豬肉中磺胺類藥物的檢測

◎ 田 翠，張維娜，羅小嬌，鄭海芳，張 強，金 偉，劉 霜

（瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 瀘州 646000）

磺胺類藥物是具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物的總稱，其粉末一般為黃色或白色，基本無味?；前奉愃幬锟梢砸种萍毦纳L和繁殖，具有價格低、抗菌能力強、容易吸收等特點，被廣泛用于獸醫(yī)臨床和畜牧業(yè)，以預防和治療畜禽細菌性疾病，但磺胺類藥物的不合理使用、誤用，甚至濫用，導致細菌的耐藥性日益增強[1-6]。磺胺類藥物可以影響泌尿系統(tǒng)功能，甚至誘發(fā)癌變。磺胺類藥物代謝時間較長，一旦人們長期服用帶有磺胺類藥物殘留的食品，磺胺類藥物會在人體內(nèi)富集，富集濃度超過一定量對人體有害?！妒称钒踩珖覙藴?食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定磺胺類藥物及其殘留標志物之和不得超過100 μg·kg-1[7]。

目前，肌肉組織中磺胺類藥物的檢測方法很多，主要有毛細管電泳分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射性免疫法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-16]。本文提出了乙酸乙酯提取，0.1 mol·L-1的鹽酸溶液轉(zhuǎn)化溶劑，正己烷除脂肪，MCX 柱凈化，外標法定量，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉樣品中5 種磺胺類藥物的方法，其背景干擾少，靈敏度高，重復性好，能快速、高效、高分辨地定性、定量檢測，該方法適用于大批量的豬肉中磺胺類藥物的檢測，可為日常監(jiān)測和風險檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（Sulfamethazine，SM2）100 μg·mL-1、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）100 μg·mL-1、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ）100 μg·mL-1、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）100 μg·mL-1和磺胺喹惡啉（Sulfaquinoxaline，SQX）100 μg·mL-1；試劑用純凈水（屈臣氏純水）；乙酸乙酯、甲醇、正己烷、甲酸、乙腈均為色譜純；鹽酸、氨水為優(yōu)級純；0.1 mol·L-1鹽酸溶液（量取0.83 mL 濃鹽酸，倒入適量的純水中，加水稀釋至100 mL，搖勻）；洗脫液（量取5 mL 氨水，倒入適量的甲醇中，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻）；5%的甲醇溶液（取5 mL 甲醇，用水溶解后稀釋至100 mL，搖勻）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫6460）；渦旋振蕩器；高速離心機（冷凍）；MCX 柱60 mg/3 mL（島津）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮或解凍的豬肉若干小塊或全部樣品預處理，切碎、混勻，四分法縮分。取縮分樣品，充分勻漿，分別裝入潔凈塑料瓶中密封，標識。

1.3.2 測定步驟

（1）提取。稱取樣品（5.0±0.05）g 于50 mL 的離心管中，加入一顆陶瓷均質(zhì)子和20 mL 乙酸乙酯，劇烈振蕩2 min，5 000 r·min-1離心5 min（離心機溫度設置-2 ℃左右），用滴管將上清液吸取到50 mL的雞心瓶中，殘渣中加入20 mL 乙酸乙酯，按步驟重復提取1 次，2 次提取液合并后備用。

（2）凈化。將4 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液加到雞心瓶中，40 ℃旋蒸至溶液不分層（乙酸乙酯旋出，只剩鹽酸溶液），將殘留的溶液轉(zhuǎn)至50 mL 的離心管中，用2 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液洗滌雞心瓶2 次，將洗滌液轉(zhuǎn)移至同一個離心管中，再用5 mL 的正己烷洗滌雞心瓶，并轉(zhuǎn)移至含有鹽酸溶液的離心管中，渦旋振蕩1 min，5 000 r·min-1離心5 min（離心機溫度設置-2 ℃左右），用一次性滴管將正己烷吸出棄去。MCX 柱分別用2 mL 甲醇和2 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液活化，取備用液過柱，依次用1 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液和2 mL 甲醇淋洗，棄去流出液體，當MCX柱液面沒有液體時，加入6 mL 洗脫液，用10 mL 試管收集洗脫液。將洗脫液40 ℃氮氣吹至近干，加5%的甲醇溶液溶解殘渣，渦旋混勻，0.2 μm 濾膜過濾，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3 標準溶液的配制

（1）5 μg·mL-1磺胺類混合標準儲備液。分別準確吸取0.50 mL 的100 μg·mL-1的5 種磺胺標準品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度，配制成5 μg·mL-1的磺胺類混合標準儲備液，-20 ℃以下的冰箱中保存。

（2）1 μg·mL-1磺胺類混合標準工作液。準確吸取2.00 mL 的5 μg·mL-1磺胺儲備液于10 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度，配制成1 μg·mL-1的磺胺類混合標準工作液，-20 ℃以下的冰箱中保存。

（3）標準曲線制備。準確吸取1 μg·mL-1磺胺類混合標準工作液，用5%的甲醇溶液配制成10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的標準使用液，4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱為安捷倫C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為甲醇；柱溫35 ℃；進樣量2 μL；流速0.2 mL·min-1。色譜柱梯度淋洗條件見表1。

表1 梯度淋洗條件表

質(zhì)譜條件：離子源AJS ESI；正離子模式；多反應監(jiān)測；霧化器壓力45 psi；干燥氣溫度250 ℃；鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓4 000 V。定量定性離子、保留時間等參數(shù)見表2。

表2 磺胺類藥物的主要液質(zhì)參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇

目前，肌肉組織中磺胺類藥物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其中酶聯(lián)免疫吸附法重復性和穩(wěn)定性較差，易造成假陽性的誤判；《食品安全國家標準 動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法》（GB 29694—2013）中的高效液相色譜法檢出限高，根據(jù)保留時間定性，儀器不穩(wěn)定或有雜質(zhì)峰的影響，會出現(xiàn)誤判的情況，且為達到較好的分離效果一般選用C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），流動相梯度淋洗時間較長，不利于大批量樣品的上機處理；《畜禽肉中16 種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 20759—2006）采用乙腈提取，無水硫酸鈉吸水，雖然操作簡單，但是無水硫酸鈉吸水時，對磺胺類藥物也有一定的吸附作用，導致回收率降低，且沒有經(jīng)過固相萃取柱的凈化，會對液相色譜的管道和色譜柱造成污染，也會對質(zhì)譜的離子源造成污染；《動物源食品中磺胺類藥物殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1025 號公告—23—2008）中洗脫液有75%的水，低溫氮吹時很難吹干，高溫氮吹時磺胺類藥物易分解，導致回收率低和精密度差。本文用乙酸乙酯提取，0.1 mol·L-1酸溶液轉(zhuǎn)化溶劑，正己烷除脂肪，MCX 柱凈化，5%的氨水甲醇洗脫，氮吹至近干，操作簡單，定性、定量準確。

2.2 濃縮

濃縮時將乙酸乙酯全部蒸干，再加鹽酸溶液，少量多次轉(zhuǎn)移，磺胺類藥物回收率降低。乙酸乙酯蒸干后，脂類物質(zhì)粘壁，磺胺類藥物也粘壁，導致轉(zhuǎn)移不徹底，回收率降低。在提取液中加入鹽酸溶液，根據(jù)鹽酸溶液和乙酸乙酯的沸點不同，先將乙酸乙酯蒸去，大部分磺胺類藥物溶解在鹽酸相中，再用正己烷分2 次洗雞心瓶，可以把脂肪和少量粘在壁上的藥物轉(zhuǎn)移出來。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時控制水浴溫度40 ℃（水浴溫度過高，熱不穩(wěn)定的藥物會分解，回收率降低；水浴溫度過低，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時間較長，不利于大批量樣品的檢測），減壓干燥至收集瓶中無大量液滴滴下，所剩體積大約為4 mL。

2.3 除脂肪

使用正己烷脫脂時，渦旋時間不宜過長，渦旋力度也不宜過大，否則溶液會發(fā)生乳化現(xiàn)象。萃取中應防止乳化現(xiàn)象，以免乳狀液中溶解的磺胺類藥物不能回收，降低回收率，影響重復性。一旦發(fā)生乳化，需要消除乳化，常用的破乳方法有離心、加熱、超聲、冷凍和加鹽等，待乳化消失再過柱。

2.4 凈化

磺胺類藥物呈酸堿兩性，易溶于酸液和堿液中，故可使用離子交換SPE 柱作為凈化富集的手段。本方法用MCX 柱，MCX 小柱可以提供反相保留和離子交換兩種模式，適用于堿性化合物的陽離子交換和反相吸附。上樣步驟及溶液使用原因如下。

2.4.1 活化

加入甲醇浸潤柱子，并除去柱內(nèi)雜質(zhì)，鹽酸溶液可以創(chuàng)造一個樣品溶劑相容環(huán)境，為待測組分的上樣和淋洗做好準備。

2.4.2 上樣

根據(jù)離子化原理，上樣液的pH 值應低于待測組分pH 值，絕大部分的待測組才可解離為離子，所以選擇酸性較大的水溶液為上樣液。

2.4.3 淋洗

用鹽酸溶液淋洗，可以解除藥物與基質(zhì)蛋白的結(jié)合，使藥物繼續(xù)保持于柱體上，再用甲醇淋洗，去除較多的極性雜質(zhì)。

2.4.4 洗脫

洗脫液過少，洗脫不完全會導致回收率偏低；洗脫液過多，雜質(zhì)可能洗脫下來，干擾上機檢測，且洗脫液過多，氮吹較慢，不利于大批量樣品的檢測。本方法選擇6 mL 的洗脫液。

2.4.5 氮吹

氮吹不宜吹干，吹干后回收率降低、重現(xiàn)性變差，原因在于沒有溶液的保護，磺胺類藥物分解或被吹跑。氮吹至液面近干，回收率高、重現(xiàn)性好。

2.4.6 復溶

樣品濃縮后，復溶溶劑的選擇直接影響實驗結(jié)果。復溶不充分會導致回收率降低和重現(xiàn)性差。一般復溶液最好與流動相的初始比例相同，避免對檢測產(chǎn)生干擾。本方法初始流動相是5%的甲醇溶液，此溶液對磺胺類藥物的溶解性好，因此選擇5%甲醇溶液溶解殘渣。

2.5 標準曲線

配制標準濃度系列曲線，5 種磺胺類藥物用5%的甲醇溶液配制成10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的標準混合溶液，上機測試。以進樣濃度為橫坐標，以峰面積的響應值為縱坐標，繪制標準曲線，相關系數(shù)為0.999 3 ～0.999 9，線性關系良好，均大于0.999。以10 倍信噪比確定5 種磺胺類的定量限，5 種磺胺類的定量限均為1 μg·kg-1，說明該方法的靈敏度滿足藥物殘留分析的要求，標準曲線相關系數(shù)及定量限見表3。

表3 標準曲線相關系數(shù)表

2.6 回收率和精密度

在豬肉基質(zhì)中添加濃度為10 μg·kg-1、40 μg·kg-1、60 μg·kg-1和100 μg·kg-1的磺胺類混合標準溶液，測定回收率，每個添加水平測定3 次，回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）結(jié)果見表4。獸藥殘留檢測的方法一般要求回收率在60%～120%，相對標準偏差一般≤15%（RSD ≤15%）。5 種磺胺類藥物的回收率均在61%～87%，相對標準偏差在2.12%～4.96%，符合獸藥殘留檢測規(guī)范要求。

表4 添加回收率和相對標準偏差表

3 結(jié)論

本方法建立了豬肉中磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑和磺胺喹惡啉5 種常用的磺胺類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測方法。該方法具有良好的線性關系，定量限為1 μg·kg-1，在10 μg·kg-1、40 μg·kg-1、60 μg·kg-1和100 μg·kg-1的加標水平上，回收率為61%～87%，RSD 為2.12%～4.96%，準確、高效，適用于大批量樣品的定性和定量檢測，為豬肉中磺胺類藥物的檢測提供了有效的技術支撐。