通常采用親水性色譜柱進(jìn)行分離。本研究考察了Thermo Syncronis HILIC （100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）、Accucore C18（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm）和RESTEK Raptor Polar X（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）3 種色譜柱對(duì)氨基酸的分離性能（見電子版文后支持信息圖S1）。在相同的色譜洗脫條件下分離16 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，RESTEK Raptor Polar X 柱的分離效果最好（圖1A）；HILIC 柱的粒徑較小、平衡時(shí)間長(zhǎng)、柱壓高，并且分離度不及Raptor 柱；C18柱分離效果最差。上述結(jié)果說明，傳統(tǒng)的反相色譜柱不適合分離未衍生的氨基酸物質(zhì)，因此，本研究選擇Raptor 色譜柱。

圖1 （A）16 種標(biāo)準(zhǔn)品混合物與（B）樣品溶液中16 種化合物的定量離子流圖Fig.1 Quantitative production ion chromatograms of (A) 16 kinds of standards mixture and (B) 16 kinds of compounds in hydrolysate solution

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

以乙腈和水為基礎(chǔ)流動(dòng)相，系統(tǒng)研究了甲酸和乙酸銨作為調(diào)節(jié)劑對(duì)目標(biāo)化合物的色譜峰形和分離效果的影響。當(dāng)水相中加入0.1%甲酸時(shí)，多數(shù)化合物的色譜峰響應(yīng)低、分離度差；隨著甲酸濃度增加，目標(biāo)化合物的峰形與強(qiáng)度都有所改善；當(dāng)甲酸濃度為0.5%、pH=2.25 時(shí)，色譜峰形與響應(yīng)都較好（見電子版文后支持信息圖S2）。在乙腈流動(dòng)相中添加20.0 mmol/L 乙酸銨且pH=5.20 時(shí)，各化合物能得到很好分離與準(zhǔn)確定量（圖1A，電子版文后支持信息圖S3）。

2.1.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通常，氨基酸為兩性化合物，在正離子模式下的響應(yīng)更強(qiáng)。采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，優(yōu)化駐留時(shí)間等參數(shù)有效分離和檢測(cè)氨基酸、鳥嘌呤和腺嘌呤等（表1）。在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下所得的蛋白胨樣品溶液中16 種目標(biāo)化合物的定量離子流圖見圖1B，16 種化合物的色譜峰形較好、分離度高。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，計(jì)算各物質(zhì)濃度（x）與其在特定離子峰下的色譜峰面積（y），擬合數(shù)據(jù)得到16 種物質(zhì)的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)（R2），結(jié)果見表2，16 種化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.99。

表2 16種化合物的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2 Linear ranges, regression equations, determination coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantification(LOQs) of 16 kinds of compounds

采用逐步稀釋低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，選取各物質(zhì)色譜峰附近基線為參照，計(jì)算信噪比（S/N），以S/N≥3 且符合定性要求的物質(zhì)的最低濃度為檢出限（LOD），以S/N≥10 且滿足精密度和準(zhǔn)確度要求的物質(zhì)的最低濃度為定量限（LOQ），計(jì)算各化合物的檢出限與定量限（表2）。與文獻(xiàn)[13]的分析方法相比，本研究提出的UHPLC-MS/MS 方法定量分析蛋白胨溶液中16 種化合物具有更低的檢出限和定量限。

2.2.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算各物質(zhì)色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD 在1.08%～2.16%之間（電子版文后支持信息表S1），表明儀器精密度較好。與文獻(xiàn)[13]的分析方法相比，本研究提出的UHPLC-MS/MS 方法定量分析蛋白胨溶液中16 種化合物更準(zhǔn)確，精密度更優(yōu)。

準(zhǔn)確稱取蛋白胨粉末樣本1.60 g，共6 份，分別制備溶液并測(cè)定其中的16 種目標(biāo)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰面積。16 種物質(zhì)含量的RSD 在1.40%～4.94%范圍內(nèi)（電子版文后支持信息表S1），表明本方法的重復(fù)性較好。

取同一批次蛋白胨樣本，制備成溶液后，分別在0、6、12、18 和24 h 進(jìn)行UHPLC-MS/MS 檢測(cè)分析。結(jié)果表明，16 種目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰面積的RSD 在0.75%～4.68%之間（電子版文后支持信息表S1），樣品溶液在24 h 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.3 加標(biāo)回收率

稱取蛋白胨粉末1.60 g，共9 份，每3 份為1 組，分別加入3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，測(cè)定樣品溶液各目標(biāo)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰面積，計(jì)算含量和加標(biāo)回收率（電子版文后支持信息表S2）。結(jié)果表明，16 種物質(zhì)的平均加標(biāo)回收率在91.7%～106.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.63%（n= 3）。

2.3 貯存溫度對(duì)樣品組成的影響

考察了不同貯存溫度（-80、-40、-20、4 和25 ℃）下的蛋白胨樣品溶液pH 值隨貯存時(shí)間的變化關(guān)系。如圖2 所示，當(dāng)貯存溫度為-80、-40 和-20 ℃時(shí)，貯存30 d 后，樣品溶液的pH 值穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)的均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為（7.024±0.024）、（7.022±0.020）和（7.022±0.018）。當(dāng)貯存溫度為25 ℃時(shí)，樣品溶液的pH 值從最初（0 d）的（7.003±0.006）迅速降至第2 天的（6.413±0.035），然后逐漸上升，直至第30 天達(dá)到（8.350±0.010），與冷凍溫度條件下相比，pH 值增加了1.35。這主要因?yàn)闃悠啡芤褐泻枯^高的葡萄糖在較高溫度下易被微生物消耗，由糖酵解反應(yīng)生成的酸性物質(zhì)導(dǎo)致溶液pH 值下降[14]，隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)，微生物在內(nèi)源酶的作用下分解蛋白質(zhì)而產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，如氨、甲胺、二甲胺和三甲胺等其它類似化合物，使pH 值逐漸增大[15]。當(dāng)貯存溫度為4 ℃時(shí)，第8 天時(shí)樣品溶液的pH 值達(dá)到最小（6.73±0.015），之后逐漸增加，第30 天的pH 值達(dá)到7.800±0.020。這說明較低溫度（如4 ℃）在一定程度上抑制了樣本溶液的生物活性，但在較長(zhǎng)貯存時(shí)間內(nèi)，樣本組分仍然發(fā)生本質(zhì)性改變。

圖2 蛋白胨樣品溶液在不同貯存溫度下pH 值隨貯存時(shí)間的變化圖Fig.2 pH value changes of hydrolysate solution over storage time at different temperatures

-80、-40 和-20 ℃冷凍溫度條件下貯存30 d 后的蛋白胨樣品溶液依然澄清，還保持有蛋白胨新鮮溶液固有的淡黃色，感官性狀未見明顯變化。4 和25 ℃條件下，隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)，溶液顏色變深，渾濁度增加，并產(chǎn)生少量沉淀，帶有明顯的蛋白質(zhì)變質(zhì)氣味。鐵介導(dǎo)的色氨酸氧化可能是樣本溶液顏色變深的一個(gè)重要原因[16]。另外，溶液中存在的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）適宜在25 ℃生長(zhǎng)，產(chǎn)生的水溶性色素而使樣本溶液顏色變深、偏紅。含硫氨基酸在變質(zhì)過程中產(chǎn)生硫化物，通過自由基反應(yīng)形成硫化氫，使其具有異味[17]。產(chǎn)生沉淀的原因可能是受到氨基酸電荷和溶解度的綜合影響，與溶液的pH 值、貯存溫度及樣本濃度相關(guān)[18]。

上述結(jié)果表明，不同貯藏溫度下的樣品溶液的pH 值、感官性狀（電子版文后支持信息圖S4）以及各物質(zhì)的含量明顯變化的時(shí)間點(diǎn)基本一致。

2.4 樣品成分含量變化

2.4.1 方差分析

對(duì)不同溫度條件下各貯存時(shí)間點(diǎn)的樣本溶液進(jìn)行UHPLC-MS/MS 檢測(cè)，分析關(guān)鍵成分的含量變化（電子版文后支持信息表S3～S5，表3 和表4）。單因素方差分析結(jié)果顯示，貯存溫度為-80、-40 和-20 ℃時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)的各物質(zhì)含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異（p＞0.05），表明蛋白胨樣品在冷凍條件下貯存，30 d 內(nèi)化學(xué)成分與樣本質(zhì)量均相對(duì)穩(wěn)定，基本不會(huì)影響樣本的生物性能和使用情況。

表3 4 ℃條件貯存的蛋白胨中各物質(zhì)含量（mg/L）的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance (ANOVA) result of the compositional content (mg/L) in hydrolysate solution stored at 4 ℃

表4 25 ℃條件下貯存的蛋白胨中各物質(zhì)含量（mg/L）的方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA result of the compositional content (mg/L) in hydrolysate solution stored at 25 ℃

貯存溫度為4 和25 ℃時(shí)，纈氨酸和賴氨酸的含量呈現(xiàn)輕微上升趨勢(shì)（p＜0.05），脯氨酸含量基本不變，不受貯存時(shí)間影響（p＞0.05）。其它物質(zhì)得含量隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低（p＜0.05）。單因素方差分析結(jié)果表明，4 和25 ℃條件下樣品中物質(zhì)含量與不同貯存時(shí)間之間存在顯著性差異（p＜0.05）。采用圖基檢驗(yàn)（Tukey′s post hoc test）分析樣品溶液在7 個(gè)貯存時(shí)間點(diǎn)（0～30 d）檢測(cè)所得各物質(zhì)的含量，結(jié)果見表3 和表4，表中相同行內(nèi)不相同的小寫字母標(biāo)記表示各化合物在不同貯存時(shí)間點(diǎn)之間的差異顯著（p＜0.05）。

貯存溫度為4 ℃時(shí)，與初始含量（第0 天）相比，除脯氨酸之外的15 種物質(zhì)含量發(fā)生顯著性變化（p＜0.05）的時(shí)間均為第8 天。含量呈下降趨勢(shì)的13 種物質(zhì)在第8 天的相對(duì)含量降低了3.75%～52.00%，在第30 天降低了11.14%～71.56%。其中，天冬氨酸含量（2.25 mg/L， 第0 天）的降低幅度最大，分別為52.00%（第8 天）和71.56%（第30 天）?？赡艿脑蚴翘於彼崾且环N酸性α-氨基酸，在轉(zhuǎn)氨酶作用下易分解為其它物質(zhì)或轉(zhuǎn)化成賴氨酸等。其它物質(zhì)含量的降低幅度為：谷氨酸（33.33%～58.56%）＞腺嘌呤（20.00%～60.00%）＞蘇氨酸（19.49%～48.01%）＞絲氨酸（18.26%～35.68%）＞鳥嘌呤（18.18%～40.91%）＞酪氨酸（14.97%～29.94%） ＞異亮氨酸（11.92%～36.27%） ＞苯丙氨酸（10.34%～24.14%） ＞丙氨酸（9.46%～37.16%）＞精氨酸（7.91%～18.24%）＞色氨酸（7.69%～15.38%）。樣本中谷氨酸的含量較高（3.33 mg/L@day 0）。游離的谷氨酸是一種微酸性氨基酸，參與溶液中微生物的許多代謝或化學(xué)反應(yīng)而易被消耗，因此其含量隨貯存時(shí)間增長(zhǎng)（＞8 d）迅速降低。腺嘌呤，即維生素B4，為輔酶和核酸的組成成分，是樣品釋放能量的關(guān)鍵，可能因?yàn)閰⑴c糖、蛋白質(zhì)等的代謝，其含量在貯存8 d 后顯著減少。溶液中的蘇氨酸可在生物酶（如脫水酶、蘇氨酸脫酶、醛縮酶）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌陌被嵛镔|(zhì)，致使含量降低。絲氨酸是中性脂肪族含羥基氨基酸，可以異生為糖類物質(zhì)，參與代謝或供能，或在脫水酶催化下脫水脫氨生成丙酮酸而被消耗，導(dǎo)致含量降低。亮氨酸含量隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而下降的幅度最小，分別減少了3.75%（第8 天）和11.14%（第30 天）。亮氨酸與異亮氨酸都是支鏈氨基酸，能夠分解轉(zhuǎn)化為葡萄糖而被消耗，其含量在貯存8 d 后也明顯降低。

蛋白胨樣本中富含賴氨酸（5.68 mg/L，第0 天），其含量在貯存第8 天時(shí)增加到6.21 mg/L，增加幅度為9.33%；在第30 天達(dá)到7.02 mg/L，增加幅度為23.59%。賴氨酸為堿性生酮氨基酸，在樣品溶液中一般不參與轉(zhuǎn)氨基作用。賴氨酸的增加可能源于天冬氨酸經(jīng)過反應(yīng)在還原酶和脫氫酶作用下生成α-氨基乙二酸。蛋白胨富含蛋白質(zhì)，發(fā)酵水解后也產(chǎn)生賴氨酸。蛋白胨是水解產(chǎn)物，4 ℃時(shí)為微生物桿菌（如谷氨酸棒狀桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌）發(fā)酵提供了可行條件。纈氨酸含量在第8 天和第30 天分別提高了5.99%和32.97%。微生物發(fā)酵法是一種常見且經(jīng)濟(jì)的L-型纈氨酸生產(chǎn)方法，4 ℃長(zhǎng)期貯存條件致使樣本溶液易發(fā)酵，纈氨酸含量增加。

與4 ℃的貯存溫度相比，25 ℃更溫和、更適合蛋白胨樣本中微生物發(fā)酵與化學(xué)反應(yīng)，因此溶液組分份變質(zhì)更快、時(shí)間更短。異亮氨酸和丙氨酸的含量在第4 天發(fā)生顯著性變化（p＜0.05），分別降低了11.46%和17.43%。纈氨酸的含量在第6 天增加了32.41%（p＜0.05）。11 種化合物的含量在第2 天發(fā)生了顯著性減少（p＜0.05）：腺嘌呤（40.00%）、谷氨酸（25.83%）、天冬氨酸（23.29%）、鳥嘌呤（18.60%）、絲氨酸（16.67%）、酪氨酸（16.05%）、苯丙氨酸（15.69%）、蘇氨酸（7.91%）、精氨酸（7.80%）、色氨酸（5.13%）、亮氨酸（2.11%）。賴氨酸含量在第2 天顯著性增加了6.11%（p＜0.05）。貯存30 d 時(shí)，這些物質(zhì)含量降低的最小幅度達(dá)15.02%（亮氨酸），最大幅度為82.19%（天冬氨酸），腺嘌呤的降解率高達(dá)80.00%。纈氨酸和賴氨酸含量在30 d 內(nèi)分別上升了44.32%和26.70%?？傊?，4 和25 ℃兩種溫度條件下天冬氨酸和腺嘌呤的降解率最高。這些結(jié)果表明貯存溫度是影響蛋白胨化學(xué)組成與質(zhì)量穩(wěn)定性的重要因素。其中，-80 ℃適合蛋白胨樣本長(zhǎng)期保存，-20 ℃條件下至少可以貯存1 個(gè)月，2～4 ℃冷藏7 d 后樣本會(huì)變質(zhì)，25 ℃的室溫下樣本存放1～2 d 就會(huì)變質(zhì)。

圖3 為5 個(gè)溫度條件下，不同貯存時(shí)間點(diǎn)蛋白胨中各目標(biāo)化合物含量變化熱圖，顯示了15 種物質(zhì)含量的顯著性差異動(dòng)態(tài)變化（n=3）。在非冷凍貯存過程中，蛋白胨的物質(zhì)含量變化是一個(gè)復(fù)雜過程。微生物在適宜的溫度條件下迅速繁殖，同時(shí)消耗其中的營(yíng)養(yǎng)成分導(dǎo)致樣品變質(zhì)，這是造成樣品組成物質(zhì)含量隨貯存時(shí)間變化的主要原因。25 ℃更利于多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，分解消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速率更快。多數(shù)氨基酸以及腺嘌呤和鳥嘌呤在微生物的脫氨基作用下發(fā)生降解，如氨基酸脫氨生成α-酮酸和氨[19]，絲氨酸和蘇氨酸可在脫水酶催化下脫水脫氨，生成酮酸和氨。脫氨基作用產(chǎn)生的氨不斷積累，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有抑制和毒性作用，因而影響蛋白胨的生物性能。脫羧基作用也是氨基酸分解的途徑之一。在氨基酸脫羧酶的作用下脫羧生成二氧化碳和胺類化合物，如酪氨酸和色氨酸（以及組氨酸）分別轉(zhuǎn)化為酪胺和色胺（及組胺）[20]。乳酸菌、微球菌和葡萄球菌等微生物含有蛋白酶、脂肪酶和氨基酸脫羧酶，可促進(jìn)蛋白質(zhì)分解為氨基酸[21]，這可能是導(dǎo)致一些氨基酸含量增加的原因之一。

圖3 5 個(gè)不同貯存溫度條件下不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白胨溶液中各物質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化圖: （A） -80 ℃；（B）-40 ℃；（C）-20 ℃；（D）4 ℃；（E）25 ℃Fig.3 Heatmap of temporal changes of content of 15 kinds of compositions in hydrolysate solution over storage time at five temperatures: (A) -80 ℃; (B) -40 ℃; (C) -20 ℃; (D) 4 ℃; (E) 25 ℃

此外，樣品中的氨基酸與其含有的金屬離子、糖類和維生素等發(fā)生反應(yīng)，如氨基酸與還原糖的非酶促M(fèi)aillard 反應(yīng)也可能導(dǎo)致氨基酸含量顯著下降。25 ℃條件下，隨pH 值升高，可能發(fā)生的Maillard 反應(yīng)強(qiáng)度增大[22]。多數(shù)水溶性維生素也是輔酶或輔基的主要成分，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮重要作用，如維生素B6 參與氨基酸代謝，提供重要的轉(zhuǎn)氨酶及脫羧酶的輔酶，促進(jìn)氨基酸的降解[23]。

2.4.2 主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）是一種常用的多元統(tǒng)計(jì)方法，用于無監(jiān)督模式下提取數(shù)據(jù)特征。針對(duì)4 和25 ℃貯存條件下樣品在不同貯存時(shí)間所測(cè)得的16 種物質(zhì)含量，經(jīng)過歸一化和中心化方法處理3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，進(jìn)行PCA。3 個(gè)主成分解釋了4 ℃條件下的樣本物質(zhì)含量數(shù)據(jù)的99.06%的方差。圖4 給出了第1 個(gè)主成分（PC1）對(duì)第2 個(gè)主成分（PC2）的主成分得分圖。顯然，從第0 天至第6 天，16 種物質(zhì)的含量變化不顯著，對(duì)應(yīng)的主成分得分值相近，分布在95%的置信區(qū)域內(nèi)（即橢圓形區(qū)域）；然而在第8 天、第15 天和第30 天時(shí)含量發(fā)生明顯變化，對(duì)應(yīng)的得分值差異較大。3 次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

圖4 4 ℃條件下貯存30 d 后樣品溶液中16 種物質(zhì)含量的主成分分析得分圖Fig.4 Principal component analysis(PCA)score plot of the content of 16 kinds of compositions in hydrolysate solution during a period of 30 days stored at 4 ℃

25 ℃條件下樣品溶液的物質(zhì)濃度變化迅速。為更細(xì)致監(jiān)測(cè)樣品變化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)增加了6、12、18 和24 h 這4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的物質(zhì)含量數(shù)據(jù)。PCA 模型的3 個(gè)主成分解釋了98.26%的數(shù)據(jù)方差。得分圖（圖5）顯示在1 d 內(nèi)的貯存時(shí)間點(diǎn)樣品含量變化不顯著（p＜0.05），從第2 天至第30 天的每個(gè)貯存時(shí)段的樣品組成含量均發(fā)生明顯改變，并且彼此顯著不同。PCA 結(jié)果進(jìn)一步說明樣本在25 ℃條件下存放1～2 d，其生物性能就發(fā)生改變，不可再使用。

圖5 25 ℃條件下貯存30 d 后樣品溶液中16 種物質(zhì)含量的主成分分析得分圖Fig.5 PCA score plot of the content of 16 kinds of compositions in hydrolysate solution during a period of 30 d stored at 25 ℃

3 結(jié)論

通過優(yōu)化UHPLC-MS/MS 實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立了蛋白胨溶液中氨基酸、鳥嘌呤和腺嘌呤等16 個(gè)重要成分的定量分析方法，本方法具有良好的準(zhǔn)確性與精確性。貯存溫度是引起蛋白胨成分含量變化的重要因素。結(jié)果表明，樣品在-20 ℃以下冷凍溫度保存30 d 質(zhì)量穩(wěn)定；樣品不宜在4 和25 ℃條件下儲(chǔ)藏，多數(shù)化合物易發(fā)生降解反應(yīng)。不同貯藏溫度下的樣品溶液的pH 值、感官性狀以及各物質(zhì)的含量明顯變化的時(shí)間點(diǎn)基本一致。因此，可以通過測(cè)定樣本溶液的pH 值與感官性狀變化，大致判斷蛋白胨的質(zhì)量狀態(tài)，為合理使用蛋白胨提供了參考。