◎ 黃彩鳳,王雙婁
(百色市食品藥品檢驗(yàn)所,廣西 百色 533000)
洋蔥是大眾餐桌的飲食???。研究表明,洋蔥的活性成分槲皮素具有多種生物活性,如抗氧化、抗炎等功效,可以清除自由基、殺滅細(xì)菌,還能調(diào)節(jié)自噬改善阿爾茨海默病[1-4]。洋蔥的產(chǎn)地不同,槲皮素含量也不同。
目前對槲皮素的提取方法主要有超聲提取法、回流提取法、微波提取法等,含量測定方法有紫外分光光度法、液相色譜法[5-8]、毛細(xì)管電泳法等,其中運(yùn)用最多的分析方法為高效液相色譜二極管陣列法。由于洋蔥本身所含物質(zhì)比較復(fù)雜,在分析過程中容易受到其他成分干擾?;诖耍疚倪\(yùn)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的高分辨功能快速篩查目標(biāo)峰,簡化提取方法,具有操作便捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
WatersTQD 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀;MeTTLER TOLEDO XS205DU 電子分析天平;SHIMADZU TXB622L 電子天平;heidolph 自動渦旋混合器;thermo scientific 冷凍高速離心機(jī);KUDOS 超聲儀;甲醇(色譜純);乙醇(色譜純);槲皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(含量:98.6%;批號:100081-201509;廠家:中國食品藥品檢定研究院)。
(1)色譜條件。Waters XBridge BEH C18色譜柱(2.5 μm×100 mm,1.7 μm),流動相:0.1%甲酸-甲醇(35 ∶65,V∶V);等度洗脫;進(jìn)樣量:1 μL;流速:0.25 mL·min-1;柱溫:30 ℃。
(2)質(zhì)譜條件。離子化方式:電噴霧離子化(ESI),正離子模式;電噴霧電壓:5 500 V;離子源溫度:350 ℃;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM);定量方式:外標(biāo)法;本實(shí)驗(yàn)選取質(zhì)荷比302.84 為母離子,153.018 為定量離子,228.94 為定性離子。
1.3.1 樣品的制備及保存
取新鮮紅洋蔥樣品2 kg 切碎,用高速破壁機(jī)打碎混勻,置于-18 ℃條件下保存。
1.3.2 試樣前處理
稱取樣品1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL 具塞離心管中,準(zhǔn)確加入40 mL 95%乙醇,渦旋振蕩5 min,于60 ℃下超聲120 min,再以8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液過0.22 μm 尼龍濾膜后上機(jī)測定。
1.3.3 溶液配制
準(zhǔn)確稱取10.45 mg 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成1.030 mg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于0 ~4 ℃冰箱中保存。
準(zhǔn)確吸取0.50 mL 1.030 mg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成5.15 μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)中間液。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)中間液置于10 mL 容量瓶中,定容至刻度,配制成10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1、200 ng·mL-1和250 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.3.4 提取條件的考察
(1)提取溶劑的考察。槲皮素微溶于冷乙醇,易溶于熱乙醇,可溶的有機(jī)試劑有甲醇、乙酸乙酯、吡啶和丙酮等,不溶于水、苯、乙醚、氯仿和石油醚等,堿性水溶液呈黃色,幾乎不溶于水,因此本實(shí)驗(yàn)考察了100%甲醇、90%甲醇、70%甲醇、60%乙醇、95%乙醇和100%乙醇共6 種提取溶劑的提取效果。分別稱取6 份1.00 g 的紅洋蔥,分別置于50 mL 聚乙烯離心管中,分別加入40 mL 以上6 種溶劑,渦旋混勻,在常溫以及超聲時(shí)間為90 min 的條件下超聲,超聲過后取出樣品,于40 000 r·min-1離心6 min,取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。
(2)提取溫度的考察。準(zhǔn)確稱取1.00 g 紅洋蔥樣品,加入95%乙醇40 mL,渦旋混勻,分別在溫度為60 ℃、90 ℃,超聲時(shí)間為90 min 的條件下超聲,超聲后取出樣品,于40 000 r·min-1離心6 min,取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。
(3)超聲時(shí)間的考察。準(zhǔn)確稱取1.00 g 紅洋蔥樣品,加入95%乙醇40 mL 作為提取溶劑,渦旋混勻,在60 ℃以及超聲時(shí)間為90 min、120 min 的條件下超聲,超聲后取出樣品,于40 000 r·min-1離心6 min,取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。
槲皮素的分子量為302,在正離子模式下對所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜全掃描,優(yōu)化后得到母離子為302.84,碎片離子153.018 響應(yīng)值最高,因此作為本實(shí)驗(yàn)定量離子。此外,選取228.94 作為定性離子,保留時(shí)間為3.14 min。詳見圖1、圖2。
圖1 對照品譜圖
圖2 洋蔥樣品譜圖
如圖3 所示,在其他提取條件均相同的情況下,使用95%乙醇作為提取劑時(shí),紅洋蔥中槲皮素的提取率最高,因此本文選擇95%乙醇作為提取溶劑。
圖3 提取溶劑對比圖
由圖4 可知,在提取溶劑為95%乙醇、超聲時(shí)間為90 min 的條件下,超聲溫度為60 ℃時(shí)槲皮素的提取率高于常溫狀態(tài)下的提取率,因此本文選擇提取溫度為60 ℃。
圖4 超聲溫度對比圖
如圖5 所示,在提取溶劑為95%乙醇、超聲溫度為60 ℃的條件下,超聲時(shí)間為120 min 時(shí)槲皮素的提取率較高,因此本文選擇樣品超聲時(shí)間為120 min。
圖5 超聲時(shí)間對比圖
標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按1.3.3 方法配制,以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示,線性方程為Y=7.357 8X+84.344 7,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3,槲皮素在10 ~250 ng·mL-1線性關(guān)系良好。
圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液放置6 h、12 h、24 h、48 h后進(jìn)樣分析,發(fā)現(xiàn)樣品的質(zhì)量濃度無明顯差異,精密度為0.5%,表明槲皮素在95%乙醇溶液中的穩(wěn)定性良好,此方法可行。
用已知槲皮素濃度的洋蔥進(jìn)行3 個水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),添加量分別為2.0 μg、6.0 μg、8.0 μg,每個添加水平重復(fù)3 次,按照樣品分析方法進(jìn)行回收試驗(yàn)。由表1 可知,平均回收率為92.0%~102.3%,RSD 為0.8%~3.1%。結(jié)果表明,此檢驗(yàn)方法回收效果好,精密度高。
表1 槲皮素的回收率和精密度表(n=3)
本文以樣品響應(yīng)值為3 倍信噪比的添加濃度為方法檢出限,以10 倍信噪比的添加濃度為方法定量限。因洋蔥自身含有槲皮素,所以在確定檢出限及定量限的樣品中,本實(shí)驗(yàn)選擇空白試劑代替洋蔥樣品。將標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白試劑中,按本實(shí)驗(yàn)的提取方法操作,經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn),得到方法檢出限為0.01 mg·kg-1,定量限為0.05 mg·kg-1。
采用本實(shí)驗(yàn)方法對百色農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)抽取的50 份紅皮洋蔥進(jìn)行分析,結(jié)果均檢出槲皮素。洋蔥不同部位的槲皮素含量有較大差別,洋蔥表皮中槲皮素含量最高,為58.2 mg·kg-1;洋蔥中部槲皮素含量為29.8 mg·kg-1;洋蔥中心槲皮素含量較低,為15.4 mg·kg-1。
本實(shí)驗(yàn)通過考察洋蔥中槲皮素提取條件,得到最佳提取條件為提取溶劑95%乙醇、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間120 min,同時(shí)建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定紅洋蔥中槲皮素的分析方法。結(jié)果表明,該方法前處理簡單、準(zhǔn)確性和靈敏度高,所使用提取溶劑安全且可直接購買,適合紅洋蔥中槲皮素的日常檢測。