液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定洋蔥中槲皮素含量

◎ 黃彩鳳，王雙婁

（百色市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 百色 533000）

洋蔥是大眾餐桌的飲食?？?。研究表明，洋蔥的活性成分槲皮素具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎等功效，可以清除自由基、殺滅細(xì)菌，還能調(diào)節(jié)自噬改善阿爾茨海默病[1-4]。洋蔥的產(chǎn)地不同，槲皮素含量也不同。

目前對(duì)槲皮素的提取方法主要有超聲提取法、回流提取法、微波提取法等，含量測(cè)定方法有紫外分光光度法、液相色譜法[5-8]、毛細(xì)管電泳法等，其中運(yùn)用最多的分析方法為高效液相色譜二極管陣列法。由于洋蔥本身所含物質(zhì)比較復(fù)雜，在分析過(guò)程中容易受到其他成分干擾?；诖?，本文運(yùn)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的高分辨功能快速篩查目標(biāo)峰，簡(jiǎn)化提取方法，具有操作便捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

WatersTQD 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀；MeTTLER TOLEDO XS205DU 電子分析天平；SHIMADZU TXB622L 電子天平；heidolph 自動(dòng)渦旋混合器；thermo scientific 冷凍高速離心機(jī)；KUDOS 超聲儀；甲醇（色譜純）；乙醇（色譜純）；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量：98.6%；批號(hào)：100081-201509；廠家：中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.2 儀器條件

（1）色譜條件。Waters XBridge BEH C18色譜柱（2.5 μm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：0.1%甲酸-甲醇（35 ∶65，V∶V）；等度洗脫；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

（2）質(zhì)譜條件。離子化方式：電噴霧離子化（ESI），正離子模式；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：350 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；定量方式：外標(biāo)法；本實(shí)驗(yàn)選取質(zhì)荷比302.84 為母離子，153.018 為定量離子，228.94 為定性離子。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備及保存

取新鮮紅洋蔥樣品2 kg 切碎，用高速破壁機(jī)打碎混勻，置于-18 ℃條件下保存。

1.3.2 試樣前處理

稱取樣品1.0 g（精確至0.001 g）于50 mL 具塞離心管中，準(zhǔn)確加入40 mL 95%乙醇，渦旋振蕩5 min，于60 ℃下超聲120 min，再以8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm 尼龍濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.45 mg 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.030 mg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0 ～4 ℃冰箱中保存。

準(zhǔn)確吸取0.50 mL 1.030 mg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成5.15 μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)中間液。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)中間液置于10 mL 容量瓶中，定容至刻度，配制成10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1、200 ng·mL-1和250 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 提取條件的考察

（1）提取溶劑的考察。槲皮素微溶于冷乙醇，易溶于熱乙醇，可溶的有機(jī)試劑有甲醇、乙酸乙酯、吡啶和丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿和石油醚等，堿性水溶液呈黃色，幾乎不溶于水，因此本實(shí)驗(yàn)考察了100%甲醇、90%甲醇、70%甲醇、60%乙醇、95%乙醇和100%乙醇共6 種提取溶劑的提取效果。分別稱取6 份1.00 g 的紅洋蔥，分別置于50 mL 聚乙烯離心管中，分別加入40 mL 以上6 種溶劑，渦旋混勻，在常溫以及超聲時(shí)間為90 min 的條件下超聲，超聲過(guò)后取出樣品，于40 000 r·min-1離心6 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

（2）提取溫度的考察。準(zhǔn)確稱取1.00 g 紅洋蔥樣品，加入95%乙醇40 mL，渦旋混勻，分別在溫度為60 ℃、90 ℃，超聲時(shí)間為90 min 的條件下超聲，超聲后取出樣品，于40 000 r·min-1離心6 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

（3）超聲時(shí)間的考察。準(zhǔn)確稱取1.00 g 紅洋蔥樣品，加入95%乙醇40 mL 作為提取溶劑，渦旋混勻，在60 ℃以及超聲時(shí)間為90 min、120 min 的條件下超聲，超聲后取出樣品，于40 000 r·min-1離心6 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素母離子的確證

槲皮素的分子量為302，在正離子模式下對(duì)所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜全掃描，優(yōu)化后得到母離子為302.84，碎片離子153.018 響應(yīng)值最高，因此作為本實(shí)驗(yàn)定量離子。此外，選取228.94 作為定性離子，保留時(shí)間為3.14 min。詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品譜圖

圖2 洋蔥樣品譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

如圖3 所示，在其他提取條件均相同的情況下，使用95%乙醇作為提取劑時(shí)，紅洋蔥中槲皮素的提取率最高，因此本文選擇95%乙醇作為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)比圖

2.3 提取溫度的選擇

由圖4 可知，在提取溶劑為95%乙醇、超聲時(shí)間為90 min 的條件下，超聲溫度為60 ℃時(shí)槲皮素的提取率高于常溫狀態(tài)下的提取率，因此本文選擇提取溫度為60 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)比圖

2.4 超聲時(shí)間的選擇

如圖5 所示，在提取溶劑為95%乙醇、超聲溫度為60 ℃的條件下，超聲時(shí)間為120 min 時(shí)槲皮素的提取率較高，因此本文選擇樣品超聲時(shí)間為120 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)比圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按1.3.3 方法配制，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，線性方程為Y=7.357 8X+84.344 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3，槲皮素在10 ～250 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液放置6 h、12 h、24 h、48 h后進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)樣品的質(zhì)量濃度無(wú)明顯差異，精密度為0.5%，表明槲皮素在95%乙醇溶液中的穩(wěn)定性良好，此方法可行。

2.7 加標(biāo)回收率和精密度

用已知槲皮素濃度的洋蔥進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加量分別為2.0 μg、6.0 μg、8.0 μg，每個(gè)添加水平重復(fù)3 次，按照樣品分析方法進(jìn)行回收試驗(yàn)。由表1 可知，平均回收率為92.0%～102.3%，RSD 為0.8%～3.1%。結(jié)果表明，此檢驗(yàn)方法回收效果好，精密度高。

表1 槲皮素的回收率和精密度表（n=3）

2.8 檢出限及定量限

本文以樣品響應(yīng)值為3 倍信噪比的添加濃度為方法檢出限，以10 倍信噪比的添加濃度為方法定量限。因洋蔥自身含有槲皮素，所以在確定檢出限及定量限的樣品中，本實(shí)驗(yàn)選擇空白試劑代替洋蔥樣品。將標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白試劑中，按本實(shí)驗(yàn)的提取方法操作，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，得到方法檢出限為0.01 mg·kg-1，定量限為0.05 mg·kg-1。

2.9 洋蔥樣品測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)百色農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽取的50 份紅皮洋蔥進(jìn)行分析，結(jié)果均檢出槲皮素。洋蔥不同部位的槲皮素含量有較大差別，洋蔥表皮中槲皮素含量最高，為58.2 mg·kg-1；洋蔥中部槲皮素含量為29.8 mg·kg-1；洋蔥中心槲皮素含量較低，為15.4 mg·kg-1。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察洋蔥中槲皮素提取條件，得到最佳提取條件為提取溶劑95%乙醇、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間120 min，同時(shí)建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紅洋蔥中槲皮素的分析方法。結(jié)果表明，該方法前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性和靈敏度高，所使用提取溶劑安全且可直接購(gòu)買，適合紅洋蔥中槲皮素的日常檢測(cè)。