裂解多糖單加氧酶活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

沈潔如 王素英 張宏宇 婁婷婷 喬晨曦

1（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院， 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300134）

2（天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心， 天津 300461）

纖維素和幾丁質(zhì)是自然界中儲(chǔ)量居第一位和第二位的生物質(zhì)資源，分別以葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）為單體，通過(guò)β-1,4 糖苷鍵連接而成的直鏈高聚物[1-3]。一直以來(lái)，這類(lèi)結(jié)晶態(tài)多糖的降解和利用是實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[4-6]。因纖維素和幾丁質(zhì)的分子內(nèi)部及分子間存在氫鍵，可形成高度有序的結(jié)晶態(tài)結(jié)構(gòu)，限制了糖苷水解酶的可及性[7-8]，阻礙多糖結(jié)晶區(qū)域的有效降解[9]。然而，具有氧化裂解纖維素和幾丁質(zhì)等結(jié)晶區(qū)域特性的裂解多糖單加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases，LPMOs）的發(fā)現(xiàn)，為頑固多糖降解提供了新的方向[10-14]，在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和生物燃料工業(yè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[15-16]。

在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cazy.org）中，LPMOs 歸為輔助活性家族（Auxiliary activity family，AA），目前已有AA9～11 和AA13～16 共7 個(gè)家族，其中，AA9 和AA10 家族的LPMOs 研究比較深入[17-20]。AA9 家族的LPMOs 主要源于真菌，作用于纖維素[21-22]、可溶性纖維寡糖[23]、木聚糖[24]、半纖維素[25]和淀粉[26]等底物。AA10 家族的LPMOs 主要源于細(xì)菌，具有纖維素、幾丁質(zhì)、木聚糖以及甘露聚糖降解活性[10,14,27-28]。為探索各家族LPMOs 的酶學(xué)特性及其催化機(jī)理，對(duì)LPMOs 活性的檢測(cè)至關(guān)重要。目前，LPMOs 活性的檢測(cè)方法逐漸多樣化，主要包括色譜-質(zhì)譜法、比色法和熒光探針標(biāo)記法等。其中，色譜-質(zhì)譜法因其靈敏度高、可對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析等特點(diǎn)，為解析LPMOs 催化機(jī)制提供了重要手段[21,29-31]；比色法通過(guò)測(cè)定底物或產(chǎn)物的濃度，與酶活力建立量效關(guān)系，進(jìn)而表征LPMOs 活性，常應(yīng)用于突變體的快速高通量篩選[3]；熒光探針標(biāo)記法利用熒光探針對(duì)多糖底物進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)測(cè)定熒光值表征LPMOs 活性[32]。以上方法雖存在一定的局限性，但都有其適用范圍，而各方法的有機(jī)結(jié)合可為L(zhǎng)PMOs 的新酶開(kāi)發(fā)、催化機(jī)制研究及酶工程中突變體的快速篩選等提供有力的技術(shù)支撐，從而實(shí)現(xiàn)LPMOs 在工業(yè)化生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

有關(guān)LPMOs 活性檢測(cè)的綜述報(bào)道有許多[3-4,33]，但重點(diǎn)集中在LPMOs 結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制、家族分類(lèi)和底物特異性等方面的總結(jié)與評(píng)述，對(duì)檢測(cè)方法的論述較少。本文評(píng)述了近5 年LPMOs 活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，重點(diǎn)對(duì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、比色法和熒光探針標(biāo)記法等的基本原理及其在LPMOs 活性檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了梳理，總結(jié)了LPMOs 活性檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)LPMOs氧化產(chǎn)物

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是基于樣品的保留時(shí)間、碎片離子和峰面積分析其種類(lèi)并計(jì)算含量，從而達(dá)到測(cè)定酶活力的目的[34]。不同催化活性的LPMOs 借助O2（或H2O2）和電子，從多糖鏈C1 或C4 位置獲取氫原子使之羥基化，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂和多糖鏈端氧化[23,35]，產(chǎn)生不同類(lèi)型的氧化產(chǎn)物。如具有纖維素活性的LPMOs 可以催化C1 或C4 位，也可以同時(shí)氧化二者[32,36]產(chǎn)生C1 位的醛糖酸和C4 位的4-醛基酮糖[3,10,22]，幾丁質(zhì)活性的LPMOs 氧化C1 位生成醛糖酸內(nèi)酯，并水合形成醛糖酸[10,36-37]（圖1）。對(duì)不同類(lèi)型的產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別和量化所用的色譜-質(zhì)譜法不同。目前，常用于檢測(cè)LPMOs 活性的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法主要包括高效陰離子交換色譜-脈沖電流檢測(cè)法（High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）、親水作用液相色譜-質(zhì)譜法（Hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）、多孔石墨化碳色譜-質(zhì)譜法（Porous graphitized carbon chromatography-mass spectrometry，PGC-MS）和超高效液相色譜-質(zhì)譜法（Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS）等，各檢測(cè)方法可測(cè)定產(chǎn)物的分子量范圍及優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在LPMOs活性檢測(cè)中的應(yīng)用Table1 Application of chromatography-mass spectrometry in detection of LPMOs activities

圖1 裂解多糖單加氧酶（LPMOs）氧化裂解纖維素和幾丁質(zhì)的機(jī)理及其產(chǎn)物的形成：（A）LPMOs 催化機(jī)理[30]; （B）纖維素氧化裂解產(chǎn)物[32]; （C）幾丁質(zhì)氧化裂解產(chǎn)物[10,37]Fig.1 Mechanism of oxidative cracking of cellulose and chitin by lytic polysaccharide monooxygenases(LPMOs) and the products: (A) Catalytic mechanism of LPMOs[30]; (B) Products of cellulose oxidated[32];(C) Products of chitin oxidated[10,37]

1.1 HPAEC-PAD方法

HPAEC 主要用于纖維素氧化產(chǎn)物糖醛酸的分析[10,29]，其中，在檢測(cè)低聚合度產(chǎn)物時(shí)PAD 的靈敏度高于CAD[29]。通過(guò)HPAEC-PAD 分離纖維素降解產(chǎn)物，最先被分離出的是非氧化產(chǎn)物，其次是C1 和C4 氧化產(chǎn)物，最后是C1/C4 雙氧化產(chǎn)物[46]（圖2）。在堿性條件下，C1 氧化產(chǎn)物因帶負(fù)電而被分離和檢測(cè)[40]。Westereng 等[40]通過(guò)HPAEC-PAD 耦合ESI-MS 檢測(cè)了ScLPMO10C 的C1 氧化產(chǎn)物，由于C4 氧化產(chǎn)物在堿性條件下易發(fā)生化學(xué)修飾和互變異構(gòu)[23,47]，使質(zhì)譜無(wú)法檢測(cè)到相應(yīng)的分子質(zhì)量。在可溶性產(chǎn)物的檢測(cè)中，HPAEC-PAD 測(cè)定氧化寡糖的檢出限（Limit of detection，LOD）可達(dá)0.09～0.40 ng/injection，寡糖的LOD 值為0.34～0.66 ng/injection[29]。因檢測(cè)不溶性產(chǎn)物存在局限性，使測(cè)得的LPMOs 整體活性低于真實(shí)值[3]。Cannella 等[48]通過(guò)水解酶處理LPMOs 催化反應(yīng)后的產(chǎn)物，測(cè)定葡萄糖和葡糖酸的含量，并計(jì)算被氧化纖維素的總量，間接測(cè)定不溶性產(chǎn)物的含量。Frommhagen 等[24]采用相同的方法測(cè)定不溶物含量，得出在反應(yīng)初期不溶性物所含的氧化寡糖的量高于可溶性部分。然而，通過(guò)此方式水解不溶性產(chǎn)物再進(jìn)行分析時(shí)，耗時(shí)較長(zhǎng)且標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得，影響LPMOs 活性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，該方法僅限于可溶性產(chǎn)物的分析。

圖2 不同來(lái)源的LPMOs 作用于纖維素的氧化裂解產(chǎn)物[46]Fig.2 Oxidative cracking products of cellulose by LPMOs from different sources[46]

1.2 HILIC-MS方法

HILIC 常作為中性寡糖的分析方法，如幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物[29,49]。Vaaje-Kolstad 等[10]通過(guò)HILIC 和MALDI-TOF-MS 聯(lián)用分析了源于粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）的CBP21 催化幾丁質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物殼寡糖，并解析了CBP21 的催化機(jī)理。依據(jù)殼寡糖與幾丁-醛酸pH 值的不同，前者在中性流動(dòng)相（乙腈-水）中保持穩(wěn)定，后者因帶電荷，可通過(guò)增加離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)洗脫液的pH 值實(shí)現(xiàn)殼寡糖和幾丁-醛酸的分離[50]。Westereng 等[29]通過(guò)堿性條件電離醛酸以及高強(qiáng)度離子洗脫液平衡電荷消除互斥效應(yīng)，并在70%乙腈條件下，用HILIC 法檢測(cè)氧化寡糖的LOD 值范圍為33～113 ng/injection。由于PAD 的準(zhǔn)確性易受乙腈影響，因此CAD 常與HILIC-MS 結(jié)合檢測(cè)。然而，該方法在分析聚合度大于4 的寡糖和氧化寡糖時(shí)，其解析效果較差[29]，可通過(guò)升高柱溫來(lái)提高HILIC 色譜的分離效果以及改善峰形，并且能防止寡糖發(fā)生異構(gòu)分離現(xiàn)象。

1.3 PGC-MS方法

鑒于上述C4 氧化產(chǎn)物檢測(cè)的局限性，Westereng 等[40]結(jié)合HILIC（WAX 柱）和PGC 分離出C1 和C4氧化產(chǎn)物，根據(jù)樣品的極性特征，利用石墨色譜柱實(shí)現(xiàn)了纖維寡糖和氧化寡糖的分離[51]。因醛糖酸和非氧化產(chǎn)物的電離常數(shù)（pKa）值不同，在PGC 色譜分離過(guò)程中，弱堿性條件（pH 8）的流動(dòng)相使醛糖酸帶負(fù)電（纖維二糖酸pKa=3.51[40]和D-葡萄糖酸pKa=3.7）[3,29]?；诖耍琖estereng 等[29]成功獲得了醛糖酸的分離條件以及相同聚合度的裂解產(chǎn)物的分離，如4-乙二醇醛糖和醛糖酸。對(duì)有相同保留時(shí)間的非氧化產(chǎn)物、C4 纖維糊精或醛酸及雙氧化產(chǎn)物，可通過(guò)質(zhì)譜分析或者β-葡萄糖苷酶水解產(chǎn)物再次檢測(cè)[40]。PGC-MS 和CAD 可直接兼容，并在低離子濃度的洗脫液下對(duì)C4-纖維寡糖進(jìn)行定量分析，其LOD 可低至45～66 ng/injection，滿(mǎn)足動(dòng)力學(xué)研究的要求[40]。然而，該方法存在一定的局限性，由于PGC 固定相對(duì)長(zhǎng)鏈寡糖有強(qiáng)親和力，即使在高洗脫強(qiáng)度下，聚合度＞5 的中性纖維低聚糖也不能被洗脫[29]，因此PGC 色譜只能分析聚合度≤5 的寡糖。

1.4 UHPLC-MS方法

Silva 等[31]將UHPLC（HILIC 柱）與ESI-MS 聯(lián)用檢測(cè)聚合度為1～5 的寡糖，結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）進(jìn)一步分析了聚合度在3～10 之間的寡糖[42]，獲得了完整的產(chǎn)物譜。然而，在質(zhì)譜分析中，LPMOs 反應(yīng)產(chǎn)物中氧化寡糖和寡糖的質(zhì)量差為m/z16，與鈉和鉀加合物的質(zhì)量差一致，而鈉和鉀加合物在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下存在，從而在質(zhì)譜分析中會(huì)產(chǎn)生m/z值重疊，而MALDI-TOF MS 的分辨率可達(dá)40000，可以區(qū)分具有重疊m/z值的化合物[50]。因此，MALDI-TOF MS 常作為一種定性評(píng)估LPMOs 氧化產(chǎn)物的分析方法[10,21,38,42-45,50]，目前已成功分析了具有幾丁質(zhì)活性[10,52-53]、半纖維素活性[25,54]和淀粉活性[26]的LPMOs。此外，MALDI-TOF 還可以間接評(píng)估LPMOs 的底物特異性。Jensen 等[37]在探究底物特異性時(shí)將具有幾丁質(zhì)活性的ScLPMO10C 突變?yōu)榫哂欣w維素活性的LPMOs，借助UHPLC 和MALDI-TOF MS 測(cè)定了可溶性殼寡糖的含量，以表征ScLPMO10C 突變前后的氧化活性。

1.5 RP-UHPLC-MS方法

RP-UHPLC 分析LPMOs 氧化產(chǎn)物的應(yīng)用較少。Frommhagen 等[41]利用還原性的標(biāo)記物2-氨基苯甲酰胺（2-AB）與C4 氧化寡糖標(biāo)記，結(jié)合RP-UHPLC 成功分離了C4 寡糖。然而，寡糖的還原端與熒光團(tuán)-胺復(fù)合物反應(yīng)過(guò)程中形成的中間體不穩(wěn)定，因此Frommhagen 等[41]在不添加強(qiáng)還原劑的情況下，采用非緩沖洗脫液成功鑒定了寡糖和C4 氧化寡糖。該方法補(bǔ)充了C4 氧化產(chǎn)物的分析方法，相對(duì)于PGC 方法，其優(yōu)點(diǎn)是改進(jìn)了對(duì)纖維寡糖和C4 氧化寡糖的分析和鑒定[3]，并因使用了非緩沖洗脫液，對(duì)質(zhì)譜靈敏度的影響較小。

在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中，HPAEC-PAD 是LPMOs 活性檢測(cè)方法中靈敏度最高的方法，可以分析聚合度較高的氧化產(chǎn)物，但不能與質(zhì)譜法直接兼容。與HPAEC-PAD 相比，HILIC 和PGC-LC 可與質(zhì)譜法直接兼容從而實(shí)現(xiàn)高靈敏度分析?？梢岳肏PAEC-PAD 結(jié)合ESI-MS 分析C1 氧化產(chǎn)物[10,29]以及PGC 和CAD分離解析C4 氧化產(chǎn)物[40]，兩者結(jié)合可以獲得纖維素產(chǎn)物譜信息。幾丁質(zhì)氧化產(chǎn)物常以HILIC 結(jié)合MALDI-TOF MS 進(jìn)行分析，從而表征LPMOs 活性[42]。在新酶挖掘及酶學(xué)特性的研究中，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法仍是可靠的分析方法。

2 基于比色法的LPMOs活性的快速測(cè)定

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖具有高靈敏度的特點(diǎn)，但其儀器設(shè)備昂貴，使用范圍受限。因此，開(kāi)發(fā)快速、簡(jiǎn)便的LPMOs 活性檢測(cè)方法引起了更多的關(guān)注。隨著LPMOs 研究的不斷深入，建立靈敏、快速的酶活檢測(cè)方法在LPMOs 的工程化改造過(guò)程中具有重要意義。因此，基于LPMOs 催化反應(yīng)特性的比色法得到了快速發(fā)展，傳統(tǒng)的二硝基水楊酸法、高靈敏度的比色法如鎳/鄰苯二酚紫分析法、D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯分析法以及基于H2O2產(chǎn)量的比色法等，被用于快速穩(wěn)定地檢測(cè)LPMOs 活性。本節(jié)以氧化產(chǎn)物的類(lèi)型為主線(xiàn)，結(jié)合方法應(yīng)用和LPMOs 活性檢測(cè)的時(shí)間先后順序，分別基于生成的還原糖產(chǎn)物、C1 氧化產(chǎn)物以及H2O2等對(duì)基于比色法的LPMOs 活性檢測(cè)方法進(jìn)行闡述。

2.1 二硝基水楊酸法

二硝基水楊酸法（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）最初用于測(cè)定還原糖，通過(guò)還原糖與二硝基水楊酸在堿性條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并在540 nm 處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度確定還原糖的含量[55]。該方法早期用于LPMOs 的活性測(cè)定，通過(guò)比較單一水解酶活性和經(jīng)LPMOs 協(xié)同作用的酶活性的差值判定LPMOs 活性。Kim 等[56]結(jié)合高效液相色譜法和DNS 法測(cè)定了葡萄糖和纖維二糖的含量，從而表征了CgAA9 和纖維素酶的協(xié)同作用。該方法操作簡(jiǎn)單，但表征LPMOs 活性的靈敏度較低。Deshavath 等[55]發(fā)現(xiàn)在呋喃糖存在的條件下，測(cè)得的還原糖含量遠(yuǎn)高于實(shí)際值，并且未檢測(cè)到非還原性寡糖。因此，該方法適用于探究LPMOs 的協(xié)同作用，而局限于混合產(chǎn)物中單糖的定量分析。

2.2 鎳/鄰苯二酚紫分析法

Wang 等[57]基于丙烯酸定量檢測(cè)法開(kāi)發(fā)了鎳/鄰苯二酚紫分析法用于LPMOs 活性檢測(cè)。該方法結(jié)合C1 氧化產(chǎn)物醛糖酸呈負(fù)電荷的特點(diǎn)，并基于鄰苯二酚紫（Pyrocatechol violet，PV）與金屬陽(yáng)離子如Cu2+和Ni2+等螯合形成金屬離子-PV 復(fù)合物在特定波長(zhǎng)下有特征吸收，通過(guò)測(cè)定Ni2+-PV 在650 nm 處的吸光值，達(dá)到快速測(cè)定LPMOs 活性的目的。該方法還可根據(jù)離子吸附/解吸附原理，收集產(chǎn)物與Ni2+共孵育并加入PV，測(cè)定上清液中游離的Ni2+含量，從而計(jì)算多糖表面產(chǎn)生羧酸根的量。Ni 等[58]應(yīng)用Ni2+-PV 法檢測(cè)PcLPMO9D 酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度的LPMOs 對(duì)纖維素酶有影響。然而，該方法也存在局限性，在檢測(cè)羧酸根含量時(shí)，Ni2+-羧酸不遵循1∶2 的比例結(jié)合[57]，從而不能精準(zhǔn)定量檢測(cè)醛糖酸。因此，該方法適用于不同家族中LPMOs 活性的比較，以及LPMO 底物特異性的研究。

2.3 D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯分析法

鑒于LPMOs 催化反應(yīng)底物形式的單一性，Keller 等[59]開(kāi)發(fā)了一種快速測(cè)定微晶纖維素和預(yù)處理麥秸中葡萄糖酸的方法。利用糖苷水解酶處理TtLPMO9E 酶解產(chǎn)物，通過(guò)D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯分析試劑盒（D-Gluconic acid/D-Glucono-δ-lactone assay）測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖酸。利用葡萄糖酸激酶、NADP 和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶催化將葡萄糖酸轉(zhuǎn)化為核酮糖-5-磷酸和NADPH，通過(guò)測(cè)定NADPH 在340 nm 處的吸光值測(cè)定LPMOs 活性。該方法測(cè)定葡萄糖酸的LOD 值可低至0.27 mg/L，與HPAEC-PAD相比，其靈敏度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)LPMOs 反應(yīng)產(chǎn)物的定量分析[3,59]。然而，該方法在更改條件時(shí)需進(jìn)行校準(zhǔn)，以排除潛在的干擾。

2.4 基于H2O2的量間接檢測(cè)LPMOs活性

上述檢測(cè)方法均需借助氧化產(chǎn)物對(duì)LPMOs 活性進(jìn)行定量分析，而根據(jù)LPMOs 的催化機(jī)理[2]，還可通過(guò)H2O2的量表征其活性。LPMOs 活性中心的Cu（Ⅱ）被還原成Cu（Ⅰ），與O2結(jié)合形成活化的銅-氧復(fù)合物，使底物被氧化，進(jìn)而使糖苷鍵斷裂[10,60]，產(chǎn)生氧化產(chǎn)物和水（圖3-b）。研究表明，H2O2也作為L(zhǎng)PMOs 的動(dòng)力學(xué)相關(guān)共底物[61]，即Cu（Ⅰ）從底物中獲取氫原子并使之羥基化[61-62]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)糖苷鍵斷裂（圖3-c）。圖3 中b 和c 兩種催化反應(yīng)途徑是以多糖為底物，其產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物通過(guò)上述方法可以進(jìn)行檢測(cè)[10,61]；圖3 中的途徑a 是在沒(méi)有多糖底物的條件下，Cu（Ⅰ）與O2反應(yīng)產(chǎn)生H2O2[2]。目前，通過(guò)測(cè)定H2O2的量表征LPMOs 活性的方法有傳統(tǒng)的Amplex red 過(guò)氧化物酶偶聯(lián)分析法、靈敏的2,6-二甲基苯酚比色法和準(zhǔn)確度較高的還原酚酞分析法。

圖3 LPMOs 的催化機(jī)理：（a） 沒(méi)有底物的催化反應(yīng)[2]; （b） O2 為共底物[10]; （c） H2O2 為共底物[61]Fig.3 Catalytic mechanism of LPMOs:(a)No substrate [2]; (b)O2 as co-substrate[10]; (c)H2O2 as co-substrate[61]

2.4.1 Amplex red過(guò)氧化物酶偶聯(lián)分析法

Amplex red 過(guò)氧化物酶偶聯(lián)分析法是經(jīng)典的測(cè)定過(guò)氧化物及H2O2的分析方法，在過(guò)氧化物酶（HRP）催化下，H2O2與Amplex red 按1∶1 的比例生成紅色高熒光的試鹵靈（Resorufin）（圖4）[63]。通過(guò)分光光度法（ε571=58000 L/（mol·cm）或熒光法（λEx/Em=569/585 nm）測(cè)定其熒光強(qiáng)度[63]，間接測(cè)定LPMOs 活性。該方法操作快速，已被廣泛用于LPMOs 活性評(píng)估和高通量篩選[64]。Mutahir 等[42]利用該方法通過(guò)檢測(cè)H2O2的產(chǎn)率表征了LPMOs 活性。Limsakul 等[28]通過(guò)Amplex?Red 過(guò)氧化氫/過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定了LPMOs 活性，H2O2的濃度在0.1～2 μmol/L 范圍內(nèi)與熒光信號(hào)響應(yīng)呈線(xiàn)性關(guān)系，并且當(dāng)LPMOs濃度為5 μmol/L 時(shí)，曲線(xiàn)擬合較好（R2=0.99）[63]。然而，該方法只能精準(zhǔn)測(cè)定濃度在20～574 mg/L 范圍內(nèi)的LPMOs[65]，并且其檢測(cè)環(huán)境需要避免金屬離子的干擾，如游離Cu2+的存在可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[54]。

圖4 Amplex red 過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法的原理[63]Fig.4 Principle of Amplex red peroxidase-coupled assay[63]

2.4.2 2,6-二甲基苯酚比色法

Breslmayer 等[65,66]開(kāi)發(fā)了2,6-二甲基苯酚（2,6-Dimethoxyphenol，2,6-DMP）比色法，并用于快速評(píng)估LPMOs 活性。LPMOs 將兩分子的2,6-DMP 氧化為兩分子的2,6-DMP 自由基，因自由基不穩(wěn)定而自發(fā)聚合成氫化木酚酮（Hydrocoerulignone），最后經(jīng)LPMOs 氧化形成顯色產(chǎn)物木質(zhì)素（Coerulignone），根據(jù)木質(zhì)素在469 nm 處的特征吸收峰表征LPMOs 活性（圖5）[65]。該方法快速、簡(jiǎn)便，已被用于裂解纖維素和幾丁質(zhì)的LPMOs 活性測(cè)定，以及LPMOs 表達(dá)和純化過(guò)程中結(jié)合常數(shù)或熱穩(wěn)定性的測(cè)定[34,67-69]。2,6-DMP比色法定量LPMOs 的濃度可達(dá)0.5～50 mg/L[65]，與Amplex red 過(guò)氧化物酶偶聯(lián)分析法相比，其靈敏度更高。然而，在酸性緩沖液中，該方法的靈敏度受限。因此，Breslmayr 等[66]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，以氫化木酚酮為底物測(cè)定LPMOs 活性。改進(jìn)后的方法適用于pH 4～8 的緩沖液環(huán)境，并且可以進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

圖5 2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）比色法的原理[65]Fig.5 Principle of 2,6-dimethoxyphenol (2,6-DMP) assay[65]

2.4.3 還原酚酞分析法

Brander 等[70]基于Kastle-Meyer 實(shí)驗(yàn)原理開(kāi)發(fā)了還原酚酞分析法，并用于LPMOs 活性的快速檢測(cè)。以H2O2為共底物，通過(guò)LPMOs 氧化將無(wú)色的還原酚酞（Reduced phenolphthalein，rPHP）氧化成生酚酞（PHP）（圖6），通過(guò)測(cè)定PHP 在552 nm 處的吸光值間接測(cè)定LPMOs 的活性，以TaAA9A 為例，其活性檢測(cè)的LOD 低至15 nmol/L[70]。Brander 等[70]還發(fā)現(xiàn)，以脫氫抗壞血酸（DHA）為還原劑時(shí)，PHP 更容易定量。然而，抗壞血酸作為還原劑時(shí)不能促進(jìn)rPHP 氧化，反而會(huì)引起反應(yīng)中酶的降解。因此，該分析方法僅限于DHA 的反應(yīng)中LPMOs 活性評(píng)估[70]。與上述兩種比色法相比，該方法因rPHP 的高穩(wěn)定性和耐受性使得LPMOs 活性測(cè)定更準(zhǔn)確。

圖6 還原酚酞分析法的原理[70]Fig.6 Principle of reduced phenolphtalein assay[70]

2.5 偶氮木葡聚糖分析

偶氮木葡聚糖分析法（Azo-Xyloglucan Assay）最初應(yīng)用于纖維素酶中內(nèi)切葡聚糖酶[71]的活性檢測(cè)及木聚糖特異性評(píng)估[72]。將可溶性顯色底物偶氮木聚糖與染料雷馬氏亮藍(lán)（Remazol brilliant blue R，RBBR）混合，利用纖維素酶水解產(chǎn)生染色寡糖，測(cè)定染色寡糖在590 nm 處的吸光值表征內(nèi)切葡聚糖酶的酶活性[72]?；诖耍珻alderaro 等[3]利用LPMOs 反應(yīng)中還原劑的作用，通過(guò)測(cè)定還原劑添加前后上清液顏色變化定量分析LPMOs 的活性。該方法由于缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，尚無(wú)法評(píng)估其優(yōu)缺點(diǎn)，因此還未得到廣泛應(yīng)用。

上述比色法均可表征LPMOs 活性，各種比色法靈敏度雖有差異，但在相應(yīng)的應(yīng)用范圍中能夠?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)測(cè)定。如DNS 法的靈敏度雖低但可粗略計(jì)算酶活性，廣泛用于LPMOs 與水解酶協(xié)同作用的活性檢測(cè)，鎳/鄰苯二酚紫分析法及D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯分析法與之相比靈敏度有所提升。在H2O2分析方法中，以Amplex red 過(guò)氧化物酶偶聯(lián)分析法應(yīng)用范圍最廣，而2,6-DMP 比色法靈敏度較高。在酶工程改造研究中，比色法可為突變體快速且穩(wěn)定的篩選提供技術(shù)支撐。

3 基于熒光探針標(biāo)記的LPMOs活性檢測(cè)

除上述色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和比色法之外，還有特異性強(qiáng)的熒光探針標(biāo)記法，通過(guò)測(cè)定熒光值表征LPMOs 活性，目前用于LPMOs 活性測(cè)定的探針標(biāo)記主要有以下3 種。

3.1 SYTO-62探針標(biāo)記

SYTO-62 探針標(biāo)記法最初是測(cè)定聚合物表面的羧基， 經(jīng)Eibinger 等[12]調(diào)整改造后， 用熒光探針SYTO-62 標(biāo)記纖維素后與LPMOs 共孵育，借助激光共聚焦顯微鏡連續(xù)監(jiān)測(cè)纖維素結(jié)晶區(qū)域表面的氧化位點(diǎn)， 確定反應(yīng)產(chǎn)生羧基的量表征LPMOs 活性， 最后證明源于粗糙脈孢菌Neurospora crassa的NcLPMO9F 在催化纖維素裂解時(shí)產(chǎn)生了多個(gè)氧化位點(diǎn)。

3.2 EDAC熒光標(biāo)記

EDAC 熒光標(biāo)記是基于1-乙基-3-[3-（二甲氨基）丙基]碳二亞胺（EDAC）將醛酸活化，再由胺基熒光團(tuán)7-氨基-1,3-萘二磺酸（ANDA）胺化，形成的共軛產(chǎn)物在450 nm 處具有熒光吸收[73]。Vuong 等[32]通過(guò)將水溶性熒光團(tuán)共價(jià)連接到纖維素氧化部位，再與LPMOs 共孵育，測(cè)定熒光吸收值反映PcLPMO9D 活性。該方法常用于評(píng)估C1 位氧化LPMOs 活性，并與HPAEC 色譜法結(jié)合可以獲得有關(guān)LPMOs 氧化產(chǎn)物的更詳細(xì)信息。

3.3 ANTS熒光標(biāo)記

ANTS 熒光標(biāo)記法是一種基于熒光團(tuán)8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）將反應(yīng)產(chǎn)物胺化而產(chǎn)生還原端，再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得多糖結(jié)構(gòu)的分析方法，即碳水化合物凝膠電泳（PACE）分析法。該方法通過(guò)測(cè)定探針標(biāo)記氧化產(chǎn)物的熒光值表征LPMOs 活性，如Quinlan 等[21]利用ANTS 熒光標(biāo)記并結(jié)合MALDI-TOF-MS 分析了源于Thermoascus aurantiacus的TaGH61A 降解纖維素產(chǎn)物，并比較Cu2+對(duì)TaGH61A 催化活性的影響。Frandsen 等[74]應(yīng)用該方法測(cè)定了源于Lentinus similis的氧化產(chǎn)物纖維二糖和纖維三糖，表征了LsLPMO9 活性，并測(cè)定了酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

4 其它方法

除此之外，結(jié)合LPMOs 催化反應(yīng)中電子受體如氧氣的消耗量、電子供體如抗壞血酸的消耗量均可以間接測(cè)定LPMOs 的催化活性。Gusakov 等[75]基于耗氧率測(cè)量的方法，使用帶有高靈敏度熒光傳感器的Seahorse XFp 分析儀，監(jiān)測(cè)了3 種真菌LPMOs 對(duì)無(wú)定形區(qū)域纖維素的氧化活性。Yu 等[76]利用LPMOs外部電子供體的抗壞血酸的消耗量表征源于Bacillus atrophaeus的BatLPMO10 的活性。此外，根據(jù)磷酸溶脹纖維素（PASC）不透明的特征，LPMOs 裂解氧化PASC 使之溶解，通過(guò)檢測(cè)其光密度變化表征LPMOs 活性，Hansson 等[77]利用該特性測(cè)定HjLPMO9A 與之突變體氧化裂解纖維素活性，得出HjLPMO9A 突變體對(duì)纖維素裂解活性下降50%。

5 結(jié)論與展望

LPMOs 氧化裂解產(chǎn)物的組成各異，針對(duì)可溶性產(chǎn)物，色譜-質(zhì)譜法及比色法均可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)測(cè)定，但在分析不溶性產(chǎn)物時(shí)存在局限性。熒光標(biāo)記法更適于不溶性產(chǎn)物的分析，從而可以實(shí)現(xiàn)LPMO 整體活性的檢測(cè)。隨著LPMOs 研究的不斷深入，自然界中越來(lái)越多的LPMOs 被發(fā)現(xiàn)，因此需要發(fā)展精確且快速的酶活性測(cè)定方法，為其酶學(xué)特性的研究提供關(guān)鍵支持。隨著計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)的高速發(fā)展，蛋白質(zhì)工程對(duì)LPMOs 的改造將成為研究熱點(diǎn)，高通量的LPMOs 活性篩選方法不但可以加速突變體篩選效率，也為L(zhǎng)PMOs 的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，LPMOs 酶活性的測(cè)定方法需要不斷地開(kāi)發(fā)和創(chuàng)新，以期研發(fā)適用性更廣、操作更快速、精度更高的檢測(cè)方法，為解決當(dāng)前方法的局限性提供新思路和新途徑。